Xác định giới tính bằng kỹ thuật multiplex pcr trên ba giống bò

TÓM TẮT KHÓA LUẬN Đề tài được tiến hành từ ngày 14-02-2005 đến ngày 06-07-2005 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.

PHẦN I MỞ ĐẦU1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Xác định giới tính phôi động vật có thể mang lại hiệu quả trong chăn nuôi, nhất là đối với động vật cao sản như bò sữa Nhờ xác định giới tính, ta có thể quyết định nuôi động vật có giới tính mong muốn để giảm chi phí chăn nuôi, và góp phần phục hồi một số loài động vật quí hiếm nhưng gặp khó khăn trong vấn đề sinh sản và đang có nguy cơ tiệt chủng Chính vì thế, các nhà khoa học luôn tìm cách xác định giới tính.

Cho đến ngày nay, rất nhiều phương pháp xác định giới tính đã được thực hiện Những phương pháp bao gồm lai tại chỗ và phát huỳnh quang để xác định nhiễm sắc thể (NST) Y, phân tích NST hoặc xác định kháng nguyên H - Y có trên bề mặt các tế bào phôi đực đã được tiến hành rất nhiều Tuy vậy, các phương pháp này hoặc có độ tin cậy không cao hoặc bị hạn chế về lượng mẫu dùng (đòi hỏi dùng lượng mẫu DNA quá lớn mà phôi khó cung cấp được) Ngoài các phương pháp trên, người ta còn phát hiện ra phương pháp PCR (polymerase chain reaction) Đây là phương pháp xác định giới tính bằng cách khuếch đại đoạn DNA (deoxyribonucleic acid) đặc trưng cho giới tính đực hiện diện trên NST Y Phương pháp này có độ tin cậy cao và khá nhạy vì có thể tiến hành với lượng mẫu DNA ban đầu tương đối nhỏ.

Ở Việt Nam, tiềm năng phát triển chăn nuôi động vật rất lớn, nhất là gia súc, gia cầm Để phát triển chăn nuôi, định hướng nuôi con gì, giới tính nào, số lượng bao nhiêu là rất quan trọng Việc tiền chọn lọc giới tính giúp cho ta hoạch định sẽ nuôi bao nhiêu thú cung cấp sữa, bao nhiêu thú cung cấp thịt và vẫn giữ đúng định hướng ấy mà lại giảm thiểu đáng kể tổn thất về kinh tế

Hiện tại, Việt Nam đang cố gắng tạo được đàn bò có số lượng và chất lượng đủ đáp ứng về thịt và sữa cho người tiêu dùng trong nước, một phần có thể xuất khẩu Khi đó, việc nhập phôi đông lạnh hoặc tạo hàng loạt phôi được phân biệt giới tính rõ ràng bằng các kỹ thuật chẩn đoán giới tính hiện đại sẽ là hai trong số những giải pháp cho vấn đề này Vì phôi đông lạnh được phân biệt giới tính trước thì quá đắt, cho nên việc tạo phôi động vật nhân tạo là hướng giải quyết mang tầm chiến lược về kinh tế và khoa học Mặc khác, việc tạo ra được phôi của động vật cao sản không phải là vấn đề đơn giản ở Việt Nam trong thời điểm hiện tại, nhất là ở những cơ sở nhỏ Do đó, để thiết lập các qui

trình xác định giới tính phôi sẽ gặp khó khăn ở nguồn mẫu Thế nhưng, nếu không thiết lập qui trình xác định giới tính, đến khi đã tạo được phôi thì sẽ không thể nào phân biệt được giới tính Lúc đó, phải mất nhiều thời gian để tìm ra qui trình Chính vì thế, đề tài này sẽ sử dụng các nguồn mẫu như cơ, lông bò để thiết lập qui trình chẩn đoán giới tính Khi tạo được phôi bò, lúc đó sẽ dùng qui trình này để xác định giới tính phôi tạo ra Đó chính là ý nghĩa cấp thiết của đề tài.

1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU1.2.1 Mục tiêu

Tìm ra qui trình PCR phù hợp để xác định giới tính của các giống bò ta Vàng, lai Sind và bò sữa Hà Lan dựa trên sự khuếch đại đoạn DNA chuyên biệt giới tính đực.

1.2.2 Yêu cầu

- Ly trích DNA từ mẫu cơ và lông của 3 giống bò (ta Vàng, lai Sind và bò sữa Hà Lan).

- Xác định chu trình nhiệt cho qui trình PCR thành công.

- Thử nghiệm loại Taq polymerase dùng trong qui trình PCR.

- Ứng dụng qui trình PCR tìm được để xác định giới tính ba giống bò ta Vàng, lai Sind, và sữa Hà Lan.

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 KHÁI QUÁT VỀ NGUỒN MẪU CHIẾT XUẤT DNA

2.1.1 Đặc điểm về ngoại hình các giống bò

Hiện tại, ở nước ta có rất nhiều giống bò được nuôi Tuy nhiên, số lượng của mỗi giống thì rất khác nhau (Nguyễn Trọng Tiến và ctv, 2001) Chủ yếu là những giống sau:

- Bò ta Vàng: có nguồn gốc trong nước; lông có màu vàng, vàng nhạt hoặc vàng đậm; nhỏ vóc, năng suất thấp, trọng lượng khoảng 160 - 220 kg.

- Bò lai Sind: tạo ra từ việc lai giữa bò gốc Ấn Độ nhập vào Việt Nam lâu đời với bò trong nước Bò có lông màu nâu cánh dán đến đậm, u vai cao, yếm rộng, trọng lượng khoảng 200 - 400 kg Bò cái thường được dùng làm nền để phối với các bò đực tốt từ nước ngoài về.

- Bò sữa Hà Lan: thường là dạng bò lai từ bò Holstein Friesian có nguồn gốc Hà Lan với bò trong nước (lai Sind) Bò có màu đen lẫn đốm trắng, trọng lượng trung bình 200 - 500 kg, khả năng cho sữa 15 - 20 lít / ngày.

Ở Việt Nam, bò nuôi có tỷ lệ đậu thai thấp (60%) Hơn nữa, bò cái ở Việt Nam có vóc nhỏ nên khó phối với bò đực ngoại vóc lớn Vì vậy, để có bò cái nền cần làm cho chúng lớn vóc lên Đây là vấn đề rất lâu dài và khó khăn trong công tác giống.

2.1.2 Đặc điểm về nguồn mô chiết xuất DNA2.1.2.1 Một vài đặc điểm về cơ bò

Cơ được sử dụng trong quá trình ly trích DNA là cơ vân Tế bào cơ vân là dạng tế bào đa nhân nên lượng DNA ly trích được từ cơ rất nhiều Protein trong cơ vân chủ yếu là actin, myosin và myoglobin Trong đó, myoglobin là loại protein thuộc nhóm chromoprotein giúp tạo màu đỏ trong bắp thịt (Nguyễn Phước Nhuận và ctv, 2003) Myoglobin được cấu tạo từ 1 tiểu đơn vị globin gắn với 1 nhóm heme Dù là một loại protein phức tạp nhưng nó dễ bị phân cắt bởi các proteinase vì trong cấu trúc của nó không có liên kết disulfide.

2.1.2.2 Một vài đặc điểm về lông bò

Ở thú hữu nhũ, lông là một dạng cấu trúc phối hợp với da để tạo bề mặt phủ bên ngoài cơ thể Lông xuất phát từ nang lông, có nguồn gốc từ lớp bì Xét về cấu trúc cắt ngang, lông gồm có 3 lớp: lớp ngoài gọi là lớp sừng, được cấu tạo từ những tế bào

chết; kế đến là lớp vỏ tạo màu sắc cho lông nhờ sắc tố melanin; trong cùng là lớp tuỷ Xét theo chiều dài, lông là một cấu trúc bị keratin hoá từ gốc dần lên ngọn Càng đi xa khỏi gốc thì mức độ keratin hoá càng mạnh, các tế bào mất dần DNA của mình và trở thành một chuỗi protein ở phần ngọn Phần gốc lông có chứa rất nhiều tế bào còn sống (Frandson và ctv, 1969).

Theo Nguyễn Phước Nhuận và ctv (2003), keratin là một loại protein cứng thuộc nhóm albuminoid (scleroprotein) có đặc tính không tan trong các dung dịch trung tính, chỉ hoà tan trong các dung dịch acid loãng hay kiềm tính Theo Lê Thị Mỹ Phước và ctv (2002), keratin có trọng lượng phân tử khoảng 600.000 đơn vị carbon Thường có 2 dạng keratin là α-keratin và β-keratin α-keratin có cấu trúc vòng với nhiều liên kết cystine Trong khi đó β-keratin có cấu trúc phiến xếp nếp Nét đặc biệt của keratin là hàm lượng cystine rất cao nên giữa các mạch polypeptide có nhiều liên kết ngang disulfide Vì vậy keratin có tính bền vững cao và có cấu trúc cấp hai rất khác nhau Chính vì lý do đó, chúng khó bị phân cắt bởi các enzyme proteinase không chuyên biệt.

Ngoài keratin, melanin cũng là một loại protein khó bị loại khỏi DNA cần tách chiết Melanin có 3 loại chính là eumelanin (sắc tố nâu đen), phaomelanin (sắc tố nâu đỏ) và allomelanin (sắc tố đen) (AIP congress, 2002) Màu sắc của lông tùy thuộc vào loại melanin có trong lớp vỏ của lông Đôi khi lớp vỏ bị mất hết melanin làm cho lông có màu trắng Sự hiểu biết về melanin cho đến nay không nhiều lắm Người ta thường đề cập đến melanin ở dạng polymer sinh học tự nhiên Nhiều đặc tính hoá học của melanin chưa được biết rõ nên rất khó cho việc tìm cách tách melanin ra khỏi dung dịch chứa DNA mẫu.

Theo như trên, lông với cấu trúc đặc trưng của nó là chứa rất nhiều keratin và melanin nên sẽ tạo nhiều khó khăn trong việc ly trích và tinh sạch DNA.

2.2 CƠ SỞ XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH

2.2.1 Lịch sử khám phá cơ chế xác định giới tính tự nhiên ở động vật

Từ xưa, giới tính được quan niệm là do sức nóng của tinh dịch và cái lạnh của tử cung xác định Dần dần, quan điểm này được bổ sung thêm các yếu tố ảnh hưởng từ môi trường như dinh dưỡng, tuổi cha mẹ, thời gian giao phối,… Sau này, công trình của Mendel (1900) và sự khám phá ra NST giới tính (Mc Clung, 1902) đã xác nhận vai trò của NST giới tính trong xác định giới tính Tuy nhiên, ở một số loài, có ảnh hưởng của môi trường trong việc xác định giới tính (Phan Kim Ngọc và Hồ Huỳnh Thùy Dương,

2000) Năm 1905, Wilson cho rằng cặp NST giới tính tạo nên sự khác biệt giữa cá thể đực và cái (Phạm Thành Hổ, 2000).

Tiếp theo đó, nhiều công trình khoa học đã được tiến hành để tìm ra cơ chế xác định giới tính (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Lan, 2002) Năm 1916, Bridges chứng

minh ruồi giấm (Drosophila) có giới tính xác định dựa trên số lượng NST X dù NST Y

có hiện diện hay không Năm 1923, Painter chứng minh sự hiện diện của NST X và Y ở người về mặt tế bào học Năm 1959, Welshons và Russeell đã xác định vai trò thiết yếu của NST Y trong sự quyết định giới tính của phôi động vật hữu nhủ Sau đó, Jacobs phát hiện phôi động vật hữu nhũ sẽ phát triển thành con đực nếu mang NST Y, còn Ford và Welshons cho rằng nếu phôi đó thiếu NST Y thì sẽ phát triển thành con cái Đến 1983, Whashburn và Eichcher chứng minh được quá trình biệt hoá giới tính cần có sự tham gia của cả các gen trên NST X, Y và nhiều gen khác trên NST sinh dưỡng.

Ngày nay, người ta đang tìm những gen nằm trên NST Y mà sản phẩm của chúng điều khiển trực tiếp hoặc gián tiếp toàn bộ bản chất giới tính ở động vật Những gen đó được gọi chung là TDF - testis determining factor (yếu tố xác định tinh hoàn).

2.2.2 Sơ lược về NST giới tính

Ở động vật hữu nhủ, giới tính được xác định theo cơ chế di truyền Trong phần lớn các loài, cá thể cái có bộ NST đồng hợp (2n, XX), cá thể đực có bộ NST dị hợp (2n, XY) Theo Chiarelli và ctv (1960), Sasaki và Makino (1962), ở loài bò, mỗi cá thể có số NST đơn bội là 60 (trích dẫn bởi Eldridge, 1985).

Trong bộ NST của động vật hữu nhủ, NST X thường có kích thước lớn hơn các NST sinh dưỡng (có kích thước trung bình) Chúng chứa khoảng 5% số gen của bộ gen Trong khi đó, NST Y thường nhỏ hơn các NST sinh dưỡng và có kích thước nhỏ nhất Người ta ước chừng trên NST X có khoảng 1000 gen, còn trên NST Y có khoảng 330 gen Cả hai loại NST này đều rất cần cho sự phát triển và hoạt động bình thường của cơ quan tạo giao tử (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Lan, 2002).

Theo Burgoyne (1998), NST X và Y có một vùng trình tự tương đồng với kích thước khoảng 2600 kb tại đầu cuối vai ngắn của NST, được gọi là vùng giả NST - Pseudo autosomal region (PAR) Trong xác định giới tính, các gen nằm trên vùng PAR của 2 NST X và Y cùng với các gen đặc biệt của NST Y nhưng nằm ở vùng trình tự không bắt cặp với NST X đóng vai trò rất quan trọng.

Sau đây là một số gen quan trọng trong việc xác định giới tính.

2.2.2.1 Các gen trên NST Y

- Gen zfy (zinc finger, Y)

Năm 1987, Page và ctv đã khám phá ra gen zfy trên người Bằng phân tích sự

chuyển vị NST ở nam XX và nữ XY, các nhà khoa học này đã tìm thấy một đoạn xác định tinh hoàn trên vùng giả NST của NST Y (Yp11.32) Trong vùng này có một gen với

tính bảo toàn cao gọi là zinc finger Y hay zfy mã hoá cho một protein gắn kết DNA Gen này giúp ngăn ngừa sự thiếu hụt tinh trùng trong quá trình sinh tinh Tương ứng với zfy, trên NST X cũng có vùng zfx (Xp22.12) có thể liên kết chéo với zfy trên NST Y Lúc này,

người ta nghĩ nó là TDF (trích dẫn bởi Haqq và Donahoe, 1998)

Tuy nhiên, những nghiên cứu tiếp sau đó cho thấy zfy không phải là TDF

Người ta phát hiện protein ZFY có biểu hiện ở tế bào giao tử (đây là những tế bào

không cần biệt hoá tinh hoàn) và những trình tự bắt nguồn từ NST Y thiếu zfy được tìm

thấy ở những người đàn ông XX (trích dẫn bởi Haqq và Donahoe, 1998) Koopman và

ctv (1991) đã khẳng định zfx / zfy không là yếu tố biệt hoá và xác định giới tính chủ yếu

ở động vật hữu nhũ mà chúng chỉ là một trong số các nhóm gen tham gia tích cực vào

quá trình này Ngày nay, người ta thường sử dụng zfy như là một chỉ thị cho NST Y

trong việc sàng lọc giới tính (trích dẫn bởi Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003).

- Gen sry ( sex determining region, Y)

Năm 1959, các nhà khoa học đã khám phá NST Y có mang sry ở cả người và chuột Năm 1966, người ta đã xác định vị trí của sry nằm trên vai ngắn của NST Y Cuối thập niên 80, người ta đã xác định được sry nằm trên vùng 1 của vai ngắn NST Y

(Yp11.3) Năm 1990, Sinclair và ctv đã phân lập gen sry từ khu vực trên (trích dẫn bởi

Josso và ctv, 2003).

Gen sry đóng vai trò chủ đạo cho việc xác định giới tính ở động vật hữu nhũ và

người Nhân tố này điều khiển sự biệt hoá tuyến sinh dục của phôi thành tinh hoàn chứ không phải buồng trứng Sau đó, tinh hoàn sản xuất các hormone sinh dục đực chịu trách nhiệm cho sự thể hiện các đặc tính thứ cấp của cá thể đực (trích dẫn bởi Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003).

Cho đến nay, sry được xem như là yếu tố đóng vai trò chủ đạo trong việc xác

định giới tính ở động vật hữu nhũ và người.

Ở động vật hữu nhũ, sự phát triển tinh hoàn của phôi phụ thuộc vào sự biểu

hiện của gen xác định giới tính sry Xét về mức độ hình thái học, sự hình thành các ống

dẫn tinh và sự biệt hoá các tế bào Sertoli cũng như tế bào Leydig là những đặc điểm đặc

trưng cho thấy sự biểu hiện gen sry trong tuyến sinh dục bình thường của một cá thể có

bộ NST dị hợp XY (Parma và ctv, 1999; trích dẫn bởi Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003) Xét

về mức độ phân tử, sry là một gen thuộc họ HMG box (high mobility group) mã hoá cho họ protein có khả năng gắn kết mạnh với DNA Chính vì vậy, sry được xem như là công

tắc đóng mở di truyền cho các chương trình biệt hoá giới tính liên quan đến một số gen

khác (Haqq và Donahoe, 1998) Do đó, sry hoạt động trong những dòng tế bào hỗ trợ

cho sự biệt hoá giới tính để hướng sự biệt hoá của chúng thành tế bào Sertoli hơn là thành những tế bào hạt đặc thù của buồng trứng.

Ở người khi cắt bỏ một đoạn giữa sry ORF (open reading frame) và trung thể thì thấy có sự giảm sút biểu hiện gen sry (ở mào niệu sinh dục) và dẫn đến sự đảo giới

(Mc Elreavey và ctv, 1992; Capel và ctv, 1993; Ma và ctv, 1993; Laval và ctv, 1995; trích dẫn bởi Haqq và Donahoe, 1998).

Hình 2.1: Sự phân bố các gen trên NST X và Y (Nguồn: Josso và ctv, 2003)

Ngoài những chứng cứ trên, người ta còn xét thấy rất nhiều đặc điểm về mô

học, sinh hoá và sinh học phân tử chứng minh sry là một TDF chủ yếu (Haqq và

Donahoe, 1998; Delbridge và Marshall Graves, 1999; Josso và ctv, 2003) Ngoài ra, trên

NST Y còn có chứa một số gen như amh (anti-mullerian hormone), wt1 (Wilm’s Tumor supressor gene), azf (Azoospermia factor),…là những gen có vai trò hỗ trợ cho quá trình

biệt hoá giới tính đực của cá thể Ngày nay, các nhà khoa học đang quan tâm nghiên cứu các gen đó để làm rõ hơn cơ chế xác định giới tính.

2.2.2.2 Các gen trên NST X

- Nhóm gen sox (SRY - liked HMG box)

Đây là nhóm gen hiện diện trên NST X Chúng có hơn 20 thành viên, ký hiệu là

sox1,…, sox20 Trong đó gen sox3 và sox9 có tương tác mật thiết với gen sry trong cơ

chế xác định giới tính ở động vật hữu nhũ.

Ở người, sự đột biến sox9 dẫn đến chứng rối loạn tạo cơ quan sinh dục sơ khai

Theo đó, protein SOX9 được biểu hiện ở thời điểm mà mào niệu sinh dục đang phát triển để phối hợp cùng với protein SRY trong việc xác định giới tính Những tế bào Sertoli biểu hiện protein SRY thì biểu hiện mạnh protein SOX9 (Campel và ctv, 1995; Tommerup và ctv, 1993; trích dẫn bởi Haqq và Donahoe, 1998).

Ở người nữ, sox3 ức chế sox9 Do đó, sự biệt hoá giới tính đực không xảy ra Khả năng này có được do bởi các gen sox cũng có bản chất là HMG box nên có thể gắn kết DNA Ở người nam, gen sox3 lại bị ức chế bởi protein SRY nên gen sox9 hoạt động bình thường và giúp biệt hoá giới tính đực Chính vì vậy, sry được xem như là một tác

nhân xác định giới tính gián tiếp Tuy nhiên, bên cạnh đó cũng có giả thuyết cho rằng

sry xác định giới tính trực tiếp Do vậy, việc này vẫn còn nằm trong sự bàn cãi (Foster

và Graves, 1994; trích dẫn bởi Delbridge và Marshall Graves, 1999).

- Gen dax - 1 (Dosage - sensitive sex reversal - adrenal hypoplasia congeneital

critical region X chromosome 1: vùng nằm trên NST X gây ra sự giảm bẩm sinh số tế bào tuyến thượng thận nên làm biến đổi giới tính)

Gen dax - 1, một thành viên của nhóm yếu tố phiên mã hormone steroid liên

quan đến yếu tố sinh steroid 1, chịu trách nhiệm về bệnh AHC (adrenal hypoplasia

congenita) Người ta xác định dax - 1 nằm ở khu vực Xp21.3 - 22.11 mà sự nhân đôi của nó sẽ dẫn đến hiện tượng đảo giới từ nam thành nữ Khu vực đó được gọi là DSS (dosage -

sensitive sex reversal) (Muscatelli và ctv, 1994; Zanaria và ctv, 1994; trích dẫn bởi Haqq và Donahoe, 1998).

Gen dax - 1 cũng tương tác với sry trong giai đoạn đầu của sự xác định giới tính ở động vật hữu nhũ Tuy nhiên, ở nam, gen sry ức chế dax - 1 làm sự biệt hoá giới tính đực xảy ra Khi nào biểu hiện của dax - 1 vượt qua sry thì sự đảo giới xảy ra Còn ở nữ, dax - 1 hoạt động như là một yếu tố kháng tinh hoàn (Jimenez và Burgos, 1998;

trích dẫn bởi Delbridge và Marshall Graves, 1999)

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH

Cho đến nay, đã có rất nhiều phương pháp xác định giới tính động vật Mỗi phương pháp đều có ưu và khuyết điểm riêng Tùy vào mục đích mà ta tận dụng ưu điểm của phương pháp đó để đạt được thành công cao nhất Sau đây là một số phương pháp xác định giới tính phôi (trích dẫn bởi Van Vliet và ctv, 1989).

2.3.1 Kiểm tra hoạt động enzyme liên kết NST

Cơ sở của phương pháp này là sự biểu hiện hoạt động của các gen trên NST X trong việc mã hoá các enzyme, làm cho nồng độ enzyme con cái (XX) cao hơn nồng độ enzyme con đực (XY) Tuy rằng để cân bằng hoạt động các gen, NST X có những sự ức chế để chỉ còn một NST X biểu hiện gen ở con cái, nhưng sự ức chế chỉ thể hiện ở một giai đoạn nhất định nào đó Trước khi đến giai đoạn đó, nồng độ enzyme của 2 loại phôi sẽ khác nhau Dựa trên cơ sở này, Williams và ctv (1986), Monk và ctv (1988) đã phân biệt những phôi trước khi chuyển cấy từ những con chuột siêu bài noãn.

Ở phương pháp của Williams và ctv, phôi dâu (morula) đến phôi nang (blastocyst) được kiểm tra hoạt tính của enzyme liên kết NST X (glucose 6 phosphate dehydrogenase - G6PD) một cách trực tiếp Còn với phương pháp của Monk và ctv, các tế bào đơn của phôi được phân tách từ phôi 8 tế bào và được kiểm tra hoạt tính enzyme hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) liên kết NST X Cả hai phương pháp đều kiểm tra hoạt động enzyme liên kết NST sinh dưỡng như mẫu đối chứng để hạn chế sự thay đổi do biến dưỡng phôi Kết quả được đọc dựa theo màu đậm nhạt (đậm là con đực, nhạt là con cái).

Phương pháp này có một số hạn chế Phương pháp của Williams và ctv có tính độc đối với phôi vì nhuộm màu trực tiếp lên phôi Phương pháp của Monk và ctv cải thiện được khuyết điểm trên nhưng lại dùng hạn chế đối với phôi dâu nén hoặc phôi nang (không tách được tế bào phôi đơn) Hạn chế khác là giai đoạn bất hoạt một NST X để

tạo sự cân bằng trong biểu hiện gen chưa được biết chính xác nên có thể dẫn đến chẩn đoán sai lầm Cuối cùng, đôi khi mRNA được tạo ra và tích trữ ở đó mà chưa biểu hiện protein Đến khi mRNA biểu hiện thành protein thì mới được đánh giá Do vậy, hoạt tính enzyme lúc này là sự tích trữ hoạt động của bộ gen từ trước mà không phải là hoạt động của chính nó lúc đó Vì vậy, kết quả có thể sai lệch.

Tuy nhiên, phương pháp này giúp xác định một trong những chỉ tiêu đánh giá sự sống sót của phôi khi nghiên cứu ở các phương pháp khác.

2.3.2 Phản ứng miễn dịch đối với kháng nguyên chuyên biệt giới tính

Năm 1971, Golberg và ctv đã báo cáo một phương pháp huyết thanh học đối với kháng nguyên H - Y (histocompatibility Y antigen – kháng nguyên Y tương thích mô) Kháng thể của kháng nguyên này được phân lập từ huyết thanh của những con cái được ghép mảnh da con đực và các con này có thể loại thải mảnh da đó.

Phương pháp dựa trên kháng nguyên H – Y được tiến hành qua 2 cách: phương pháp gây độc tế bào và phương pháp miễn dịch huỳnh quang Ở phương pháp gây độc tế bào, nếu thấy những tế bào của phôi bị dung giải khi cho vào kháng huyết thanh H - Y và bổ thể (chỉ ở một mức độ nào đó) thì đó là phôi đực Phương pháp này dễ gây hư hại phôi đực Với phương pháp miễn dịch huỳnh quang, phôi sẽ phản ứng với kháng thể H - Y sơ cấp trong 30 phút Sau đó lại tiếp tục phản ứng với một kháng thể thứ cấp có gắn đuôi FITC (fluorescein isothiocyanate) Đánh giá giới tính phôi dưới kính hiển vi huỳnh quang dựa trên sự hiện diện của đuôi FITC Khuyết điểm của phương pháp này là kháng thể thứ cấp đôi khi gắn không chuyên biệt (gắn với mảnh vỡ tế bào quanh noãn hoàng chẳng hạn)

Bất lợi chính yếu của phương pháp miễn dịch là độ chính xác quá thấp vì nhiều lí do Thứ nhất, kháng nguyên H - Y là một kháng nguyên tương đối yếu cho nên kháng thể sinh ra không thể chuyên biệt một cách đầy đủ Kết quả gây ra phản ứng chéo giữa kháng thể với những kháng nguyên bề mặt tế bào khác Thứ hai, sự biểu hiện kháng nguyên H - Y có thể không bị giới hạn độc nhất trên phôi đực Thứ ba, tính chủ quan của người làm thí nghiệm trong việc phán đoán mức độ huỳnh quang của đuôi kháng thể.

Ngày nay, người ta cải tiến dần phương pháp này để tăng tính ứng dụng của nó vì ưu điểm lớn nhất của nó là có thể chuyển thành dạng kit để kiểm tra nhanh trước thời điểm chuyển phôi

2.3.3 Phân tích di truyền tế bào để xác định giới tính

Phương pháp phân tích di truyền tế bào còn được gọi là karyotyping (in nhân) được tiến hành bằng cách tạo sinh thiết phôi để lấy một số ít tế bào, nuôi chúng trong môi trường có colcemid giúp các tế bào tiến tới nguyên phân Sau đó, làm phồng tế bào để phân tán NST Các NST sẽ được cố định và nhuộm bằng phẩm nhuộm vĩnh cửu rồi đem quan sát dưới kính hiển vi NST Y được tìm thấy nhờ kích thước nhỏ bé của nó và là dị NST (King, 1984; Daiger và ctv, 1985; Picard và ctv, 1985).

Phương pháp này gặp phải hai khó khăn Một, phải có kỹ thuật cao và làm sao tạo được nhiều tế bào ở metaphase để NST dàn trãi rõ ràng Hai, đòi hỏi quá nhiều thời gian phân tích Để giải quyết những khó khăn này, người ta có nhiều cách nhưng tất cả các cách hoặc chỉ giảm áp lực thời gian hoặc chỉ tăng số tế bào ở metaphase nhưng lại vướng phải khó khăn còn lại.

Dù có rất nhiều cản trở cho khả năng áp dụng thương mại đối với phương pháp này, nhưng do độ chính xác cao của nó nên phương pháp phân tích di truyền tế bào thường được sử dụng để khẳng định kết quả của những kỹ thuật phân biệt giới tính khác.

2.3.4 Sử dụng đoạn dò DNA chuyên biệt NST Y để phân biệt giới tính phôi

Nguyên tắc cơ bản của kỹ thuật này là việc lai DNA tổng số lấy từ những tế bào sinh thiết phôi cần xác định giới tính với trình tự DNA chuyên biệt cho NST Y đã đánh dấu Kết quả lai dương tính xác định sự hiện diện của NST Y Vì thế, phôi là phôi đực.

Phương pháp này nhanh về thời gian và có thể tiến hành với một số ít tế bào cho nên không tồn tại các khó khăn như phương pháp di truyền tế bào.

Đoạn dò có thể được sử dụng từ các loại bán trên thị trường hoặc chuẩn bị theo các bước sau: phân lập NST Y, phân lập trình tự chuyên biệt Y, xác định số bản sao trình tự và định vị trình tự đoạn dò trên NST Y.

Khó khăn cần phải cải tiến của phương pháp này là các đoạn dò chuyên biệt Y thường là một phần chứ không toàn phần Nghĩa là có thể lai với một số NST khác Chính vì vậy, làm giảm độ chính xác của phương pháp này Những sự khám phá về các gen xác định giới tính trên NST Y sẽ giúp ngày càng hiểu rõ hơn về NST này và sẽ tạo ra được đoạn dò chuyên biệt hoàn toàn để cải thiện độ chính xác của kỹ thuật này.

Qua việc tìm hiểu một số phương pháp xác định giới tính, ta thấy đa số các phương pháp không mắc khuyết điểm này thì sẽ gặp phải khó khăn khác và ít có phương pháp

nào phù hợp với đòi hỏi của thương mại ngày nay Do vậy, công cuộc tìm kiếm phương pháp xác định giới tính phù hợp vẫn còn tiếp tục.

2.3.5 Phân biệt giới tính bằng kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR)

Vào năm 1985, Karl Mullis và ctv đã phát minh ra phương pháp tổng hợp DNA trong ống nghiệm Phát minh này nhanh chóng được ứng dụng rộng rãi và đã ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự chẩn đoán giới tính ở động vật.

2.3.5.1 Cơ sở phản ứng PCR dùng để phân biệt giới tính

Phương pháp PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) thực chất là một phương pháp tạo dòng trong ống nghiệm Nghĩa là nhằm mục đích thu nhận một lượng lớn bản sao của một trình tự xác định Cơ sở của phương pháp PCR chính là đặc tính hoạt động của các DNA polymerase Các polymerase này chỉ có khả năng tổng hợp một mạch mới từ khuôn kể từ một đoạn mồi (là một trình tự DNA ngắn) đã bắt cặp sẵn với khuôn Trong thực nghiệm, đoạn mồi là những trình tự bổ sung chuyên biệt cho đoạn DNA cần tổng hợp Phương pháp PCR gồm 3 bước: (1) biến tính phân tử DNA; (2) bắt cặp đoạn mồi với mạch khuôn; (3) tổng hợp mạch mới Ba bước này hợp thành một chu kỳ và chu kỳ này được lặp lại nhiều lần Chính vì vậy, đoạn DNA mục tiêu được nhân lên rất nhiều lần và có thể được quan sát thông qua những kỹ thuật phân tách và điện di DNA (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương , 2002).

Theo Schorder và ctv (1990), việc sử dụng đoạn mồi chuyên biệt NST Y trong phản ứng PCR giúp khuếch đại đoạn trình tự DNA chuyên biệt đực Sự hiện diện hoặc vắng mặt của sản phẩm PCR cho phép xác định giới tính của phôi

Thông thường, kèm với sự khuếch đại trình tự chuyên biệt NST Y, người ta nhân bản đồng thời một trình tự trên NST sinh dưỡng (Chen và ctv, 2004) hoặc một trình tự trên NST X (Alves và ctv, 2003) để làm yếu tố kiểm soát sự hiện diện của vật liệu và các điều kiện phù hợp cho phản ứng nhân bản

Theo Bondioli và ctv (1989), yêu cầu của một trình tự DNA đặc hiệu cho việc xác định giới tính của các phôi cần phải có:

- Trình tự DNA phải lặp lại, mục đích là làm tăng tối đa lượng nguyên liệu dùng cho phản ứng nhân bản.

- Trình tự lặp lại phải là trình tự đặc hiệu cho con đực

2.3.5.2 Một số công trình xác định giới tính bằng PCR

Sau hơn một thập niên phát triển, kỹ thuật xác định giới tính bằng PCR đã ngày càng chứng tỏ ưu thế nhanh, nhạy và phù hợp với thương mại Những đặc điểm ấy được thể hiện qua nhiều công trình được cải tiến của nhiều tác giả khác nhau.

Vào 1990, Schorder và ctv công bố công trình xác định giới tính phôi bò giai đoạn 6 - 7 ngày tuổi dựa trên phản ứng PCR Đầu tiên, tác giả thiết lập phản ứng bằng cách sử dụng các tế bào bạch cầu Sau đó, qui trình được áp dụng trên các mẫu sinh thiết có từ 1 - 3 tế bào thu nhận từ phôi Kết quả xác định giới tính bằng PCR được so sánh với phương pháp nhuộm NST và phương pháp lai tại chỗ Kết quả cho thấy phương pháp PCR cho hiệu quả phân tích cao hơn so với 2 phương pháp còn lại.

Vào 1994, Bredbacka và ctv nghiên cứu qui trình xác định giới tính bằng kỹ thuật PCR Trong công trình này, các tác giả thực hiện sinh thiết phôi ở giai đoạn phôi dâu và lấy đi 2 - 8 tế bào từ phôi để thực hiện việc xác định giới tính Trong nghiên cứu, các tác giả chỉ sử dụng đoạn mồi đặc hiệu cho giới tính đực mà không sử dụng đoạn mồi cho các trình tự chung của 2 giới để kiểm tra hiệu quả nhân bản của phản ứng Các tác giả cho rằng việc sử dụng đoạn mồi cho các trình tự chung này là không cần thiết nếu như đã thực hiện việc kiểm tra sự hiện diện của mẫu sinh thiết trước khi thực hiện phản ứng PCR Tuy nhiên, một số phản ứng cho kết quả không rõ ràng

Với mục tiêu chính là phát triển một phương pháp xác định giới tính nhanh cho một vài loài thú hữu nhũ, Pomp và ctv (1995) đã xác định chính xác 209 phôi heo con được thu thập từ 21 con nái tơ sau 10 - 11 ngày giao phối bằng kỹ thuật PCR Toàn bộ qui trình từ lúc nhập phôi đến lúc cho kết quả chỉ mất 6 giờ, cải thiện hơn rất nhiều so

với các phương pháp khác Gen được khuếch đại là sry và cặp gen được dùng làm đối chứng cho phản ứng là zfy / zfx Sau đó, ông đã áp dụng phương pháp xác định giới tính

này trên các loài hữu nhũ khác như: ngựa, mèo, chó, bò, dê,… và người nhưng kết quả không được chính xác và không đáng tin cậy như trên heo.

Vào 1999, Kitiyanant và ctv đã phân biệt giới tính từ một tế bào được tách từ phôi giai đoạn 2 tế bào bằng 2 phương pháp: karyotyping và PCR Kết quả cho thấy PCR có tỷ lệ thành công cao hơn so với karyotyping rất nhiều (100% so với 56%) và thời gian tiến hành thì ngắn hơn một nửa (3 giờ so với 8 giờ) Cũng vào năm này, Chen và ctv đã khẳng định độ nhạy và độ chính xác của phản ứng PCR xác định giới tính khi dùng 10 pg DNA, 100% thành công trên tế bào phôi của các giống Holstein, Jussay và

Swiss Những kết quả này đã chứng minh được ưu thế của phương pháp dùng PCR để phân biệt giới tính trong ứng dụng thương mại.

Bắt kịp với nhịp phát triển thương mại trong chẩn đoán giới tính phôi trước khi chuyển cấy, hãng Takara Bio (Nhật Bản) đã cho ra đời bộ kit chẩn đoán giới tính bò mang tên Cycleave PCRTM Bovine sexing kit (Takara bio Inc, 2005) Nguyên tắc hoạt động của bộ kit này là dựa trên sự khuếch đại đoạn gen Amelogenin theo kiểu real - time PCR Phương pháp này rất nhạy và nhanh, chỉ tốn 40 phút là hoàn thành quá trình chẩn đoán.

Để khẳng định khả năng áp dụng một qui trình PCR chẩn đoán giới tính trên nhiều giống bò khác nhau, năm 2003, Alves và ctv đã tiến hành phân biệt giới tính trên

2 nhóm giống bò Bos indicus và Bos taurus Kết quả là qui trình này đã thành công

100% khi áp dụng trên cả 2 nhóm giống

Ở Việt Nam, một số công trình xác định giới tính bằng kỹ thuật PCR đã và đang được tiến hành Đại diện là những công trình sau.

Năm 2002, Nguyễn Thị Thu Lan đã xác định giới tính heo nhà (Sus scrofa domestica) bằng cách khuếch đại đoạn DNA dài 166 bp đặc hiệu cho giới tính đực và

đoạn 447 bp đặc hiệu cho cả hai giới tính DNA mẫu được ly trích từ gan, bạch cầu, trứng, tinh dịch Kết quả cho thấy qui trình đã phân biệt được một số mẫu nhưng có một vài mẫu heo cái lại có kết quả giống như heo đực.

Năm 2003, Huỳnh Thị Lệ Duyên ứng dụng qui trình xác định giới tính bằng PCR của Nguyễn Thị Thu Lan (2002) để xác định giới tính phôi Kết quả là đã xác định giới tính của một phôi heo, nhưng một phôi khác thì không cho tín hiệu.

Ngoài ra, trung tâm Công Nghệ Sinh Học Phôi Việt Nam cũng đang thực hiện nhiều công trình xác định giới tính phôi bằng kỹ thuật PCR trên bò, dê, cừu, sao la,…

Các dẫn liệu ở Việt Nam cho thấy chưa có nghiên cứu về phân biệt giới tính ở các giống khác nhau trên bò.

PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

(1) Ly trích DNA từ mẫu cơ và lông, trong đó so sánh một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến chất lượng và số lượng DNA.

- So sánh độ tinh sạch và hàm lượng DNA ly trích từ mẫu cơ và lông (gồm gốc lông và ngọn lông).

- So sánh lượng DNA ly trích từ hai vị trí của lông: ngọn lông và gốc lông.

(2) Thử nghiệm chu trình nhiệt và nguồn cung cấp Taq polymerase.

- So sánh hai chu trình nhiệt.

- Thử nghiệm ba nguồn cung cấp Taq polymerase.

(3) Xác định giới tính ba giống bò dựa trên qui trình PCR tìm được.

(4) So sánh hai mức độ làm khô DNA từ mẫu cơ trong quá trình thu hồi DNA lên phản ứng PCR.

(5) So sánh hiệu quả PCR khi tiến hành trên DNA từ cơ và từ lông của cả ba giống.

3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH

Đề tài được tiến hành từ ngày 14-02-2005 đến ngày 06-07-2005 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh.

3.3 VẬT LIỆU

3.3.1 Nguồn mẫu chiết xuất DNA

Mẫu cơ vân và lông đuôi các giống bò ta Vàng, lai Sind và sữa Hà Lan được lấy từ lò mổ tập trung của huyện Dĩ An - Bình Dương.

3.3.2 Đoạn mồi

Theo Alves và ctv (2003), trên cánh dài của NST Y ở bò có trình tự chuyên biệt cho giống đực dài 3216 bp Trình tự này chứa đoạn lặp lại với sự tương đồng rộng rãi giữa các giống bò Từ trình tự lặp lại đó, thiết kế ra đoạn mồi RIV và đoạn mồi UIV nhằm khuếch đại đoạn DNA dài 655 bp qua PCR.

Ngoài ra, để kiểm chứng kết quả chính xác hay không, dựa vào trình tự chuyên biệt cho gen thụ thể androgen liên kết NST X Từ trình tự chuyên biệt này, người ta thiết kế hai đoạn mồi BTANRP1 (BTA1) và BTANRP2 (BTA2) nhằm khuếch đại đoạn

DNA dài 370 bp Band 370 bp phải hiện diện trên gel sau khi điện di như là sản phẩm đặc trưng chung cho cả bò đực lẫn bò cái.

Hai cặp mồi này được cung cấp bởi hãng IDT (Intergrated DNA Technologies).

Bảng 3.1 Trình tự các đoạn mồi (Alves và ctv, 2003)

3.4 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu

- Mẫu cơ: cắt một lượng nhỏ (5g) cơ vân bò vừa được giết mổ; chứa mẫu trong túi ni lông 5*10 cm; trữ mẫu trong thùng đá, mang về phòng thí nghiệm; trữ ở -70oC.

- Mẫu lông: lông đuôi bò được thu nhặt có cả phần gốc lẫn phần ngọn; rửa sạch dưới vòi nước máy; cắt thành 2 phần: phần gốc và phần ngọn lông; mỗi phần được trữ trong túi ni lông 10*20 cm ở -70oC.

3.4.2 Ly trích DNA

3.4.2.1 Ly trích DNA từ cơ * Qui trình ly trích

Sau khi rã đông mẫu cơ ở nhiệt độ phòng, ly trích DNA theo dẫn liệu của Lê Thị Thu Phương (2004).

- Phá vỡ tế bào

Lấy khoảng 0,1 g cơ vân cho vào eppendorf 1,5 ml; dùng chày nghiền nhuyễn mẫu Cho vào 60 μl dung dịch đệm ly trích và 3 μl proteinase K, ủ hỗn hợp ở 55oC trong 1 giờ

- Tinh sạch DNA

Thêm 375 μl sodium acetate 0,2 M vào hỗn hợp trên; vortex trong 10 giây Cho vào 200 μl hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1); vortex nhẹ; ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10oC.

- Thu hồi DNA

Lấy phần dịch nổi và chuyển vào tube 1,5 ml khác; cho thêm 1 ml ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều; ủ ở -20oC trong 2 giờ Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10oC,

lấy cặn, làm ráo Cho vào 180 μl TE 1X, vortex ; ủ ở 55C trong 15 phút Thêm 20 μl sodium acetate 2 M, trộn đều; tiếp tục cho vào 500 μl ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều; ủ ở -20oC trong 15 phút Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10oC, bỏ phần nổi, lấy cặn Rửa cặn bằng 1 ml ethanol 70 %; ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10oC, lấy cặn Làm khô cặn trong tủ ấm ở 55oC Hoà tan cặn bằng 200 μl TE 1X, ủ 55oC qua đêm; vortex cho tan cặn.

Sản phẩm DNA sau khi ly trích được trữ ở -20oC hoặc sử dụng ngay DNA được kiểm tra độ tinh sạch bằng cách đo mật độ quang (OD: optical density) ở bước sóng 260 nm và 280 nm bằng quang phổ kế (model HP 8453) Hàm lượng DNA được ước lượng theo công thức DNA (ng / μl) = 62,9*OD260nm – 36*OD280nm Mẫu được pha loãng 100 lần theo tỷ lệ 10 μl DNA gốc: 990 μl H2O cất khi đo OD Các mẫu DNA ly trích từ cơ có tỷ số OD260 nm / OD280 nm (tỷ số OD) trên 1,6 được sử dụng để tìm qui trình PCR phù hợp cho xác định giới tính.

* Thí nghiệm ảnh hưởng của mức độ phơi khô cặn

Trong quá trình thử nghiệm qui trình PCR để xác định giới tính, chúng tôi nhận thấy nếu làm quá khô DNA sau khi tủa trong cồn tuyệt đối thì PCR sẽ không cho hiệu quả cao (không xác định được chính xác giới tính đực cái) Chính vì vậy, chúng tôi đã bố trí thí nghiệm thu hồi DNA mẫu cơ với mức độ làm khô DNA là yếu tố thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành trên 11 mẫu cơ (3 mẫu ta Vàng, 6 mẫu lai Sind, 2 mẫu sữa Hà Lan)

Thí nghiệm gồm các bước: (1) ly trích DNA từ 0,2 g cơ vân với lượng dung dịch đệm ly trích và proteinase K gấp đôi; (2) tinh sạch DNA với lượng hóa chất gấp đôi lượng đã dùng theo dẫn liệu của Lê Thị Thu phương (2004); (3) chia dịch nổi thành 2 phần đều nhau trước khi tủa DNA trong cồn tuyệt đối lạnh; (4) phơi khô 11 mẫu theo mức độ I và 11 mẫu theo mức độ II.

Hiệu quả của hai mức độ phơi khô DNA này sẽ được kiểm tra thông qua ba chỉ tiêu Đó là tỷ số OD, hàm lượng DNA thu hồi và kết quả phân biệt giới tính bằng phản ứng PCR (theo qui trình PCR tối ưu đã được xác định).

Bảng 3.2 Mức độ phơi khô cặn DNA

Mức độ Biểu hiện cặn DNA Thời gian và nhiệt độ phơi(*)

I Cặn chuyển từ trắng đục sang trong và

II Vết cặn bị mờ đi, không quan sát rõ vị

trí cặn trên thành eppendorf Hơn 20 phút ở 55

(*) Thời gian chỉ có tính chất tham khảo, căn cứ chính yếu là biểu hiện cặn.

3.4.2.2 Ly trích DNA từ lông* Phương pháp ly trích

Trước khi ly trích, mẫu lông (ngọn lông và gốc lông) được xử lý Cân 0,15 g lông cho vào cối sành vô trùng Đổ N2 lỏng vào cối; dùng chày sành vô trùng nghiền lông thành dạng bột Chuyển nhanh chóng bột lông từ cối vào eppendorf 1,5 ml Đặt eppendorf chứa bột lông trong N2 lỏng hoặc trữ ở tủ -70oC ngay sau đó.

DNA từ lông sẽ được ly trích theo qui trình của Sauer và ctv (2000) Mỗi eppendorf chứa bột lông được cho thêm 20 µl dung dịch đệm Thêm 1 µl proteinase K (20 mg / ml) vào hỗn hợp trên rồi ủ hỗn hợp ở 55oC trong 30 phút Bất hoạt proteinase K bằng cách ủ hỗn hợp ở 100oC trong 5 phút.

Sau khi đã trích được DNA từ lông, tiến hành tinh sạch và thu hồi DNA theo qui trình như trên mẫu cơ DNA từ mẫu lông cũng được kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp đo mật độ quang với độ pha loãng là 10.

* Thí nghiệm so sánh DNA ly trích từ cơ và lông

Để so sánh độ tinh sạch và hàm lượng DNA ly trích được từ cơ và lông, thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố được tiến hành trên 10 mẫu DNA lông (gồm cả gốc lông và ngọn lông) và 54 mẫu DNA cơ Chỉ tiêu quan sát là tỷ số OD và hàm lượng DNA thu hồi.

* Thí nghiệm so sánh DNA ly trích từ ngọn lông và gốc lông

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố trên hai đối tượng gốc lông và ngọn lông của cả ba giống Số mẫu được kiểm tra là 5 mẫu cho mỗi loại Chỉ tiêu theo dõi là tỷ số OD và hàm lượng DNA thu hồi.