Nghiên cứu phương pháp tạo đa chồi để nhân nhanh cây Ngưu tất (Achyranthes bidentata blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những công nghệ quan trọng của ngành Công nghệ sinh học hiện đại. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được thực hiện ở nước ta từ những năm 1

MỞ ĐẦUĐặt vấn đề

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những công nghệ quantrọng của ngành Công nghệ sinh học hiện đại Công nghệ nuôi cấy mô tếbào thực vật đã được thực hiện ở nước ta từ những năm 1960 tại miềnNam và đầu những năm 1970 tại miền Bắc Tuy nhiên chỉ những cuốinăm 1980 trở lại đây, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật mới pháttriển mạnh mẽ và được đưa vào ứng dụng Trong đó kĩ thuật nuôi cấy môtế bào thực vật là một trong những kĩ thuât chính Những thành công củakĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã chứng tỏ khả năng ứng dụng hiệu

quả trong nhiều lĩnh vực, trong đó có bảo tồn ex situ những nguồn gen

quý hiếm Kĩ thuật nuôi cấy mô cho phép chúng ta nhân nhanh một lượnglớn cây giống trong ống nghiệm mà chỉ cần số lượng mẫu ít (thậm chí chỉcần một chồi) Ngoài ra, kĩ thuật nhân nhanh trong ống nghiệm nhằm tạora một quần thể cây con có chất lượng đồng đều về mặt di truyền.

Hiện nay, cây Ngưu tất được trồng và mọc chủ yếu ở Sapa, TamĐảo, Hà Nội Do chúng được sử dụng khá phổ biến trong y học cổ truyềnvới nhu cầu ngày càng tăng như: làm giảm cholesterol trong máu, hạ huyếtáp, hỗ trợ điều trị ung thư, chữa trị các bệnh về khớp…

Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài :“Nghiên cứu phương pháp tạo đa chồi để nhân nhanh cây Ngưu tất

(Achyranthes bidentata blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào

thực vật” nhằm nhân giống và bảo tồn nguồn gen cây Ngưu tất trong

ống nghiệm.

Xác định giá thể thích hợp để đưa Ngưu tất ra ngoài tự nhiên.

PHẦN 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Giới thiệu chung về cây Ngưu tất

1.1.1 Đặc điểm sinh học

Tên việt nam: Cây Ngưu tất

Tên khoa học: Achyranthes bidentata Blume

Thuộc họ Giền (Amaranthaceae).

Đặc điểm hình thái:

Ngưu tất là cây thân thảo, sống lâu năm, cao 60-80 cm, rễ củ hình trụdài, có nhiều rễ phụ Thân phình lên ở những đốt, màu lục hoặc nâu tía.Cành mọc gần như thẳng đứng Lá mọc đối xứng hoặc hình mác Gốcthuôn hẹp, đầu nhọn dài từ 5-10 cm, rộng từ 1-4 cm, hai mặt nhẵn, gân lámặt trên thường có màu nâu tía, mép lá uốn lượn, cuống lá dài từ 1-1,5 cm.Cụm hoa là một bông dài từ 2-5 cm, mọc ở ngọn thân và kẽ lá đầu cành,hoa rất nhiều, thường gập xuống sít vào cuống của cụm hoa, sau khi đã nởlá bắc dài 3mm, 5 lá dài, 5 nhị, bầu hình trứng Hoa mọc hướng lên nhưngkhi biến thành quả sẽ mọc quặp xuống Quả nang, hình bầu dục, chỉ chứamột hạt [29] [30].

Cây thường mọc ở Trung Quốc và Đông Nam Á, trong đó có ViệtNam Cây Ngưu tất thích hợp gieo trồng ở điều kiện của nước ta và pháttriển tốt, được trồng nhiều ở vùng núi cao, trung du và đồng bằng nhất là ởĐồng Bằng Bắc Bộ: Hưng Yên; Hà Nội; các trung tâm nghiên cứu câytrồng và chế biến cây thuốc [29].

Ngưu tất ưa đất thịt pha cát, tơi xốp, nhiều mùn Đất phù sa cao ráo,thoát nước rất phù hợp với cây Ngưu tất [32].

Thành phần hóa học

Rễ chứa các Saponin, khi thủy phân cho các Sapogenin là axitoleanolic Rễ Ngưu tất có chứa axitd oleanolic 0,096%, saponin toàn phần4,04% và axit oleanolic α -L-rhamnopyranosyl - β - D- galactopyranosid.Rễ còn chứa ecdysteron và inokosteron Hàm lượng ecdysteron khoảng0,037% Ngoài ra còn có ecdysteron, inokosteron, glucose, galactose,rhamnoza, muối kali và một số thành phần khác như betain,polysaccharide, emodin, physcion [31].

1.1.2 Giá trị cây Ngưu tất

Giá trị y học

Ngưu tất vị đắng, chua, tính bình, quy vào hai kinh can, thận Tácdụng hoạt huyết, thông kinh, hoạt lạc, mạnh gân cốt, lợi niệu trừ sỏi, hạhuyết áp, giảm cholesterol trong máu, giải độc chống viêm [30].

- Chế phẩm Solamin trong thành phần có Ngưu tất và một số dượcliệu khác đã được áp dụng để điều trị thấp khớp với kết quả là có tác dụngchống viêm và giảm đau rõ rệt trên lâm sàng Kết quả tốt nhất và tương đốinhanh đối với đau lưng cấp do lạnh và sang chấn Ðối với viêm đa khớpdạng thấp, chưa có biến dạng về khớp và đối với chứng đau nhức đơn

thuần, tác dụng điều trị tương đối tốt Khi đã có biến dạng về xương, cơ,khớp, kết quả kém Thuốc không gây tác dụng phụ đáng kể

Công dụng

Ngưu tất dạng sống chữa cổ họng sưng đau, mụn nhọt, đái rát buốt,đái ra máu hoặc sỏi, bụng dưới kết hòn cục, đẻ khó hoặc khi đẻ rau thaikhông ra, sau khi đẻ ứ huyết gây đau bụng, chấn thương, ứ máu bầm, đầugối nhức mỏi Ngưu tất sao tẩm chữa can thận hư, ù tai, đau lưng, mỏi gối,tay chân co quắp hoặc bại liệt [30]

Giá trị kinh tế

Cây Ngưu tất là loại cây dễ trồng, phù hợp với điều kiện nước ta, chỉcần đất pha cát, tơi xốp, nhiều mùn, đất phù sa cao ráo, thoát nước là có thểphát triển tốt Nó không đòi hỏi tốn công chăm sóc, kỹ thuật canh tác caonhưng lại mang giá trị kinh tế cao cho người trồng

1.2 Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng

1.2.1 Lược sử phát triển

Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua hơn 100 năm pháttriển Ngày càng có nhiều ứng dụng và làm sáng tỏ lý thuyết về tính toànnăng của tế bào Có thể thấy sự phát triển của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bàothực vật luôn song song với lịch sử các ngành khoa học sự sống khác Cácgiai đoạn chính của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật [1] [3] [9] [15].- Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức là Schleiden và Schwann đãđề xướng học thuyết cơ bản của sinh học gọi là thuyết tế bào và nêu rõ:+ Mọi cơ thể sống đều cấu tạo từ một hoặc nhiều tế bào.

+ Tế bào là đơn vị cấu trúc chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình thứcnhỏ nhất của sự sống.

+ Tế bào chỉ được tạo ra từ tế bào trước đó.

- Người đầu tiên là Haberlandt (1898) đề xuất ra lý thuyết về tính toàn năngcủa tế bào, ông cũng là người đầu tiên đưa ra các giả thuyết của Schleidenvà Schwann vào thực nghiệm Ông đã đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tếbào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào.

Theo ông, mỗi tế bào bất kì của cơ thể sinh vật đều mang toàn bộlượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó Vì vậy,khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơthể hoàn chỉnh Haberlandt đã nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng chưathành công.

- Đến năm 1922, Robbins và Kotte đã thành công trong nuôi cấyđầu rễ cây hòa thảo kéo dài 12 ngày trong môi trường lỏng gồm có muốikhoáng, glucose.

- Năm 1934, White (Mỹ) đã nuôi cấy thành công trong một thời giandài đầu rễ cây cà chua với môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose vànước chiết nấm men Sau đó ít lâu White đã chứng minh là có thể thay thếnước chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1),Piridoxin (B6), axit nicotinic Cùng năm, Gautheret thành công trong việc

nuôi cấy mô tách từ mô tượng tầng của cây Salic apraea và cây Populusnigra Mô nuôi cấy đã phân chia liên tục trong môi trường Knop bổ sung

glucose và cysteinhyochloride.

- Went và Thimann (1937) đã phát hiện ra chất sinh trưởng thực vậtđầu tiên là axit β-indolaxetic (IAA) tác động lên quá trình phân chia tế bào vàhình thành rễ.

- Năm 1938 Gautheret đã thành công trong việc duy trì sự sinhtrưởng với thời gian vô hạn của mô sẹo cà rốt trên môi trường thạchbằng cách cấy chuyển đều đặn 6 tuần/lần.

- Năm 1941, Overbeck (Mỹ) chứng minh tác dụng kích thích sinhtrưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà Trong thời gian này,

nhiều chất kích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm Auxin đã đượcnghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công như: α-napthyl axetic axit(NAA), và 2,4 Dichlorophenoxy axetic axit (2,4-D) Nhiều tác giả đã nhậnthấy cùng với nước dừa, 2,4-D và NAA đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chiatế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy.

- Năm 1954, Skoog đã phát hiện ra Kinetin (6 furfuryl-amino-purin)là chất điều khiển quá trình phân bào và phân hóa chồi Sau này người tacũng tìm thấy Zeatin tách từ mầm ngô có hoạt tính tương tự Kinetin Cả 2chất này đều thuộc nhóm Cytokinin.

- Năm 1960, Bergman đã phát triển kĩ thuật nuôi cấy tế bào đơn lênmột bước mới là tạo được khối mô sẹo từ một tế bào đơn bằng kĩ thuật gieotrải tế bào thực vật trên đĩa thạch như trải tế bào vi sinh vật Cũng năm1960, Cooking đã dùng men cellulase để phân hủy cellulose của tế bàothực vật và thu được các tế bào trần (protoplast).

- Guha và Maheswari (1964) công bố tạo thành công cây đơn bội từnuôi cấy túi phấn cây cà độc dược.

- Bourgin và Nitsch (1967), Nakata (1968) tạo thành công cấy đơnbội từ bao phấn thuốc lá, mở ra nhiều triển vọng ứng dụng tạo cây đơn bộivào công tác giống và nghiên cưu di truyền.

- Đến năm 1971, Takebe tái sinh được cây thuốc lá hoàn chỉnh từprotoplast thuốc lá giống Xanthi.

- Melchers (1977) lai soma thành công cây cà chua và cây khoai tây.- Năm 1985 cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên được công bố.- Năm 1994 là năm đánh dấu cây cà chua đầu tiên (cà chuaFlav’rSav’r) có mặt trên thị trường thực phẩm Hoa Kì Cùng năm 1994giống củ cải đường mang gen kháng bệnh virus biến nạp được đưa vào sảnxuất đại trà tại Na Uy.

Đến nay đã có hàng trăm loài cây được nuôi cấy mô thành công với

nhiều mục đích khác nhau như nhân nhanh, bảo tồn in vitro, nuôi cấy bao

phấn… Đặc biệt, nhờ kĩ thuật nuôi cấy mô và chuyển gen thông qua giaiđoạn mô sẹo và tái sinh tạo chồi mà nhiều giống cây trồng chuyển gen đãđược tạo ra (cà chua, lúa, đậu tương, khoai tây, bông, đu đủ…) [15]

1.2.2 Cơ sở khoa học của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đólà tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902 Theoquan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tếbào riêng rẽ đó phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiếtvà đủ của cơ thể sinh vật Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều cóthể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh.

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật làkết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào Như vậy, kĩ thuậtnuôi cấy mô và tế bào thực vật là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình tháicủa tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vôtrùng) một cách định hướng Đây là một điểm rất quan trọng bởi vì trên cơsở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện những kĩ thuật tiên tiếncho việc lựa chọn, cải thiện và lai tạo giống cây trồng [1] [13].

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro

Mẫu nuôi cấy

Muashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của việc lựa chọn mẫu cấythích hợp, điều quan trọng cho thấy một số nhân tố khi chọn lọc mẫu baogồm: kiểu gen, cơ quan được chọn, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinhtrưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu.

+ Kiểu gen: Kiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy Vớiloài thuốc lá được sử dụng như cây kiểu mẫu, Cheng và Smith (1973) ghinhận sự khác nhau giữa các genom qua nuôi cấy sinh trưởng mô lồi Hơn

nữa, Jaramillo và Summers (1990) ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đếnsố lượng và đường kính mô sẹo qua nuôi cấy hạt phấn cây cà chua.

+ Cơ quan: Muashige (1974) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và

mô đều có khả năng sử dụng để nuôi cấy invitro Mẫu nuôi cấy in vitro

khác nhau ở các loài khác nhau, như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy.Theo Doerschung và Miller (1976) cho rằng: chồi mầm thích hợp làm mẫunuôi cấy ở các cây nảy mầm từ hạt.

+ Tuổi và sinh lý: Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trongnăm của mẫu nuôi cấy cho thấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hóa vàtuổi của sinh lý Có nhiều nghiên cứu khác nhau về ảnh hưởng của tuổi sinh lýmẫu nuôi cấy Pierik (1970) ghi nhận rễ phát sinh trên lá non và không phátsinh trên lá già.

+ Mẫu in vitro: Trong những năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứucho thấy mẫu in vitro có khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên

đồng ruộng hay trong vườn ươm như cây Azalea.

+ Sức sống của mẫu: Điều cần nhận thấy rằng mẫu cây mẹ có ảnh

hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in vitro, cần phải cẩn thận chọn mẫu

nuôi cấy nhất là đối với những cây bị bệnh,nếu nuôi cấy cây bị bệnh thì sẽcó một số lượng lớn mẫu cây bị bệnh được nhân lên [13].

Điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là từ 20-27oC TheoMurashige (1974) nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sự sinh trưởng và phát

triển trong quá trình nuôi cấy in vitro qua những tiến trình sinh lý như hô

hấp hay hình thành tế bào cơ quan.

Cường độ ánh sáng: Cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng

trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy in vitro cây lá xanh.

Ảnh hưởng của ánh sáng có liên hệ đến các loài, có loài chịu ánh sáng cao,

có loài chịu ánh sáng thấp hay tối, có loài chịu ánh sáng trung bình Việc

nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện ánh sáng từ 1000-3000lux [12].

Môi trường nuôi cấy

Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy mô tế bào làrất cần thiết Vì mỗi loại cây trồng khác nhau đều cần một hàm lượng chấtdinh dưỡng khác nhau Mặt khác môi trường cũng thay đổi tùy thuộc vàosự phân hóa cua mô cấy, tùy theo trường hợp duy trì mô ở trạng thái môsẹo, tạo rễ, tạo chồi hay tái sinh cây hoàn chỉnh Việc lựa chọn môi trườngcần dựa vào tài liệu đã cho cùng đối tượng nuôi cấy hoặc thăm dò một sốmôi trường đã cho để xác định môi trường cho mẫu nuôi cấy.

Chất kích thích sinh trưởng thực vật (KTSTTV)

Các chất kích thích sinh trưởng có vai trò rất quan trọng trong kĩthuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Bằng cách cung cấp các chất kích thíchở một mức hợp lý thì chúng ta có thể điều khiển được quá trình phát sinhhình thái của mẫu nuôi cấy Auxin và Cytokinin là hai nhóm chất kích thíchsinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất hiện nay

Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thườngxuyên trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với cácthành phần khác trong môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởngcủa mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt làkhi nó được phối hợp sử dụng với nhóm Cytokinin Sự áp dụng loại vànồng độ Auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:

+ Kiểu tăng trưởng và phát triển của mẫu cần nghiên cứu.+ Hàm lượng Auxin nội sinh có trong mẫu nuôi cấy.

+ Sự tác động qua lại giữa Auxin nội sinh và Auxin ngoại sinh.

Đặc tính của Auxin

Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào Đặcđiểm chung của các Auxin là kích thích sự phân chia tế bào Các hoocmon

của nhóm này có các hoạt tính như tăng trưởng chiều dài thân, gióng, tínhhướng đất, tính ưu thế ngọn và phân hóa mạch dẫn.

Auxin cũng kích thích sự hình thành rễ bất định và sự giãn của tế bàolàm cho kích thước tế bào tăng lên Các Auxin thường liên quan đến độ dàicủa thân, đốt, chồi chính, rễ… Đối với nuôi cấy mô tế bào thực vật, Auxinđược sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hóa rễ.

Những Auxin được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy ô tế bào thực vật:

+ IBA (3-indol Butyric Axit)+ IAA (Indol-3-Axetic Axit)+ NAA (α-Naptalen Axetic Axit)

+ 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxy Axetic Axit)

Đặc tính của Cytokinin

Cytokinin là hoocmon phân bào, là dẫn xuất của Ađênin, có ảnhhưởng đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồitrong nuôi cấy mô tế bào thực vật Các Cytokinin được sử dụng thườngxuyên nhất là:

+ BAP (6-Benzyl Amino Purin)

+ Kinetin (N-(2-Furfurylamin)-1-H-6- Amin)+ Zeatin

Hàm lượng của các loại Cytokinin có tác dụng kích thích từ rễ đếnsự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh mẽ sự tạo thành rễ củachồi nuôi cấy Trong các loại Cytokinin nói trên thì BAP và Kinetin là hailoại hay được sử dụng nhiều nhất.

Ngoài hai nhóm Auxin và Cytokinin, trong nuôi cấy mô tế bào thựcvật người ta cũng sử dụng thêm Gibberellin để kích thích sự kéo dài tế bào,qua đó làm tăng kích thước của chồi nuôi cấy GA (Gibberellic axit) là loạiGibberellin được sử dụng thường xuyên nhất Tuy nhiên, GA vẫn mẫn cảm

với nhiệt độ, nó mất hoạt tính đến 90% sau khi hấp vô trùng Vì vậy, muốnsử dụng GA ta thường phải lọc qua màng lọc vô trùng, sau đó đưa vào môitrường nuôi cấy [16].

1.2.4 Các phương pháp nhân giống in vitro

Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kĩ thuật nhân

giống vô tính cổ điển như giâm cành,chiết cành, ghép cành, tách dòng…

Nhân giống in vitro hay vi nhân giống trong ống nghiệm là một trong bốn

lĩnh vực ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật (làm sạch virus,nhân nhanh các giống cây quý, sản xuất và chuyển hóa sinh học các hợpchất tự nhiên và cải biến về mặt di truyền các giống cây trồng) và đã manglại hiệu quả kinh tế lớn nhất [1].

Có ba phương thức để tạo cây in vitro:

a Hoạt hóa chồi nách

Hoạt hóa chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tượng ưu thế ngọn khinuôi cấy các đỉnh chồi hoặc đoạn thân mang mắt ngủ Theo phương phápnày thì sự hoạt hóa của chồi nách diễn ra theo hai cách:

- Cách 1: Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra khinuôi cấy loài cây hai lá mầm như khoai tây, hoa cúc, cây thuốc lá,… )- Cách 2: Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra với cây mộtlá mầm như lúa, mía…).

c Tạo phôi vô tính

Trong quá trình nuôi cấy in vitro, phôi có thể hình hành từ các tế bào

soma gọi là phôi vô tính Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoànchỉnh hoặc có thể sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân tạo.Tương tự như tạo chồi bất định, để tạo phôi vô tính cũng cần thực hiện haiquá trình phản phân hóa và quá trình phân hóa để tách các tế bào soma hìnhthành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển của môsẹo Sự hình thành phôi trải qua hai bước chính:

Bước 1: Sự phân hóa các tế bào có khả năng phát sinh phôi Trong

quá trình này cần môi trường giàu Auxin, vì Auxin giúp cho việc cảm ứngđể tạo các tế bào phôi, đồng thời nó còn giúp kích thích cho quá trình pháttriển số lượng tế bào thông qua việc liên tiếp phân chia tế bào Các tế bàocó khả năng phát sinh phôi là các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân,không có không bào, tế bào chất đậm đặc, giàu protein và ARN thông tin

Bước 2: Sự phát triển của phôi mới hình thành Môi trường nuôi cấy

của giai đoạn này phải nghèo hoặc không có Auxin, với nồng độ Auxin caothích kích thích sự tạo thành phôi nhưng ức chế quá trình phân hóa và quátrình phát triển tiếp theo của phôi này Như vậy, với nồng độ chất điều tiếtsinh trưởng hợp lý là rất quan trọng để có các phản hồi thích hợp Nếunồng độ thấp có thể gây sốc cho phản ứng, nếu nồng độ cao quá sẽ gây ứcchế hoặc gây độc [12].

Các bước chính trong nhân giống in vitro

Theo George (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm

các bước sau:

Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây

mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) Các cây này cần phải sạch bệnh, đặcbiệt là bệnh virus và đang ở giai đoạn sinh trưởng và phát triển mạnh mẽ.

Việc trồng các cây mệ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độchăm sóc và phòng bệnh hợp lý sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng khả

năng sống và sinh trưởng khi tra đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro.

Bước 2: Nuôi cấy khởi động

Là giai đoạn khử trùng mẫu, giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầunhư tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tăng tỷ lệ mẫu tái sinh, mô tồn tại, sinh trưởngvà phát triển tốt Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn pháttriển tốt của cây Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách, đỉnhchồi hoa và sau đó là đoạn thân, mảnh lá.

Bước 3: Nhân nhanh

Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăngnhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo phôi vôtính, tạo chồi bất định… Vấn đề là cần xác định được môi trường và điềukiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất Theo nguyên tắc chung,môi trường có nhiều Cytokinin sẽ kích thích tạo chồi (Auxin/Cytokinin < 1:thì kích thích tạo chồi) Chế độ nuôi cấy thường là 25-27oC và 16h chiếusáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-3000lux Tuy nhiên đối với mỗi loạiđối tượng nuôi cấy khác nhau đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau.

Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Để tạo rễ cho chồi người ta cấy chuyển sang môi trường tạo rễ Môitrường tạo rễ thường được bổ sung thêm một lượng nhỏ Auxin Một số loạicây có thể phát sinh rễ ngay cả khi ta không bổ sung Auxin.

Bước 5: Đưa cây ra ngoài vườn ươm

Để đưa được cây ra bên ngoài vườn ươm phát triển tốt ta cần phảiđảm bảo một số yêu cầu sau:

- Cây đảm bảo về chiều cao, số rễ, số lá.- Giá thể phải tơi xốp, sạch sẽ, thoát nước tốt.

- Phải điều chỉnh độ ẩm, chế độ chiếu sáng vườn ươm, cũng như chế độdinh dưỡng thích hợp.

1.2.5 Phương pháp nhân đa chồi

Trong phương pháp nhân đa chồi, chồi ngọn và các chồi bên từ cácnách lá cấy vào môi truờng có chứa Cytokinin với nồng độ cao Vai trò củaCytokinin lúc này là ức chế quá trình ưu thế ngọn để cho các chồi bên cóthể phát triển Các chồi bên này tiếp tục được chuyển sang môi trường mớicó bổ sung Cytokinin để tiếp tục tạo ra các chồi khác Sau đó các chồi nàyđược chuyển sang môi trường ra rễ và đưa ra ngoài vườn ươm khi đã có rễhoàn chỉnh.

Phương pháp có ý nghĩa quan trọng trong thực tế vì:

- Phương pháp này đơn giản hơn so với các phương pháp khác.- Tốc độ nhân giống cao.

- Các cây đồng đều về mặt di truyền.- Cây con tăng trưởng rất tốt.

Những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành đa chồi:- Hàm lượng Cytokinin (loại và nồng độ).

- Nhu cầu về nồng độ Cytokinin thay đổi theo từng giai đoạn nuôicấy, những mô cấy còn non thì cần ít Cytokinin hơn các mẫu đã trưởngthành.

- Thông thường trong quá trình tạo chồi, người ta sử dụng Auxinvới nồng độ thấp phối hợp cùng Cytokinin ở nồng độ cao, tỷ lệAuxin/Cytokinin thường 1/10

- Đôi khi nên để chồi ngọn phát triển trước khi tăng nồng độCytokinin để cảm ứng sự tạo chồi bên

- Trong trường hợp chồi bên không tăng trưởng được thì cần phải cắtbỏ ngọn của chồi để các chồi bên phát triển.

- Không nên cảm ứng sự tạo thành mô sẹo với nồng độ Cytokininquá cao vì có thể tạo ra chồi bất định mang các đột biến.

- Trong một số trường hợp có thể kích thích sự tạo thành chồi bênbằng cách cấy vào môi trường lỏng Môi trường lỏng này cần lắc haykhông lắc tùy thuộc vào cây được làm thí nghiệm.

- Khi cấy chuyển nhiều lần tốc độ sinh trưởng sinh khối bị thay đổi.Hiện nay nhân nhanh bằng phương pháp nhân chồi bên được ápdụng cho nhiều loài thực vật, quy trình nhân chồi thường được thực hiệntheo các bước như sau [5].

Sơ đồ tổng quát nhân nhanh trong phòng thí nghiệm

1.2.6 Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm một loạt các kỹ thuật khácnhau và có khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực bao gồm [12].

(Bầu quả, noãn)

- Thụ phấn trong ống nghiệm phục vụ lai xa.- Tạo cây đơn bội.

Trồng cây ngoài tự nhiên

Trồng cây trong bầu

Tạo cây in vitro hoàn chỉnhNhân đa chồiKhử trùng mẫu

Cây tự nhiên

- Tạo đa phôi.Hoa đực

(Bao phấn và hạt phấn)

- Tạo mô sẹo và cây đơn bội.- Tạo đột biến ở mức đơn bội.- Tạo dòng đồng hợp tử.

Phôi hợp tử - Nuôi cấy cứu phôi khi lai xa.- Nhân các dòng lai xa.

- Phá sự ngủ, nghỉ của hạt.Mô sẹo - Tạo phôi vô tính.

- Nuôi cấy tế bào đơn và tách tế bào trần.- Tạo cây có biến dị soma.

Tế bào - Tạo đột biến ỏe mức độ tế bào.- Tạo tế bào trần để lai vô tính.- Biến nạp gen.

- Nuôi cấy tế bào đơn.Đỉnh chồi

+ Sản xuất hạt nhân tạo

- Cung cấp vật liệu để tạo các protoplast có khảnăng tạo phôi.

- Cho phép cơ khí hóa quá trình nuôi cấy và sửdụng bioreactor.

Đột biến soma - Phân lập các biến dị có ích ở kiểu hình lýtưởng song cũng thiếu một số tính trạng mongmuốn.

- Phân lập các biến dị có ích để sản xuất các hợpchất sơ cấp và thứ cấp.

- Phân lập các biến dị có ích với khả năng khángbệnh, chống chịu ngoại cảnh tốt hơn.

- Tạo các biến dị di truyền không qua lai hữutính ở những dòng ưu tú.

1.3 Thành tựu và các phương pháp bảo tồn nguồn gen thực vật invitro

1.3.1 Thành tựu

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trở thành một trong nhữngphương thức quan trọng để nhân nhanh, đặc biệt là đối với những cây khónhân nhanh bằng phương pháp truyền thống Đã có nhiều nghiên cứu vàứng dụng thành công trong việc nhân nhanh và bảo tồn nguồn gen thực vật.

Trong nước:

Tác giả Nguyễn Thanh Danh và cs (2005) đã nghiên cứu thành công

nhân nhanh in vitro cây Vù hương (Cinamomum balansae Lecomte) ở

VQG Cúc Phương, nghiên cứu này đã sử dụng phôi hạt xanh của quả Vùhương để nuôi cấy và tạo đa chồi bằng kỹ thuật tách phôi hạt xanh, các câycó nguồn gốc từ nuôi cấy mô đã được trồng trở lại rừng tự nhiên và cây conphát triển bình thường Cây Vù hương có tên trong danh sách các loài bị đedọa ở Việt Nam [2].

Tác giả Hoàng Thị Nga (2011), nghiên cứu xây dựng thành côngquy trình nhân nhanh cây hoa Đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tếbào thực vật [8].

Những nghiên cứu của Trần Văn Minh và cs cũng đã thành côngtrong việc nhân giống và bảo tồn nhiều loài cây quý hiếm như: Cây Trầm

hương, cây Giá tỵ (Tectona grandis Linn F) và cây Lát hoa Côn Đảo(Chukrasia tabularis A Juss) Thành công trong việc nhân giống in vitro

cây Trầm hương có ý nghĩa hết sức to lớn, nó cho phép phục hồi, phát triểncho những khu vực trồng Trầm hương thuận lợi Hơn thế nữa, việc sử dụngcây giống có nguồn gốc từ nuôi cấy mô có chất lượng cao sẽ giúp chongười trồng rừng Trầm hương tốt và đồng nhất về kiểu gen [6] [7].

Tác giả Nguyễn Thị Quỳnh và cs (2003) đã nuôi cấy cây Lõi thọ

(Gmelina arborea Roxb) bằng phương pháp quang tự dưỡng Đặc diểm

chính của phương pháp này là không sử dụng đường, vitamin và hạn chế sửdụng các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong môi trường nhân giống.Đồng thời tạo điều kiện tối đa cho cây trong bình nuôi cấy sử dụng khí CO2

có sẵn trong không khí làm nguồn cacbon chính cho quá trình tăng trưởngvà phát triển của cây Cây Lõi thọ đã phát triển rất tốt trong điều kiệnquang tự dưỡng [10].

Viện nghiên cứu và bảo tồn nguồn gen ở VQG Bạch Mã đã nghiên cứuthành công và bảo tồn một số loài quý hiếm có nguy cơ tuyệt chủng như:

- Hoàng Đàn giả (Dacrydyum elatum (Roxb) Wallich ex Hooker) là đối

tượng quý hiếm có trong sách đỏ Việt Nam, phân bố trên các đỉnh núi cao ởVQG Bạch Mã.

- Cây Hồi hoa nhỏ (Illicium parvifolium Merr) là loài thực vật quý

hiếm có trong sách đỏ Việt Nam, thuộc dạng nguy cấp Đây là loài có giátrị trong sản xuất tinh dầu hồi, đã có chương trình khoanh vùng bảo vệnghiêm ngặt những khu vực có sự phân bố của cây này theo hướng bảo tồn

in situ ở VQG Bạch Mã [4].

- Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L) được sử dụng như

là một vị thuốc trong việc phòng và chữa trị một số loại ung thư Cây Trinhnữ hoàng cung có củ giống củ hành, chùm hoa giống chùm hoa cây lángtrắng, thường được trồng làm cảnh hoặc làm thuốc Trong lĩnh vực làmthuốc, người ta dùng lá cây Trinh nữ hoàng cung thái nhỏ rồi sao vàng sắcuống để đề phòng và chữa trị ung thư tử cung, u tiền liệt tuyến Tác giả LưuTrường Sinh và cs đã nhân giống thành công cây Trinh nữ hoàng cung theo

phương pháp in vitro có chất lượng tương đương với cây trồng theo

xanh của cây Hoàng liên gai ở vùng núi Sapa, tách lấy phôi và đưa vàonuôi cấy đẻ tạo mô sẹo và thu sinh khối Sau một thời gian ngắn, sinh khốithu được từ rễ cây Hoàng liên gai tăng gấp 10 lần so với số lượng mẫu banđầu Đặc biệt khối mô tế bào này chứa berberin có chất lượng tương đươngvới rễ cây Hoàng liên gai trong tự nhiên Vì vậy các kết quả nghiên cứuthành công này của Viện Công nghệ sinh học (Viện khoa học và công nghệViệt Nam) không chỉ giúp các cơ quan sản xuất chủ động nguồn dược liệumà còn góp phần bảo tồn nguồn gen cây thuốc quý của nước ta [1] [2].

Thế giới:

- Tác giả Pereira AM và cs (2003) đã nhân và bảo tồn cây thuốc

Anemopaegma arvense, nghiên cứu này đã nuôi cấy để bảo tồn cây A.arvense trong ống nghiệm trên môi trường MS có chứa 4% đường sorbitol,

kết quả cho thấy sau 6 tháng mới cần phải cấy chuyển một lần [28].

- Các nhà khoa học Đức đã ứng dụng thành công công nghệ nuôicấy mô tế bào thực vật trong việc phục tráng và nhân giống một số loàithuộc chi Grevillea, trong đó có một số loài gần như là tuyệt chủng:

Grevillea scapgera, Grevillea banksii, Grevillea batrachioides [26].

- Tác giả Joshi và cs đã nhân giống thành công giống cây

Saussurea obvallata, một loại dược thảo quý hiếm bằng việc áp dụng

công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Sau thời gian 15 ngày nuôi cấyvà 12 ngày thích nghi với điều kiện môi trường bên ngoài có 66,7% câyđã thích nghi với môi trường tự nhiên [22].

- Các nhà khoa học Ấn Độ đã xây dựng thành công quy trình tái

sinh một số giống tre quý như: Dendrocalamus asper (tre Mạnh tông),Bambusa multiplex (cây Hóp) thông qua nuôi cấy hạt hoặc chồi bên [27].- Năm 2003, Bedir E và cs đã nhân giống in vitro thành công giốngHydrastis canadensis, một loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng ở miền Bắc

nước Mỹ [18].

- Gần đây các tác giả Balaraju và cs (2008) cũng đã nhân giống và tái

sinh in vitro thành công cây thuốc Vitex agnuscastus bằng kỹ thuật nuôi cấy

mô tế bào thực vật từ mô phân sinh đỉnh trên môi trường 1/2 MS có bổ sung0,1mg/l IBA [17].

- Các tác giả Nishritha B và cs (2008) đã nhân giống in vitro thànhcông loài Asparagus racemosus Willd, đem lại nhiều giá trị kinh tế lớn Cùngnăm đó Mukherjee và cs cũng đã nhân giống in vitro loài Aloe vera sp [26].

- Bên cạnh đó tác giả Park SU và cs (2009) cũng đã tái sinh thành

công loài Rehmannia glutinosa L quý hiếm đang bị khai thác quá mức [27].

- Ngoài ra vẫn còn nhiều loại cây dược liệu quý hiếm khác cũng đã

được nhân nhanh và bảo tồn nguồn gen trong ống nghiệm như: Lawsoniainermis Linn, Saussurea lappa… [19]

1.3.2 Phương pháp bảo tồn thực vật quý hiếm

Hai phương pháp bảo tồn cơ bản được áp dụng là: in situ và ex situ.

Bảo tồn in situ

Đây là biện pháp bảo tồn huữ hiệu nhất, đặc biệt với những loài câybản địa có sự phân bố tập chung và có khả năng tái sinh tự nhiên Bảo tồn

in situ được đề xuất cho hầu hết các loại cây rừng nhiệt đới ở nước ta, bởi

vì các loài cây này thường là khó tạo thành rừng khi trồng đơn loài hoặckhó tái sinh ngoài môi trường sống tự nhiên [25].

Bảo tồn in situ còn bao hàm các quần thể tái sinh nhân tạo bằng

nguồn hạt giống thu hái tại chỗ từ nhiều cây mẹ mà không áp dụng có địnhhướng Điều này có ý nghĩa lớn đối với việc xây dựng rừng giống cho cácloài cây có phân bố rải rác Như vậy, quần thể bảo tồn được dùng làmnguồn cung cấp vật liệu giống cho tái sinh nhân tạo, cho trồng rừng, làmgiàu rừng và cải thiện di truyền.

Hầu hết các loài cây bản địa đều cần được ưu tiên bảo vệ theo hình

thức bảo tồn in situ, song có hai vấn đề được quan tâm:

- Có quy hoạch cụ thể và xác định các vùng cần bảo vệ cho các loài sao chocác cá thể vẫn giữ được toàn bộ biến dị di truyền của loài.

- Kết hợp bảo tào với việc thu hái hạt giống phục vụ tái sinh tự nhiên, tái

sinh nhân tạo, xây dựng quần thể bảo tồn mới (in situ và ex situ), xây dựng

giống và phục vụ trồng rừng [1].

Bảo tồn ex situ

Bảo tồn ex situ được thực hiện bằng cách tách rời cây hoặc vật liệu

nhân giống ra khỏi vùng phân bố tự nhiên để đưa vào các bộ sưu tập câysống (Vườn thực vật), rừng trồng với mục đích bảo tồn (quần thể bảo tồn

ex situ, ngân hàng hạt giống, phấn hoa hay nuôi cấy mô).Ba nhiệm vụ chính của bảo tồn ex situ là:

- Thu thập các mẫu gen tiêu biểu

- Duy trì chúng ở điều kiện tốt trong thời gian dài- Làm tăng số lượng mẫu thu thập

Bảo tồn ex situ được áp dụng cho các loài cây trồng chủ yếu, các

loài cây đó đã biết rõ giá trị của chúng hoặc khi các quần thể tự nhiênkhông được bảo vệ an toàn do tác động của sâu bệnh, lửa rừng và sự pháhoại của động vật hoặc con người hoặc do bị tạp giao với các quần thểngoại lai khác [19] [21].

Hóa chất: Môi trường cơ bản MS sử dụng trong nghiên cứu gồm cácmuối đa lượng, muối vi lượng, các chất hữu cơ và vitamin theo Murashigevà Skoog (1962) [24], đường saccharose, agar, các chất kích thích sinhtrưởng như BAP, IAA, NAA, Kinetin, IBA,…

Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 25-27oC, chế độ chiếu sáng 12/12hvới cường độ chiếu sáng là 2000lux.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu: Phòng Công nghệ tế bào thực vậtvà Trại Thực nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa họcvà Công nghệ Việt Nam

Đề tài nghiên cứu này được thực hiện từ 5/2010 - 5/2011, theo đơnđặt hàng của Trung tâm nuôi cấy mô thực vật Thanh Hóa, Sở Khoa học vàCông nghệ Thanh Hóa.

2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Các nhân tố là chỉ tiêu nghiên cứu được chia thành các công thức thínghiệm khác nhau, có công thức đối chứng;

- Số mẫu của mỗi công thức đủ lớn;- Thí ngiệm được lập lại ít nhất ba lần;

2.2.2 Nhân nhanh bằng phương pháp nhân đa chồi

Môi trường được sử dụng trong các thí nghiệm này là: MS + 20g/lđường saccharose + 8,5g/l agar và bổ sung thêm các chất kích thích sinhtrưởng với các nồng độ khác nhau và có nồng độ pH là 5,8 Tất cả các thínghiệm được tiến hành ở điều kiện: Nhiệt độ 25-27oC, thời gian chiếu sáng12/12h, cường độ chiếu sáng 2000lux.

Nhân đa chồi cây Ngưu tất

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo chồi

CT môi trường Nồng độ BAP (mg/l)

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng nồng độ Kinetin đến khả năng tạo chồi cây

CT Môi trường Kinetin (mg/l) NAA (mg/l)

2.2.3 Tạo cây Ngưu tất in vitro hoàn chỉnh

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá, rễ để cóthể chuyển ra trồng ngoài tự nhiên Cây con đưa ra ngoài tự nhiên phảikhỏe mạnh, sức đề kháng tốt nhằm nâng cao sức sống của cây khi ra môitrường bên ngoài Các chất kích thích sinh trưởng tạo chồi được thay thếbởi các chất kích thích tạo rễ như: IBA, NAA…

Môi trường được sử dụng trong các thí nghiệm này là: MS + 20g/lđường saccharose + 8,5g/l agar và bổ sung thêm các chất kích thích sinhtrưởng với các nồng độ khác nhau và có nồng độ pH là 5,8 Tất cả các thínghiệm được tiến hành ở điều kiện: Nhiệt độ 25-27oC, thời gian chiếu sáng12/12h, cường độ chiếu sáng 2000lux.

Thí ngiệm 5: Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ cây Ngưu tất

CT môi trường Nồng độ NAA (mg/l)

Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả năng tạo rễ cây Ngưu tất

CT môi trường Nồng độ IBA (mg/l)