1.1. Đặt vấn đề Escherichia coli (E. coli) là một trong những vi khuẩn phổ biến trong đường tiêu hóa của người và động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E. coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây h
Trang 1LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm ơn đến:
Gia đình đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho tôi cả về vật chất lẫn tinh thần, là chỗ dựa vững chắc để tôi học tập tốt.
Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường.
Thầy Nguyễn Ngọc Tuân đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
BSTY Bùi Thị Thu Trang đã nhiệt tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài.
BSTY Lê Hữu Ngọc, phòng thực hành Kiểm nghiệm Thú sản và Môi Trường, Khoa CNTY Trường Đại học Nông Lâm TP HCM.
Quý thầy cô, cán bộ công chức tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa sinh Trường Đại học Nông Lâm TP HCM.
Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập.
Chân thành cảm ơnĐàm Thị Minh Thơ
Trang 2ĐÀM THỊ MINH THƠ, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, tháng 9/2005 “ỨNG DỤNG KĨ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN
ĐỘC LỰC CỦA NHÓM E COLI SẢN SINH ĐỘC TỐ SHIGA (STEC) PHÂN
LẬP ĐƯỢC TỪ PHÂN BÒ, HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ” Hội đồng hướng dẫn:
PGS TS Nguyễn Ngọc TuânBSTY Bùi Thị Thu Trang
Đề tài được thực hiện nhằm phát hiện các gen độc lực stx1, stx2, eae, ehxA, và gen uid của vi khuẩn E coli được phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của bò,
heo, bê và 9 mẫu bề mặt thịt bò bằng kỹ thuật multiplex – PCR Quan sát và ghi nhận trên môi trường MAC chỉ có một loại khuẩn lạc hồng, trên môi trường SMAC có hai loại khuẩn lạc hồng và trắng, trên môi trường CT-SMAC cũng có hai loại khuẩn lạc hồng và trắng Mỗi nhóm chọn khoảng 6 – 10 khuẩn lạc riêng lẻ Ly trích DNA theo nhóm khuẩn lạc và từng khuẩn lạc riêng lẻ theo phương pháp nhiệt Kết quả multiplex - PCR được ghi nhận như sau:
(1) Nhóm khuẩn lạc có mang gen độc lực thì chưa chắc từng khuẩn lạc riêng lẻ có mang gen độc lực đó.
(2) 100% mẫu phân tiêu chảy đều có E coli mang gen gây dung huyết ehxA Tần số phát hiện gen stx của E coli từ những mẫu phân tiêu chảy
lần lượt là: 50% ở bò, 44,4% ở heo cai sữa và 100% trên bê
Ở phân bò tiêu chảy: có 5/10 mẫu (50%) phát hiện E coli mang gen độc lực thuộc nhóm Stx; 10/10 mẫu (100%) phát hiện E coli mang gen ehxA; 4/10 mẫu (40%) E coli mang gen stx2, 1/10 mẫu (10%) E coli mang gen stx1; và không phát hiện được gen uid và eae.
Ở phân heo cai sữa tiêu chảy: có 4/9 mẫu (44,4%) phát hiện E coli mang gen stx, trong đó có ¼ mẫu mang gen stx1 (25%) và ¾ mẫu mang gen stx2 (75%), không có mẫu nào mang gen uid và eae, 9/9 mẫu (100%) mang gen ehxA.
Ở phân bê tiêu chảy: có 8/8 mẫu (100%) phát hiện được ít nhất 1 gen độc lực, có mẫu phát hiện 2 -3 gen độc lực; 8/8 mẫu (100%) phát hiện
được gen ehxA; 7/8 mẫu (87,5%) phát hiện được gen stx1; 1/8 mẫu (12,5%) phát hiện được gen stx2 Trong khi đó, không phát hiện được gen uid trong bất kì mẫu nào, 7/8 (87,5%) mẫu đều hiện diện cả gen ehxA và stx
(3) 9 mẫu bề mặt thịt bò khảo sát hoàn toàn chưa phát hiện được gen độc
lực của E coli.
(4) Chưa phát hiện được gen uid và eae trong 27 mẫu phân tiêu chảy của
bò, bê và heo cai sữa; và 9 mẫu bề mặt thịt.
SUMMARY
Trang 3“The application of multiplex - PCR in detecting some virulent genes of
E coli isolated from diarrhea faeces of bovine and swine, swabs of beef
(1) The colony group had virulent genes, the separate colony belonging to that group did or did not have those genes.
(2) Frequency of ehxA gene of isolated E coli from diarrhea stools samples was 100%; stx gene was 50% from bovine; 100% from calves; 44.4% from
In diarrhea bovine stools samples: 5 of 10 samples (50%) detected E coli carrying stx gene, all of 10 samples (100%) were detected E coli carrying ehxA gene, 4 of 10 samples (40%) were detected E coli carrying stx2, 1 of 10 samples (10%) were detected E coli carrying stx1, none of those samples were detected E coli carrying uid and eae.
In diarrhea piglet stools samples: 4 of 9 samples (44.4%) were
detected E coli carrying stx, including of 1 of 4 samples were detected E coli carrying stx1 (25%) and 3 of 4 samples were detected E coli carrying stx2 (75%); all of 9 samples (100%) were detected E coli carrying ehxA, and no sample was detected E coli carrying uid and eae.
In diarrhea calf stools samples: all of 8 samples (100%) were detected no less than one virulent gene, some samples were detected 2-3 virulent
genes; 7 of 8 samples (87.5%) were detected stx1 gene; 1 of 8 samples (12.5%) was detected stx1 gene; all of 8 samples (100%) were detected ehxA gene Meanwhile, no sample was detected uid and eae genes; 7 of 8 samples (87.5%) were detected E coli carrying both ehxA and stx genes.(3) 9 swabs samples were investigated but no sample contained the E coli
carrying the virulent genes
(4) In the 27 diarrhea bovine, calf, piglet stools samples, uid and eae genes
have not been detected yet.
Trang 42.1.3 Phân loại E coli 4
2.2 Shiga toxigenic E coli (STEC) 5
Trang 53 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 18
3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện 18
3.1.1 Thời gian 18
3.1.2 Địa điểm 18
3.2 Nội dung thực hiện 18
3.3 Phương pháp thực hiện 18
3.3.1 Vật liệu thí nghiệm cơ bản 18
3.3.2 Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu 19
3.3.2 Nuôi cấy và phân lập E coli 19
3.3.2.1 Môi trường nuôi cấy 19
3.3.5 Điện di, đọc kết quả 23
4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
4.1 Kết quả phát hiện các gen độc lực của E coli phân lập được từ phân bò tiêu chảy 24
Trang 64.3 Kết quả phát hiện các gen độc lực của E coli phân lập được từ phân bê
Trang 7DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Eae E coli attaching and effacing
cefixime
Trang 8Bảng 4.1 Kết quả phát hiện gen độc lực của E coli trong từng nhóm khuẩn lạc
(HM, TS, và HS) ở phân bò tiêu chảy 25
Bảng 4.2 Kết quả phát hiện gen độc lực E coli từng khuẩn lạc riêng lẻ ở phân
bò tiêu chảy 26
Bảng 4.3 Kết quả phát hiện gen độc lực của nhóm khuẩn lạc đại diện cho E coli
trong phân heo cai sữa tiêu chảy 27
Bảng 4.4 Kết quả phát hiện gen độc lực của E coli trong từng nhóm khuẩn lạc
ở phân bê tiêu chảy 29
Bảng 4.5 Kết quả phát hiện gen độc lực của E coli trên bề mặt
thịt bò 30
Bảng 4.6 Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực của E coli trên 36
mẫu khảo sát 32
Trang 9DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ, HÌNH
Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm multiplex - PCR 33