Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật để nhân nhanh và bảo tồn cây Mắt trâu của Vườn Quốc gia Cúc Phương

Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật để nhân nhanh và bảo tồn cây Mắt trâu của Vườn Quốc gia Cúc Phương

PHẦN IMỞ ĐẦULí do chọn đề tài

Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong nhữngkỹ thuật rất quan trọng của công nghệ sinh học thực vật Những thành tựumà nuôi cấy mô tế bào thực vật đạt được đã chứng tỏ khả năng ứng dụnghiệu quả trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là nhân nhanh và bảo tồn các loàithực vật quí hiếm [1]

Đặc trưng của rừng nhiệt đới là sự đa dạng về loài, song thường làcác loài hiếm do kích thước quần thể nhỏ, mật độ thấp, nhiều loài bị suygiảm mạnh do tàn phá rừng Hiểu biết của con người về mối tương tác vàsự phụ thuộc lẫn nhau giữa các loài trong hệ sinh thái còn ít Do vậy nhữngnghiên cứu để bảo tồn đa dạng sinh học cần phải tiến hành đồng thời vớiviệc bảo tồn hiệu quả giữa các loài và hệ sinh thái Bảo tồn nguồn gen thựcvật là việc cấp thiết và thường xuyên nhằm bảo vệ đa dạng sinh học ở nướcta [12], [13].

Trong kho tàng cây thuốc Việt Nam có rất nhiều cây thuốc quí, trong

số đó cây Mắt trâu (Micromelum hisutum Oliv ) là một trong những loài

thực vật trong danh mục cần được bảo tồn của Vườn Quốc gia Cúc Phương[11], [14] Ngoài công dụng chữa một số bệnh thông thường như trị ghẻ,sâu đốt, ngộ độc thức ăn hay bệnh vàng da thì cây Mắt trâu còn phục vụcho công tác nghiên cứu tìm ra hoạt chất phòng và chống bệnh [9], [41],[42] Theo Ma và cộng sự thì trong dịch chiết vỏ thân cây Mắt trâu phântích được micromeline, 5 hợp chất alkaloids mới có khả năng kháng chủngvi khuẩn H37Rv gây bệnh lao [32] Bên cạnh đó, cây Mắt trâu còn có giátrị về mặt bảo tồn quần thể thực vật Vườn Quốc gia Cúc Phương.

Tuy nhiên, chưa có những nghiên cứu sâu về tác dụng chữa bệnh củacây Mắt trâu Vì vậy, cần có những nghiên cứu đầy đủ hơn về ứng dụngcũng như nhân giống và bảo tồn loài cây này

Với những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài: Ứng dụng kỹ thuậtnuôi cấy mô và tế bào thực vật để nhân nhanh và bảo tồn cây Mắt trâu củaVườn Quốc gia Cúc Phương

Mục đích, nội dung nghiên cứu

Mục đích

Xây dựng qui trình hoàn chỉnh để nhân nhanh và bảo tồn in vitro câyMắt trâu (Micromelum hisutum Oliv.) của Vườn Quốc gia Cúc Phương.

Nội dung

Khử trùng được mẫu sạch để nuôi cấy in vitro.

Xác định công thức môi trường thích hợp tạo đa chồi in vitro.

Xác định công thức môi trường thích hợp tạo cây in vitro hoàn

Xác định giá thể thích hợp cho cây in vitro nuôi trồng ngoài tự nhiên.

PHẦN II

TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Giới thiệu chung về cây Mắt trâu

Cây Mắt trâu có tên khoa học là Micromelum hissutum Oliv.

Thuộc bộ: Rutales (Cam)Họ: Rutaceae (Cam)

Đặc điểm sinh học, sinh thái

Mắt trâu là cây gỗ nhỏ có thể cao đến 6m Thân ít phân cành, cànhcó nhiều lông nhung, màu hung, lá màu xanh sẫm, kép lông chim lẻ, lá chéttừ 5 - 9, mọc so le, thuôn mũi mác hay mũi mác, dài 1,7 - 13cm, rộng 1 -5cm, không cân ở góc và mũi nhọn sắc, đài dài, hơi có răng, có lông nhungở mặt dưới Hoa trắng, hay vàng xanh, thành cụm hoa phủ lông nhung,ngắn hơn lá, cánh hoa có lông cứng Quả nạc dạng bầu dục, màu đỏ, camhay hung và có mùi thơm Mùa hoa tháng 1 - 4, mùa quả chín tháng 4 - 5[2], [6], [34].

Cây Mắt trâu phân bố ở một số khu vực như Ninh Bình, Nha Trang,Hòa Bình, Thanh Hóa Loài cây này cũng được tìm thấy ở Ấn Độ,Malayxia, Lào, Campuchia, Thái Lan [8], [39].

Lá cây Mắt trâu dùng trị bệnh ghẻ, nấu xông chữa bệnh vàng dahay ngộ độc thức ăn Sử dụng lá giã ra cùng với lá me sau đó thêm ítmuối dùng đắp vào da làm dịu đau khi bị sâu đốt Theo nghiên cứu củacác tác giả Ma và Cộng sự (2005) trong dịch chiết của vỏ cây Mắt trâu

(Micromelum hissutum Oliv.) chứa chất có khả năng kháng chủng vi

khuẩn gây bệnh lao H37Rv Các thí nghiệm đang trong giai đoạn thửnghiệm trên chuột [32], [42].

Cây Mắt trâu nằm trong danh sách các loài thực vật cần được bảo tồncủa VQG Cúc Phương Vì vậy, mà ngoài giá trị về làm thuốc hay dùngtrong nghiên cứu thì loài cây này còn đóng góp vốn gen của mình vào trongquần thể thực vật VQG Cúc Phương, hiện đang được lưu giữ và bảo tồnnguồn gen trong các phòng thí nghiệm [39], [41].

Trên thế giới, nhờ ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực

vật đã bảo tồn thành công nhiều cây thuốc như Centella aistica,Rehmannia glutinosa [22], [38] Năm 2009 Geetha và cộng sự đã thôngqua phương pháp vi nhân giống hai loài cây Holostemma adakodien vàIpomoea mauritiana đồng thời cũng tuyên truyền cho người dân biết bảo

tồn các cây thuốc quí trước thảm họa bị tuyệt chủng [27].

2.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật trong nhân giống và bảotồn nguồn gen thực vật

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kỹ thuậtquan trọng của công nghệ sinh học, là nền tảng để nghiên cứu và áp dụngcác công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật Trải quahơn 100 năm phát triển và đã đạt được những thành tựu nhất định tronglĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng [16].

2.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả cácloại nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch được nuôi cấy trong môi trườngdinh dưỡng nhân tạo, ở điều kiện vô trùng.

Phân hóa tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào phân chia Tế bào chuyên hóa

Phản phân hóa tế bào- Nuôi cấy mô sẹo

- Nuôi cấy tế bào trần

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật đó làtính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra năm 1902 Theo quan niệmsinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đãphân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơthể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể pháttriển thành một cá thể hoàn chỉnh.

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật làkết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào Trong đó:

Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tếbào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau.

Khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng riêng biệt,chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình mà trong trườnghợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng tế bào phôisinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bàongược lại với sự phân hóa tế bào.

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạthóa, ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cáthể, có một số gen được hoạt hóa để biểu hiện tính trạng mới, còn một sốgen khác lại bị ức chế hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã

được mã hóa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào, khiến quá trìnhsinh trưởng của cơ thể thực vật luôn được hài hòa.

Như vậy, kỹ thật nuôi cấy mô và tế bào thực vật xét cho cùng là kỹthuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấytách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) Đây là một điểm rất quantrọng vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện kỹthuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng [7],[10], [16]

2.2.2 Các bước chính trong nhân giống vô tính in vitro

Theo George (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm

các bước sau:

Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây

mẹ (nguồn mẫu nuôi cấy) Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là sạchvi rút và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng các cây mẹ trong điềukiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệuquả trước khi lấy mẫu nuôi cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khảnăng sống và sinh trưởng của mẫu.

Bước 2: Nuôi cấy khởi động

Là giai đoạn khử trùng và đưa mẫu cấy in vitro Các giai đoạn này

cần đảm bảo các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, các mô tồntại và sinh trưởng tốt Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạnphát triển của cây Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sauđó là đỉnh chồi hoa, cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá.

Bước 3: Nhân nhanh

Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăngnhanh số lượng thông qua các con đường hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bấtđịnh và tạo phôi vô tính.

Chúng ta cần phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnhthích hợp để có hiệu quả cao nhất Theo nguyên tắc chung môi trường cónhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi Nhiệt độ nuôi cấy thường là 25 -27oC thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ ánh sáng 2000 - 4000lux Tuy nhiên, đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ ánhsáng nuôi cấy khác nhau.

Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Để tạo rễ cho chồi người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanhsang môi trường tạo rễ Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khichuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường khôngchứa chất kích thích sinh trưởng.

Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinhtrưởng tốt cần đảm bảo những yêu cầu sau:

Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định(số lá, số rễ, chiều cao cây).

Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp giá thể sạch tơi xốp, thoát

nước Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng vườn ươm cũngnhư có chế độ dinh dưỡng phù hợp [5], [17].

2.2.3 Phương pháp nhân đa chồi

Trong phương pháp nhân đa chồi, chồi ngọn được tách và nuôi cấytrên môi trường dinh dưỡng và các chồi bên từ nách lá phát triển dưới ảnhhưởng của cytokinin với nồng độ cao Vai trò của cytokinin lúc này là ứcchế ưu thế ngọn để chồi bên phát triển Các chồi này tiếp tục được chuyển

tạo ra Sau đó, các chồi này được chuyển sang môi trường ra rễ và đượcđưa ra vườn ươm khi đã có rễ hoàn chỉnh [16].

Những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành đa chồi:

Nhu cầu về loại và nồng độ cytokinin khác nhau Nồng độ cytokininthay đổi tùy theo giai đoạn nuôi cấy, thông thường trong quá trình tạo chồingười ta sử dụng auxin với nồng độ thấp, phối hợp cùng với cytokinin ởnồng độ cao Không nên cảm ứng tạo mô sẹo với nồng độ cytokinin quácao vì có thể tạo ra chồi bất định mang các đột biến.

Trong trường hợp chồi bên không tăng trưởng được thì cần phải cắtbỏ chồi ngọn hoặc làm chết chồi ngọn thì chồi bên mới có thể hoạt động.Khi cấy chuyển nhiều lần tốc độ sinh khối bị thay đổi [18].

Hiện nay nhân nhanh bằng phương pháp nhân chồi bên được ápdụng rộng rãi ở nhiều loài thực vật, quá trình nhân chồi thường được thựchiện theo các bước sau [10]:

Sơ đồ tổng quát nhân nhanh trong in vitro

2.2.4 Vai trò của các chất kích thích sinh trưởng đối với tái sinh cây in vitro

Các chất kích thích sinh trưởng thực vật có vai trò quan trọng trong kỹthuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật Bằng cách cung cấp các chất kíchthích sinh trưởng ở một mức độ thích hợp, chúng ta có thể điều khiển đượcchiều hướng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy Auxin và cytokinin là haichất kích thích sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy mô.

 Đặc tính của Auxin

Tạo cây in vitro

hoàn chỉnhTrồng cây trong

bầuCây trồng ngoài

tự nhiên

Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thườngxuyên trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với cácthành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởngcủa mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái đặc biệt làkhi nó được sử dụng với cytokinin Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trongmôi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cầnnghiên cứu, hàm lượng auxin nội sinh của mẫu nuôi cấy, sự tác động qualại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh.

Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào Cùngvới cytokinin các nhóm auxin kích thích sự phân chia tế bào Các hormonecủa nhóm này có hoạt tính như: Tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tínhhướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, kích thích ra rễ và phân hóa mạch dẫn.Tác động của các auxin thường liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồichính, rễ Đối với nuôi cấy mô và tế bào thực vật, auxin được sử dụng đểkích thích phân chia tế bào và phân hóa rễ Những auxin thường dùng rộngrãi trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật: IBA (Indoly Butyric Acid), IAA(Indoly Acetic Acid), NAA (α - Naptalen Acetic Acid), 2,4 - D(Dichlorphenoxy Acetic Acid) [18].

 Đặc tính của cytokinin

Cytokinin là dẫn xuất của adenine, hormone liên quan chủ yếu đếnsự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôicấy mô tế bào thực vật Các cytokinin thường xuyên được sử dụng nhất làBAP (6 - Benzyl Amino Purin), kinetin (N - (2 - furfurylamin) - 1 - H - 6 -amin ), zeatin (6 - (4 - hydroxy - 3metyl - trans - 2 butanylamin) purin).Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin dao động từ 0,1 - 0,2 mg/l Ở nồngđộ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồibất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy.

Ngoài hai nhóm chính là auxin và cytokinin, trong nuôi cấy mô và tếbào thực vật người ta còn sử dụng thêm gibberellin để kích thích sự kéodài tế bào, qua đó làm tăng kích thước chồi nuôi cấy… GA3 là loại

gibberellin được sử dụng nhiều nhất

Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật có loại mẫu chỉ cần auxin hoặccytokinin, tuy nhiên người ta hay dùng phối hợp cả auxin và cytokinin ở tổhợp tỷ lệ khác nhau sẽ cho hiệu quả tốt hơn [19].

2.2.5 Thành tựu bảo tồn nguồn gen cây trồng sử dụng phương phápnuôi cấy mô và tế bào thực vật

Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã trở thành một trongnhững phương thức quan trọng nhất để nhân nhanh, đặc biệt là đối với câytrồng khó nhân nhanh bằng phương pháp truyền thống Dưới đây là một sốthành tựu đã đạt được.

 Trong nước

Ở Việt Nam việc áp dụng kỹ thuật này để bảo tồn các loài thực vậtnhiệt đới quí hiếm, có giá trị kinh tế cũng được các nhà nghiên cứu quan

tâm, bắt đầu từ các cây Thông (Taxus sps.) là một loài có chứa các hoạt

chất chữa ung thư hiệu quả như Taxoid và các hợp chất và một số loài thựcvật có giá trị làm thuốc [20].

Cây Màng tang (Litsea verticillata) là loại cây thân gỗ có chứa một

số hợp chất có khả năng kháng HIV (+)- demethoxyepiercelsin vàverticillatol [29], [40] Tác giả Lê xuân Đắc và Cộng sự đã thành công

trong việc nhân nhanh và bảo tồn cây Màng tang (Litsea verticillata) được

tìm thấy ở Vườn Quốc gia Cúc Phương bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và tếbào thực vật [4].

Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) được biết là một vị

thuốc quí trong việc chữa một số bệnh ung thư Tác giả Lưu Trường Sinh và

Cộng sự đã tạo ra cây Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp in vitro có

chất lượng tương đương với cây trồng theo phương pháp truyền thống [15].Các tác giả Nguyễn Thanh Danh và Cộng sự (2005) đã nghiên cứu

thành công nhân nhanh in vitro cây Vù hương (Cinamomum balansae

Lecomte.), sử dụng phôi hạt của quả Vù hương xanh thu hái trước khi chín30 ngày đã nhân giống được cây Vù hương bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi hạtxanh [3].

 Thế giới

Năm 2003, Bedir và Cộng sự đã vi nhân giống thành công giống

Hydrastis Canadensis, một loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng ở miền

Bắc nước Mỹ [23].

Cũng cùng năm 2003 Part và Cộng sự đã thành công trong việc nhân

nhanh và bảo tồn cây thuốc Anemopaegma arvense trong ống nghiệm trên

môi trường MS có chứa 4% đường sorbitol, kết quả sau 6 tháng mới phảicấy chuyển một lần [36].

Năm 2008 Balaraju và Cộng sự đã nhân giống và tái sinh in vitrothành công cây thuốc Vitex agnus castus bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

và tế bào thực vật từ mô phân sinh đỉnh trên môi trường MS có bổ sung0,1mg/1ml IBA [21].

Gần đây những thành tựu trong việc hoàn thiện qui trình nuôi cấy invitro cây thuốc đang có nguy cơ bị tuyệt chủng như Gynura procumbens,Crotalaria verrucosa, Momordica tuberosa [24], [30], [33].

Năm 2009 bằng kỹ thuật vi nhân giống in vitro các nhà khoa học

trên thế giới đã thành công trong việc nhân nhanh nhiều cây thuốc quí hiếm

như Phyllanthus urinaria hay cây Givotia rottleriformis [31], [37].

Park và Cộng sự (2009) tái sinh thành công loài Rehmanniaglutinosa quí hiếm đang bị khai thác quá mức [35].

Hiện nay những công trình nghiên cứu thành công trong lĩnh vực táisinh cây thuốc quí bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật vẫn đangđược tiến hành

2.2.6 Phương pháp bảo tồn thực vật quí hiếm

Ngày nay nhiều nguồn gen thực vật bị đe dọa có nguy cơ tiệt chủng,nhiều giống cây trồng bị thoái hóa không giữ được đặc điểm nguyên sơ banđầu như chất lượng hay khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi, thì

việc sử dụng kỹ thuật nhân giống in vitro để nhân nhanh và bảo tồn nguồngen là hết sức cần thiết Bảo quản trong điều kiện in vitro được coi là giải

pháp công nghệ có triển vọng đối với cây trồng nhân giống vô tính và câycó hạt dễ mất khả năng nảy mầm ở nhiệt độ và độ ẩm thấp.

Bảo tồn in situ

Là biện pháp bảo tồn hiệu quả nhất bao hàm các quần thể tái sinhnhân tạo bằng nguồn hạt giống thu hái tại chỗ, thu hái từ cây mẹ mà khôngáp dụng có định hướng Điều này có ý nghĩa lớn đối với việc xây dựngrừng giống cho các loài cây có phân bố rải rác, như vậy quần tụ bảo tồnđược dùng làm nguồn cung cấp vật liệu giống cho tái sinh nhân tạo [12].

Hầu hết các loài cây bản địa đều cần được ưu tiên bảo vệ theo hình

thức bảo tồn in situ, song hai vấn đề được quan tâm là:

- Có qui hoạch cụ thể và xác định vùng cần bảo vệ cho mỗi loài sao chocá thể vẫn giữ nguyên được toàn bộ biến dị di truyền của loài.

- Kết hợp bảo tồn với việc thu hái hạt giống phục vụ tái sinh tự nhiên,tái sinh nhân tạo, xây dựng quần tụ bảo tồn mới, xây dựng giống vàphục vụ trồng rừng.

Bảo tồn ex situ

Bảo tồn ex situ được thực hiện bằng cách tách rời cây hoặc vật liệu

nhân giống ra khỏi vùng phân bố tự nhiên để đưa vào các bộ sưu tập câysống, rừng trồng với mục đích bảo tồn [12].

Ba nhiệm vụ chính của bảo tồn ex situ là:

- Thu thập các mẫu gen tiêu biểu;

- Duy trì chúng ở điều kiện tốt trong thời gian dài;

- Làm tăng số lượng mẫu thu thập được;

Khó khăn nhất trong bảo tồn ex situ là chi phí cao mà diện tích của

một quần tụ bảo tồn được đề xuất với 10 ha cho mỗi loài hoặc xuất xứ vàđược lượng biến dị đủ lớn nghĩa là thu hạt từ càng nhiều kiểu gen càng tốt.

PHẦN III

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Hóa chất: Môi trường MS sử dụng trong nghiên cứu gồm các muốiđa lượng và vi lượng, các chất hữu cơ và vitamin theo Murashige và Skoog(1962), đường saccharose, agar, các chất kích thích sinh trưởng như BAP,IAA, NAA, kinetin, IBA (của các hãng chuyên dụng như: Sigma, Merck,Invitrogen ).

Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 25 - 27°C và chế độ chiếu sáng12h/12h với cường độ chiếu sáng là 2000 lux.

3.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm: Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Trại thực nghiệm sinh học Viện Công nghệ sinh học, thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

-Thời gian: Từ tháng 4/2008 đến 4/2010.

3.2 Phương pháp nghiên cứu

Các chỉ tiêu nghiên cứu được chia thành các công thức thí nghiệmkhác nhau và có công thức đối chứng.

Số mẫu của mỗi công thức thí nghiệm lớn hơn hoặc bằng 30.

Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.

3.2.2 Khử trùng mẫu

Khử trùng mẫu bao gồm các bước sau:

Cắt cành cây Mắt trâu thành đoạn dài 6 - 8 cm;Rửa mẫu bằng nước xà phòng loãng;

Rửa sạch nước xà phòng loãng dưới vòi nước;Rửa 2 lần bằng nước cất vô trùng;

Rửa trong cồn 70 °C (Trong 15 giây);Rửa bằng nước cất khử trùng 3 lần;

Khử trùng trong dung dịch 1% NaClO, lắc trong 10 phút;Rửa 4 lần bằng nước cất vô trùng;

Thấm khô bằng giấy thấm đã khử trùng;

Thu mẫu: Mẫu sau khi khử trùng được cắt tỉa thành những đoạn dàikhoảng 1,0 - 1,5 cm có từ 1 - 2 đốt thân và được cấy vào môi trường MS.

Sau khoảng 20 ngày, chồi non phát sinh in vitro các chồi non này được sử

dụng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo [4].

3.2.3 Nhân nhanh bằng phương pháp nhân đa chồi

Môi trường sử dụng trong các thí nghiệm là môi trường MS + 30g/lđường saccharose + 9g/l agar và bổ sung các chất kích thích sinh trưởngvới nồng độ khác nhau tùy theo mục đích của từng thí nghiệm với pH =5,8.

Nhân đa chồi cây Mắt trâu

Thí nghiệm 1: Thăm dò nồng độ BAP và NAA đối với khả năng tạo chồi

Thí nghiệm nhằm xác định nồng độ BAP và NAA thích hợp nhất cho sự tạochồi.

BAP (mg/l) NAA (mg/l)

Thí nghiệm 2: Thăm dò nồng độ BAP và IBA đối với khả năng tạo đa chồi

Khảo sát sự tác động đồng thời của BAP và IBA đến khả năng phátsinh chồi và tăng trưởng chồi Mắt trâu.

3.2.4 Tạo cây Mắt trâu in vitro hoàn chỉnh

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá, rễ đểchuyển ra trồng ngoài tự nhiên Cây con phải khỏe mạnh, sức đề kháng tốtnhằm nâng cao sức sống khi ra môi trường bên ngoài Các chất kích thích

sinh trưởng có tác dụng tạo đa chồi được loại bỏ và thay vào đó là chất kíchthích sinh trưởng tạo rễ như IBA, NAA…

Thí nghiệm 4: Thăm dò nồng độ IBA đối với khả năng tạo rễ

Mục đích là khảo sát nồng độ IBA đến khả năng tạo rễ cây Mắt trâu

CT Môi trường Nồng độ IBA (mg/l)

Thí nghiệm 5: Thăm dò nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ

Mục đích thí nghiệm là khảo sát nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ cây Mắt trâunhằm chuẩn bị đưa cây con khỏe mạnh ra ngoài vườn ươm.

CT Môi trường Nồng độ NAA (mg/l)

Trong các thí nghiệm 4 và thí nghiệm 5 được bố trí ở điều kiện như sau:Nhiệt độ 25 - 27°C

Chỉ tiêu quan sát: Số rễ/mẫu

3.2.5 Trồng cây trong bầu

Đây là một trong những giai đoạn quan trọng trong quá trình nhân

giống in vitro Giai đoạn này cây non cần sự thích nghi dần với điều kiện

bên ngoài ống nghiệm Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 - 3 tuầntrong thời gian này cây non phải được bảo vệ và chăm sóc tốt trước nhữngyếu tố bất lợi.

Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của các giá thể đến hiệu quả trồng câyMắt trâu

Mục đích thí nghiệm là tìm ra giá thể thích hợp trồng cây Mắt trâu trong bầu

3.2.6 Các chỉ tiêu nghiên cứu

Để đánh giá và tìm ra được môi trường thích hợp nhất chúng tôi sửdụng các chỉ tiêu sau:

Tổng số mẫu tạo chồi

Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = x 100 Tổng số mẫu nuôi cấy

Tổng số chồi Số chồi TB/mẫu =

Tổng số mẫu tạo chồi

Tổng số chồi ra rễ

Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = x 100 Tổng số chồi nuôi cấy

Tổng số rễ

Số rễ TB/chồi = Tổng số chồi ra rễ

Tổng số cây sống

Tỷ lệ cây sống (%) = x 100 Tổng số cây đem trồng

3.2.7 Phương pháp xử lí số liệu thí nghiệm

Các số liệu được xử lí thống kê sinh học Kết quả được mô phỏngbằng các bảng và hình Chúng tôi đã sử dụng những công thứcthống kê sau:

Trung bình số học: X =

nX

Độ lệch trung bình: m = n

Tiêu chuẩn độ tin của hiệu: td =

m : Sai số của hiệu các trung bình số học;

Khi tiêu chuẩn độ tin của hiệu td được so với tc- giá trị chuẩn của

tiêu chuẩn Studen với số bậc tự do là n n122 (n1: Số lần nhắc lại của

công thức thí nghiệm; n2: Số lần nhắc lại của công thức đối chứng) Sai

khác giữa các trị số trung bình chỉ có ý nghĩa khi td lớn hơn hoặc bằng giá

trị tương ứng với mức xác suất 0,95.

Hình 1: Chồi Mắt trâu vô trùng sau 2 tuần nuôi cấy

4.2 Tạo đa chồi

Trong môi trường nghiên cứu in vitro khi bổ sung các chất kích thích

sinh trưởng như auxin, cytokinin, gibberellin sẽ kích thích sự sinh trưởngphát triển và phân hóa của các cơ quan, từ đó tạo nên sức sống tốt cho cácmô và tổ chức Tuy nhiên, mỗi loài thực vật lại thích hợp với một loại vànồng độ chất kích thích sinh trưởng khác nhau Vì vậy, nên sử dụng phốihợp các chất kích thích sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy để cho hiệuquả tối ưu nhất.

Việc tìm ra công thức môi trường với nồng độ và tỷ lệ chất kíchthích sinh trưởng phù hợp với từng loài cây, từng giai đoạn phát triển là

bước rất quan trọng trong qui trình nhân giống in vitro.

4.2.1 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng tạo đa chồi

Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình tháitrong các hệ thống nuôi cấy Khi tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì sẽ phát sinhmô sẹo hoặc hình thành rễ Ngược lại sẽ dẫn tới phát sinh chồi và chồinách.

Chúng tôi tiến hành thử nghiệm các công thức tạo đa chồi với các tổhợp của BAP và NAA ở các nồng độ khác nhau Kết quả thể hiện rõ ở bảng1, hình 2a, hình 2b và hình 3 sau 2 tháng nuôi cấy.

Bảng 1: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng tạo đa chồi

Tỷ lệ mẫu tạochồi (%)