Đánh giá đa dạng tập đoàn giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá vi khuẩn Xanthomonas oryzae bằng kỹ thuật RAPD

Lúa là một trong những cây lương thực chính của hơn một nửa dân số trên thế giới (IRRI, 1994). Sản xuất lúa gạo chủ yếu tập trung ở các nước châu Á. Với điều kiện khí hậu nhiệt đới, Việt Nam

MỞ ĐẦU

Lúa là một trong những cây lương thực chính của hơn một nửa dân số trên thế giới (IRRI, 1994) Sản xuất lúa gạo chủ yếu tập trung ở các nước châu Á Với điều kiện khí hậu nhiệt đới, Việt Nam cũng là cái nôi của nền văn minh lúa nước Đã từ lâu cây lúa trở thành cây lương thực chủ yếu, có ý nghĩa đáng kể trong nền kinh tế và xã hội nước ta Năm 2003, sản lượng xuất khẩu gạo Việt Nam đạt 4,2 triệu tấn, tăng 11% so với năm 2000 [12]

Tuy nhiên, thực tế cho thấy có nhiều yếu tố làm giảm năng suất và chất lượng

lúa gạo Trong số đó, bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây nên là

một trong những yếu tố hạn chế sự phát triển của lúa, bệnh có khả năng lây nhiễm mạnh và rất khó khống chế Ở những nơi bệnh phát triển mạnh, năng suất lúa có thể giảm đến 60% Để phòng trừ bệnh bạc lá vi khuẩn người ta thường sử dụng thuốc hoá học, song việc dùng thuốc gây độc hại cho người sử dụng và làm ô nhiễm môi trường Hạn chế những độc hại trên thì việc gieo trồng các giống lúa kháng bệnh là có triển vọng nhất Nhưng thực tế, giống kháng chỉ tồn tại vài năm trong sản xuất sau đó nông dân phải thay thế bằng giống mới hoặc phun thuốc diệt bệnh, vì nòi bệnh có độc tính cao hơn phát triển [10]

Để khắc phục được bệnh bạc lá vi khuẩn một cách hiệu quả, các nhà chọn giống đang sử dụng các giống kháng bệnh lai với các giống có năng suất, chất lượng cao nhằm thu được các giống vừa kháng bệnh, năng suất cao và có chất lượng tốt Hiện nay, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã xác định được các giống lúa mang các gen kháng với các nòi khác nhau của bệnh bạc lá vi khuẩn Đây là những nguồn gen quí trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh cũng như các trong nghiên cứu đa dạng di truyền [4], [10]

Trong những năm 90, kỹ thuật sinh học phân tử đã trở thành công cụ rất có hiệu quả trong phân tích đa dạng, bảo tồn và tiến hóa giống loài ở sinh vật Nghiên cứu đa dạng trên đối tượng lúa là vấn đề được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm và kết quả là có rất nhiều công trình chỉ ra mức độ đa hình ở lúa khi sử dụng chỉ thị RAPD [14], [29] và RELP [18], [25] Trong các loại chỉ thị, thì chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) đơn giản, ít tốn kém nên được sử dụng rộng rãi hơn các chỉ thị AFLP, RFLP, SSR Sử dụng chỉ thị RAPD, các nhà khoa học có thể đánh giá và phân loại tập đoàn giống cây trồng một cách nhanh chóng và chính xác Trên thực tế, chỉ thị RAPD cho kết quả đặc trưng đối với từng cá thể và

có thể ứng dụng chỉ thị này để phân tích tính đa hình ADN nhờ sử dụng các đoạn mồi ngẫu nhiên Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề

tài: ‘‘Đánh giá đa dạng tập đoàn giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh

bạc lá vi khuẩn Xanthomonas oryzae bằng kỹ thuật RAPD” với mục tiêu: đánh

giá đa dạng phân tử của 36 giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá vi khuẩn, nhằm phục vụ việc xác định bố mẹ trong nghiên cứu lập bản đồ và chọn tạo giống lúa kháng bệnh.

Chơng 1 TổNG QUAN TàI LIệU

1.1 giới thiệu về cây lúa

Cây lúa thuộc họ hòa thảo (Poaceae), thân bụi, lá mềm Lúa trồng thuộc chi Oryzae với nhiều loài khác nhau Trong số 23 loài đã đợc phân loại thì chỉ có hai

loài là O glaberrima và O sativa đợc trồng cấy Loài O glaberrima đợc trồng chủ

yếu ở một số nớc miền Tây châu Phi Còn loài O sativa có ở khắp thế giới và tập trung phần lớn ở châu á Loài O sativa đợc chia làm 3 loài phụ: Indica, Japonica,

Javanica Lúa Indica đợc trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới; Japonica đợc

trồng chủ yếu ở các vùng ôn đới và cận ôn đới; Javanica chỉ đợc trồng ở một vài nơi

thuộc Indonesia (Khush, 1997).

Loài Oryza sativa có số nhiễm sắc thể là 2n = 24 Tám trong số 23 loài lúa dại có bộ gen ở thể tứ bội, còn lại đa số các loại lúa dại và lúa trồng hiện nay có bộ gen là thể lỡng bội (Khush, 1997)[7], [21]

Lúa phân bố khắp thế giới, trải từ vĩ độ 550 Bắc thuộc Trung Quốc đến 360 Nam thuộc Chi Lê Theo FAO (1999) diện tích đất canh tác lúa trên toàn thế giới khoảng 150 triệu ha Riêng Trung Quốc và ấn độ chiếm khoảng 50% diện tích trồng lúa và 56% sản lợng lúa toàn cầu Châu Phi có diện tích trồng lúa gần bằng diện tích trồng lúa của Việt Nam, nhng sản lợng lúa lại thấp hơn từ 2 đến 3 lần [2], [7]

1.2 Bệnh bạc lá vi khuẩn ở lúa (Xanthomonasoryzae)

Bệnh bạc lá (còn gọi là bệnh cháy bìa lá) là một trong những bệnh hại lúa nguy hiểm do vi khuẩn

Xanthomonas oryzae gây nên là một trong những bệnh hại lúa nguy hiểm Bệnh xuất hiện lần đầu tiên ở Nhật Bản năm 1884 Năm 1960, bệnh lan truyền

sang, sau nguồn bệnh đợc tìm thấy ởcác vùng khác ở

châu Phi, Australia, Mỹ và một số nớc Mỹ La Tinh ở Việt Nam, bệnh phổ biến ở tất cả các vùng trồng lúa trong cả nớc, từ vùng núi cao đến ven biển Bệnh có thể làm giảm năng suất từ 6 - 60% Bệnh phá hại trong cả vụ Đđông xuân, hè Hè thu và vụ mMùa.,

đặc biệt, bệnh gây hại nặng trong các tháng nhiệt độ cao Ma bão là điều kiện để

Hình1: Triệu chứng của bệnh bạc lá lúa vi khuẩn do

Xathomonas oryzae gây ra

bệnh lây lan và phát triển mạnh Trong những năm 1970 - 1975, bệnh phát triển và gây thiệt hại nặng cho ở lúa ở khắp các tỉnh phía Bắc [2].

1.2.1 Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa (Xanthomonas aryzae)

Vi khuẩn Xanthomonas oryzae có hình gậy ngắn, hai đầu tròn, là vi khuẩn

Gram (-) và không hình thành bào tử Các tế bào vi khuẩn đợc bọc trong màng nhầy và liên kết với nhau thành một khối tơng đối vững chắc ngay cả trong nớc Trên môi trờng nhân tạo, khuẩn lạc có màu vàng nhạt và có thể sống trong phạm vi pH 4,0 - 8,8 Nhiệt độ thích hợp nhất cho vi khuẩn sinh trởng là 260C - 300C, nhiệt độ tối thiểu là 550 C - 100C và nhiệt độ tối đa là 400C [9], [11]

Vi khuẩn xâm nhập có tính chất thụ động và có thể xâm nhiễm qua thủy khổng, lỗ khí ở trên mép lá, đặc biệt qua vết thơng xây xát trên lá Khi đã tiếp xúc với bề mặt có màng nớc, vi khuẩn dễ dàng di động và xâm nhập vào bên trong qua các lỗ khí, qua vết thơng để nhân lên về mặt số lợng, sau đó theo các bó mạch dẫn lan rộng đi Trong điều kiện ma ẩm, trên bề mặt vết bệnh sẽ tiết ra những giọt dịch vi khuẩn và thông qua sự va chạm giữa các lá lúa, bệnh có thể lan truyền từ lá này sang lá khác để tiến hành xâm nhiễm lặp lại nhiều lần trong thời kỳ sinh trởng của cây lúa [6], [9].

Hiện nay, có rất nhiều nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá, phân bố ở nhiều nớc trên thế giới Các nhà khoa học có thể phân loại các nòi X oryzae theo tính gây bệnh của

chúng Nhìn chung, các nòi vi khuẩn khá khác nhau về tính gây bệnh và trở nên độc hơn khi truyền lặp đi lặp lại qua các thế hệ của giống kháng bệnh, nhng tính gây bệnh vẫn không thay đổi hoặc giảm đi khi xâm nhiễm qua các giống lúa mẫn cảm [11].

1.2.2 Triệu chứng của bệnh bạc lá vi khuẩn

Bệnh bạc lá vi khuẩn thờng phát sinh dới dạng các sọc vàng kéo dài từ mép lá cách đỉnh vài cm Trên phiến lá, vết bệnh lan rộng theo cả chiều dài và rộng, có mép viền hình sóng rồi trở nên vàng sau vài ngày Khi bệnh tiến triển, vết bệnh lan rộng phủ kín cả mặt lá, chuyển từ trắng sang xám nhạt do sự sinh trởng của các nấm hoại sinh. Đối với các giống cảm nhiễm, vết bệnh lan rộng tới bẹ lá và có thể phát triển

xuống tận phần dới của bẹ lá, làm phiến lá bị héo và cuộn lại trong khi lá vẫn còn xanh, sau đó toàn bộ phiến lá có thể bị héo rồi khô đi

ở các ruộng lúa bị bệnh nghiêm trọng, hạt cũng có thể bị nhiễm bệnh Trên vỏ hạt xuất hiện các đốm màu nhạt, xung quanh có mép viền dạng giọt dầu Khi hạt

còn non và xanh các vết bệnh lộ rõ, khi bông chín vết bệnh sẽ có màu xám,, hoặc

trắng hoặc vàng nhạt [6], [19].

1.2.3 các yếu tố ảnh hởng đến sự phát triển của bệnh

Trong dự báo bệnh bạc lá, yếu tố khí hậu là đối tợng để phân tích Các nhà khoa học phát hiện thấy rằng mức độ nhiễm bệnh tơng quan với tổng lợng ma, mức độ ngập lụt, gió mạnh và độ sâu nớc tới Nhiệt độ tơng đối cao trong thời kỳ lúa sinh trởng có thể làm tăng bệnh, song mùa hè quá nóng và khô là điều kiện hạn chế bệnh.

Kỹ thuật trồng trọt cũng là một trong những điều kiện quan trọng ảnh hởng đến sự phát sinh, phát triển bệnh, song cũng rất phức tạp vì một mặt nó ảnh hởng tới sự phát sinh phát triển của cây lúa - làm tăng hay làm giảm tính chống chịu, mặt khác nó ảnh hởng tới tiểu khí hậu đồng ruộng Trong các yếu tố kỹ thuật chăm sóc thì phân bón có ảnh hởng rõ rệt nhất tới sự phát sinh, phát triển của bệnh Cụ thể là bón đạm quá nhiều, bón thúc muộn, thiếu lân, kali và magie đều làm tăng bệnh ở những nơi đất chua, úng ngập đặc biệt ở những vùng đất nhiều mùn, hàng lúa bị chắn nắng thì bệnh bạc lá có thể phát triển mạnh hơn [6].

Trong tất cả các giai đoạn sinh trởng, cây đều có thể bị nhiễm bệnh nhng ở mức độ khác nhau tuỳ từng giai đoạn sinh trởng Nói chung, từ thời kì mạ đến khi lúa đẻ nhánh là thời kỳ bệnh tơng đối ít hơn so với giai đoạn cuối đẻ nhánh Giai đoạn lúa làm đòng - trỗ - chín sữa là giai đoạn rất mẫn cảm với bệnh, hiện tợng này thể hiện khá rõ nét trên các giống lúa ngắn ngày, chịu phân, có năng suất cao, cấy trong vụ Chiêm xuân và vụ Mùa [11].

1.2.4 Tác hại của bệnh bạc lá lúa vi khuẩn

Bệnh bạc lá vi khuẩn đã làm giảm năng suất lúa gạo hằng năm ở Châu á xuống 60% Ví dụ ở Nhật những năm gần đây, có khoảng 300.000 - 400.000 hecta lúa bị ảnh hởng bởi bệnh này và năng suất giảm 20 - 50% ở những cánh đồng nhiễm bệnh ngiêm trọng ở Indonesia, sản lợng lúa còn thấp hơn so với ở Nhật; còn ở ấn độ, hàng triệu hecta lúa nhiễm bệnh nghiêm trọng làm cho năng suất giảm từ 6 - 60% ở Việt Nam, bệnh bạc lá đợc phát hiện từ lâu trên các giống lúa mùa cũ, đặc biệt từ năm 1965 trở lại đây bệnh thờng xuyên phá hoại nghiêm trọng ở các vùng trồng lúa [6], [19].thì sao?

1.2.5 Các biện pháp phòng trừ

Căn cứ vào đặc điểm sinh học của vi khuẩn gây bệnh, các nhà khoa học đã đa ra những biện pháp phòng trừ tổng hợp nh: xử lý hạt giống trớc khi gieo nếu lô hạt bị nhiễm bệnh, bón phân đúng kỹ thuật và đúng giai đoạn, ruộng lúa cần điều chỉnh mức nớc thích hợp, chú ý vệ sinh đồng ruộng hoặc có thể sử dụng thuốc hóa học để hạn chế sự phát sinh, phát triển của bệnh [6].

Cho đến nay, việc sử dụng giống chống chịu bệnh vẫn là biện pháp có hiệu quả nhất vì giảm đợc chi phí do sử dụng thuốc hóa học và bảo vệ môi trờng tốt hơn Chính vì vậy, việc chọn tạo ra những giống lúa kháng bệnh bạc lá luôn là mục tiêu hàng đầu của các nhà tạo giống trên thế giới cũng nh ở Việt Nam [24], [30].

Cùng với sự phát triển của khoa học hiện đại các nhà nghiên cứu tìm thấy khoảng 24 gen kháng bệnh bạc lá ở nhiều loài lúa hoang dại và các giống lúa địa ph-ơng Gen kháng đợc thống nhất có tên là Xa + số thứ tự, ví dụ nh Xa1, Xa2 Trong số đó, Xa21 có phổ kháng rộng và đợc chú ý nhiều trong công nghệ chuyển gen hiện nay [20], [27].

1.2.6 Một số thành tựu trong chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá vi khuẩn

Trong 50 năm gần đây, các nhà khoa học đã phát triển nhiều kỹ thuật thanh lọc ngân hàng gen đối với tính trạng chống chịu vi khuẩn, côn trùng gây hại cây trồng, xác định nguồn cung cấp gen kháng Với phơng pháp chọn giống truyền thống, các nhà khoa học đã tạo ra nhiều giống cây trồng kháng bệnh bạc lá và đợc gieo trồng với diện tích hàng triệu ha Và c họn giống ngoài đồng ruộng, khảo nghiệm và tạo các giống lúa chống chịu bệnh từ lâu đã đ ợc thực hiện ở nhiều n ớc trên thế giới Không hiểu ý câu này?

ở Nhật Bản, gần đây các nhà khoa học đã chọn đợc nhiều giống lúa kháng bệnh đợc sử dụng để lai tạo ra các giống mới nh giống Sengoku 4, Magatama, Zensho 26, Norin 27 Tuy nhiên, kết quả kiểm tra ngoài đồng ruộng cho thấy cha chọn đợc giống có tính chống chịu cao với các nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá mới đợc giám định gần đây.

Năm 1968, Sakaguchi và CS đã khảo nghiệm 863 giống lúa đợc trồng phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới và phát hiện giống lúa Lead của Miến Điện, TKM6 và Nigeria 5 chống chịu khá với hầu hết các nhóm vi khuẩn gây bệnh bạc lá thuộc các nòi khác nhau [9], [11].

ở việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu để chọn tạo giống lúa mang gen kháng bệnh bạc lá Nh ở Viện Lúa Đồng bằng sông Ccửu lLong, bằng phơng pháp đánh

Duyên hải Trung Bộ cho thấy các giống lúa: Cà Đung, Ba Túc, Thơm Lung, Vệ Phích, Lúa Trắng, Nếp Hoa Vàng, Lúa Thớc, Quinkes 85 và Seraup kechil 30 có gen kháng Xa13; gen kháng Xa5 đợc tìm thấy trên giống Nàng Tri, Trắng Lùn, Be Ren,

Giàu Dumont; giống Lúa Sóc, Lúa Mùa 2, Trắng Quãng, Trắng Phớc, Tàu Hơng, Nàng Sậu có gen kháng Xa4 [4].

1.3 ứng dụng kỹ thuật RAPD - PCR trong nghiên cứu đa hình ADN

1.3.1 Phản ứng PCR

Kỹ thuật nhân bản ADN đặc hiệu dựa vào phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) đợc Karry Mullis hoàn thiện vào giữa những năm 80 đã góp phần tạo ra một cuộc cách mạng trong sinh học phân tử Kỹ thuật PCR là một phơng pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu và phân tích các gen Sử dụng kỹ thuật PCR có thể tạo ra một số lợng lớn các bản sao của đoạn ADN cần tổng hợp mà không phải tách và nhân dòng Thực chất PCR là một phơng pháp in vitro vi tro cho phép nhân bản nhanh một đoạn ADN nào đó mà chỉ cần một khối lợng mẫu ban đầu hạn chế [8], [5] Phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:

+ Giai đoạn 1 (Biến biến tính): ADN đợc biến tính ở nhiệt độ khoảng 950C trong thời gian khoảng 1 phút, khi đó các liên kết hidro bị đứt và sợi ADN kép tách thành hai sợi đơn.

+ Giai đoạn 2 (Ggắn mồi): ở nhiệt độ từ 300C đến 650C trong khoảng 30 giây đến 1 phút thì các mồi bắt cặp với sợi ADN khuôn theo nguyên tắc bổ sung ở hai đầu đoạn ADN cần nhân Nhiệt độ của bớc gắn mồi tùy thuộc vào từng loại mồi cụ thể, đợc tính toán dựa trên nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạn mồi [3], [5].

Công thức tính nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạn mồi:

Tm = 81,5 + 16,6(log10 {J+}) + 0,41(%G + C) - (600/I) - 0,63(%FA)Trong đó: {J+}: nồng độ của các cation hóa trị I

FA: chất dùng để gây biến tính ADN I: chiều dài của mồi

+ Giai đoạn 3 (tổng hợp ADN): ở nhiệt độ khoảng 720C, trong khoảng thời gian từ 30 giây đến nhiều phút (tuỳ thuộc vào chiều dài đoạn ADN cần tổng hợp), khi đó, enzym Taq polymerase hoạt động và quá trình tổng hợp ADN diễn ra trên những đoạn giữa cặp mồi theo chiều từ 5’- 3’

Một chu kỳ gồm 3 bớc trên đợc lặp đi lặp lại nhiều lần và qua mỗi lần làm tăng gấp đôi số mẫu lần trớc Sự tăng lợng mẫu này theo cấp số nhân, nên sau n chu kì số mẫu thu đợc là:

A = x.2n

Trong đó A: Tổng số bản sao ADN

x: Số lợng phân tử ADN làm khuôn ban đầu n: Số chu kỳ

Các thành phần cơ bản của một phản ứng PCR gồm: ADN khuôn, hai đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN, Taq polymerase, hỗn hợp bốn tiền chất deoxynucleotit, dung dịch đệm chứa một số cation hóa trị 1, ion Mg2+ và dung môi (nớc khử ion khử trùng).

- Enzym Taq polymerase:

Enzym Taq polymerase là enzym chịu nhiệt, đợc tách từ vi khuẩn suối nớc nóng Thermus aquaticus Enzym Taq có trọng lợng phân tử là 94 kDa và không mất

hoạt tính ở nhiệt độ cao trong giai đoạn gây biến tính ADN, nhng hoạt tính của enzym Taq giảm 50% sau 150 phút ở nhiệt độ 92,50C; sau 40 phút ở nhiệt độ 950C và sau 5 - 6 phút ở nhiệt độ 970C Nếu nhiệt độ tăng lên tới 950C trong 20 giây để biến tính ADN kép thành sợi đơn thì hoạt tính enzym Taq còn lại 65% sau 50 chu kì phản ứng.

Nồng độ enzym Taq tối u cho phản ứng PCR là 0,5 - 2,5 đơn vị; nhng nếu nồng độ enzym quá cao sẽ làm giảm hiệu xuất xúc tác của phản ứng Ngoài ra, nồng độ Mg2+ và dNTP cũng ảnh hởng đến hoạt tính của enzym Hiện nay, có nhiều loại polymerase chịu nhiệt khác có chức năng riêng biệt và hoàn thiện hơn nh Tth polymerase tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động nh một

enzym phiên mã ngợc khi có mặt của ARN khuôn và ion Mn2+.- ADN khuôn (template):

ADN khuôn là vật liệu khởi đầu cho phản ứng PCR nên đòi hỏi phải có độ tinh sạch cao ADN khuôn có thể là sợi đơn hoặc sợi đôi của chuỗi ADN hayARN đợc biết trớc trình tự ở hai đầu để thiết kế mồi Thông thờng, nồng độ của ADN khuôn đợc đa vào phản ứng PCR khoảng 10 - 500 ng.

- Đoạn mồi (primer):

Các đoạn mồi thực chất là các oligonucleotit dài khoảng 4 - 10 bazơ (đối với mồi ngẫu nhiên) hoặc khoảng 12 - 24 bazơ (đối với mồi đặc trng) Nồng độ mồi thích hợp để tiến hành phản ứng PCR là từ 0,1 - 0,5 àM Lợng mồi đa vào phản ứng PCR phải phù hợp với lợng ADN cần tổng hợp (thờng 106 phân tử ADN cần 108

phân tử primer) Nếu nồng độ mồi quá thấp thì mồi sẽ hết trớc khi số chu kì kết thúc, còn nồng độ mồi quá cao thì sẽ dễ làm tăng sản phẩm không đặc hiệu.

Các đoạn mồi cần có tính đặc thù để làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng Mồi phải đợc thiết kế sao cho không đợc bổ trợ lẫn nhau, số lợng 4 loại bazơ nitơ trong mồi nên xấp xỉ nhau, lợng G - C giữa hai mồi phải bằng nhau, tránh những vùng trình tự không bình thờng nh polypurin hoặc polyprimidine hay các trình tự lặp

- Các nucleotit (dNTPs):

Là hỗn hợp của bốn loại deoxyribonucleotit (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp ADN Tuỳ thuộc vào mục đích nghiên cứu, các nhà khoa học còn có thể sử dụng một số nucleotit đã đợc thay đổi nh gắn thêm biotin hoặc digoxigenin Nồng độ phản ứng của các dNTP thờng dùng vào khoảng 200 mM mỗi loại, tuy nhiên ở nồng độ dNTP thấp (10 - 100 mM) Taq ADN polymerase hoạt động chính xác hơn Hơn nữa, nồng độ tối u của chúng phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố nh:

+ Nồng độ Mg2+ + Nồng độ chất mồi

+ Độ dài của sản phẩm đợc khuyếch đại + Số chu kỳ của phản ứng

- Dung dịch đệm (buffer)

Thành phần của dung dịch đệm phụ thuộc vào loại enzym polymerase đợc sử dụng Trong dung dịch đệm quan trọng nhất là ion Mg2+ Ion Mg2+ làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của ADN mạch đôi, tạo ra phức chất tan với dNTPs để hình thành cơ chất mà enzym polymerase có thể nhận ra, điều này rất cần thiết cho quá trình liên kết của các dNTP Nồng độ Mg2+ trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng biến đổi từ 0,5 - 5,0 mM (nồng độ này có thể thay đổi khi cần thiết) Nồng độ ion Mg2+ quá thấp sẽ làm giảm khả năng tổng hợp của enzym polymerase, còn nếu nồng độ quá cao sẽ tạo ra những phân đoạn không đặc hiệu.

Nhìn chung nồng độ MgCl2 có ảnh hởng nhiều tới hiệu quả và tính đặc thù của phản ứng Ngoài Mg2+ còn một số chất khác trong dung dịch đệm nh AMSO, DMSO, formamide đợc thêm vào nh các chất phụ gia nhằm tạo ra các sản phẩm PCR có kính thớc lớn [3].

Kỹ thuật PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích hệ gen của sinh vật vì nó có khả năng tạo ra một lợng lớn trình tự ANDN đặc hiệu từ bất cứ cơ thể nào PCR đợc sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau nh: xác định trình tự trực tiếp từ đoạn đợc nhân, nhân bản quần thể mARN để làm mẫu lai, xác định các trình tự đặc hiệu từ cADN hay th viện gen, xác định sinh vật chuyển gen, tạo đột biến định hớng [1].

1.3.2 Kỹ thuật RAPD và ứng dụng

Trong những năm gần đây, nhiều kỹ thuật mới ra đời dựa trên nguyên tắc của PCR cho phép ta xác định đợc tính đa dạng của hệ gen với nhiều u điểm nh kỹ thuật AFLP, SSR, RFLP, RAPD

- Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) cho phép ta

phát hiện đợc tính đa dạng về chiều dài các đoạn ADN đợc nhân bản chọn lọc - cắt ra bởi enzym giới hạn Sử dụng kỹ thuật này có thể nhân cùng một lúc một cách đặc trng với số lợng lớn các đoạn ADN có kích thớc giới hạn Kỹ thuật AFLP kết hợp đ-ợc những u điểm của RFLP và RAPD nên nó có hiệu quả trong việc phát hiện đa hình ADN Ngoài ra, kỹ thuật này có thể phân tích tính đa hình một cách nhanh chóng, ổn định và đáng tin cậy [3].

- Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphic ADN - đa hình về chiều dài của các đoạn ADN đợc cắt ngẫu nhiên bởi các enzym giới hạn): Sử dụng kỹ thuật RFLP có thể tạo nên các đoạn cắt khác nhau đợc phân biệt bằng ph-ơng pháp điện di Nhợc điểm của kỹ thuật này là quy trình phức tạp, cồng kềnh, khó tự động hoá, tốn kém và sử dụng chất đồng vị phóng xạ gây nguy hiểm cho ngời thao tác [3], [8].

- Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) hay còn gọi là vi vệ tinh (microsatellites), là một đoạn ADN có sự lặp lại của một trật tự nucleotit đơn giản nào đó Kỹ thuật SSR cho phép phát hiện đợc tính đa hình về độ dài các trật tự nucleotit đơn giản Nhợc điểm của kỹ thuật SSR là tốn kém về tiền của, công sức trong việc xây dựng cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình (để xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cần tách dòng và đọc trình tự một số lợng lớn các đoạn ADN hệ gen chứa đoạn lặp lại) [8], [3].

- Kỹ thuật RAPD (còn đợc gọi là kỹ thuật phân loại phân tử): đợc sử dụng để phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các giống cây trồng hay giữa các cá thể, phục vụ cho công tác lai tạo giống hoặc phân loại Ưu điểm của kỹ thuật này là nhanh, rẻ, đơn giản và giúp xác định tính đa dạng sinh học, nguồn gốc di truyền của các giống động vật, thực vật, vi sinh vật.

Năm 1990, William và CS đã phát triển kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic ADN) trên cơ sở PCR Về cơ bản, kỹ thuật này sử dụng những đoạn mồi ngắn khoảng 4 - 10 nucleotit không đặc trng để tiến hành phản ứng PCR Nhng đối với mỗi đối tợng, ta phải tiến hành sàng lọc để chọn lọc đợc một số mồi thích hợp [1] Sản phẩm PCR khi dùng với mồi ngẫu nhiên thờng đa dạng, có chiều dài từ 100 - 5000 nucleotit và khi điện di trên gel agarose đợc phân tách thành các phân đoạn khác nhau Tính đa dạng thu đợc nhờ kỹ thuật RAPD là đáng tin cậy vì khi có sự thay đổi một bazơ nitơ nào đó thì nó sẽ ngăn cản sự tiếp hợp của mồi với ADN khuôn sự mất đoạn nhiễm sắc thể hoặc sự thêm bớt điểm gắn mồi cũng nh sự xen vào một gen nào đó sẽ làm thay đổi kích thớc của đoạn ADN đợc nhân bản mỗi đoạn mồi có thể tạo ra một hoặc một vài sự đa dạng, có thể phát hiện đợc và cho ra phổ điện di đặc trng Kỹ thuật RADP đợc sự dụng trong các mục đích nghiên cứu đa hình di truyền, lập bản đồ gen liên kết và phân tích con lai F1.

u điểm của kỹ thuật RADP là không cần biết trình tự đoạn ADN cần nghiên cứu, quy trình tiến hành nhanh, chỉ cần một lợng nhỏ ADN khuôn Bên cạnh đó, chỉ cần một bộ mồi ta có thể sử dụng đợc với các loài khác nhau trong khi các mẫu dò RFLP chỉ có thể dùng đợc cho các loài có quan hệ gần gũi nhau Tính đa dạng thu đợc từ các chỉ thị RAPD đợc đánh giá cao hơn so với kỹ thuật RFLP và cho phép phát hiện đợc tính đa dạng ngay cả trong các đoạn chứa các trật tự nucleotit lặp lại Nhợc điểm của chỉ thị này là: chỉ thị RAPD có tính chất trội do đó những gen điều khiển tính trạng nào đó có tính lặn sẽ khó tìm thấy sự đa hình trên gel điện di Hơn nữa, RAPD có tính chất ngẫu nhiên nên việc lặp lại phân tích điện di để tìm liên kết gen thờng không thống nhất [3].

Các nghiên cứu gần đây cho thấy RAPD là một kỹ thuật có hiệu quả trong việc xác dịnh kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền loài và lập bản đồ di truyền Kỹ thuật RAPD đợc sử dụng để nhận biết và phân loại các giống cây khác nhau, sự đa dạng di truyền giữa lúa Indica và Japonica, xác định

sự đa hình của các cây tái sinh có nguồn gốc mô sẹo, tế bào huyền phù và tế bào trần

Yang và Quiros đã sử dụng 28 đoạn mồi có độ dài 10 bp để nghiên cứu sự khác biệt của 23 giống cần tây và chúng đợc chia thành 3 nhóm Kết quả này cũng phù hợp khi dùng 6 chỉ thị protein để phân loại các giống cần tây trên (Yang và Quiros, 1993) Tơng tự nh vậy, nhiều tác giả đã dùng RAPD để lập cây chủng loại phát sinh (phylogenic tree) của các loài cây nh ngô, đu đủ, hành tây, xoài, cỏ đinh lăng [26], [31] …

Dựa trên sự xuất hiện hay biến mất của các phân đoạn ADN khi điện di sản phẩm RAPD đợc quan sát thấy ở các cá thể khác nhau và đợc đánh giá theo qui ớc 1 = xuất hiện và 0 = biến mất Một bảng gồm các giá trị 0 và 1 đợc thiết lập từ các cá thể nghiên cứu sẽ cho phép tính ra hệ số tơng đồng di truyền của các cặp theo Nei và Li.

Trong quá trình thiết lập mối quan hệ giữa các loài hay nhóm loài, một số tác giả (Apostol và CS, 1993) đã xây dựng kỹ thuật phân nhóm thông qua các biểu đồ RAPD (RAPDLOT) Thực chất kỹ thuật này gồm 3 bớc:

+ Bớc 1: So sánh từng cặp đối tợng trong nghiên cứu bằng cách tính toán khoảng cách quan hệ giữa chúng

+ Bớc 2: Lập một ma trận gồm tất cả những giá trị tính toán đợc trớc đó+ Bớc 3: Giải ma trận và biễu diễn thành một biểu đồ đặc trng [17]

Ngày nay, các nhà nghiên cứu đã thiết lập đợc phần mềm máy tính để tự động vẽ nên biểu đồ mối quan hệ hay độ tơng đồng di truyền của các đối tợng nghiên cứu sau khi nhập dữ liệu về các phân đoạn đợc nhân bản của các cá thể NTSYS pc version 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) là tên của một chơng trình thuộc kiểu trên để lập ra biểu đồ hình cây Biểu đồ hình cây thu đợc sẽ thể hiện mức độ gần nhau của các cá thể cho phép đánh giá đợc mối quan hệ di truyền giữa các cá thể đợc nghiên cứu Chơng trình này cho phép giảm bớt thời gian nghiên cứu và có độ chính xác cao nên nó là một phần mềm có hiệu quả trong việc phân tích kỹ thuật RAPD.

Chơng 2. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu

2.1 Đối tợng nghiên cứu

2.1.1 Đối tợng nghiên cứu

Đối tợng nghiên cứu tính đa dạng ADN là 36 giống lúa có nguồn gốc, tính kháng khác nhau với kháng bệnh bạc lá vi khuẩn có nguồn gốc và tính kháng bệnh khác nhau do do Bộ môn Di truyền Miễn dịch, Viện Khoa học Kkỹ thuật Nnông nghiệp Việt Nam cung cấp (trình bày nh trong bảng 1, điểm đánh giá tính khángchỉ mới d/nhiễm của các giống lúa chỉ với một nòi vi khuẩn phổ biến ở vùng Đồng bằng sông Hồng).

Bảng 1 Danh sách tập đoàn giống lúa kháng bệnh bạc lá vi khuẩn

1OM3499-5Việt Nam4,02OM3242-50Việt Nam5,03OM3496-9Việt Nam5,04NTCD1-12Việt Nam5,05NTCD1-16Việt Nam5,06Tám tiêuViệt Nam5,57Tám Xuân BắcViệt Nam5,58Nếp đenViệt Nam3,39Nếp cái hoa

Việt Nam5,510Nếp sớmViệt Nam3,311HT1Trung Quốc7,712N87Đài Loan7,7

14IRRI1545IRRI3,015IRRI20IRRI5,016IRRI8IRRI5,017KUNTLANĐài Loan57,018ZENITHĐài Loan57,0

20MILYANG23Hàn Quốc7,021MILYANG42Hàn Quốc3,022SUWION290Hàn Quốc9,023BJ1ấn độ7,70

24Tẻ tépViệt Nam7,70

25BL89Việt Nam3,026BL28Việt Nam3,027BL31-97ấn độ1,028BBL72-99ấn độ3,029KBL75-99ấn độ3,030KBL53-99ấn độ5,031Khang dânTrung Quốc57,032Chiêm hơngTrung Quốc9,033Q5Trung Quốc7,70

34DÔ115Việt Nam57,035KB1Việt Nam7,70

36TN1Việt Nam7,70Ghi chú 1: Kháng cao 3: Kháng 5: Kháng vừa 7: Nhiễm vừa 9: Nhiễm nặng

2.1.2 Hoá chất và thiết bị sử dụng:

- Hoá chất và thiết bị máy móc: Hoá chất và thiết bị sử dụng đợc ghi kèm tên hãng

sản xuất cho tiện theo dõi: Taq ADN polymerase (Perkin-Elmer); Máy tổng hợp oligonucleotit tự động - Gene Assemble (Pharmacia, Thụy Điển); Máy đo quang phổ: Diode Array Spectrophotometer (Hewlett Parkard, Mỹ); Máy ly tâm AvantiTM 30 (Beckman, Mỹ)…

- Các mồi sử dụng trong phản ứng RAPD: Các mồi ngẫu nhiên sử dụng cho việc

phân tích genom của 36 giống lúa kháng bệnh bạc lá lúa vi khuẩn do Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp Trình tự các mồi dài 10 nucleotit đợc thiết kế theo Monna và CS (1994).

Bảng 2: Danh sách 21 mồi ngẫu nhiên dùng trong phân tích tập đoàn 36 giống lúa kháng bệnh bạc lá vi khuẩn.

Máy ly tâm lạnh (Sigma), máy PCR (Thermal Cycler PTC 100 hãng MJ), máy điện di (Biorad), máy đo quang phổ Model 8425A (Hewlett Packard), máy chụp ảnh Gel Doc (Pharmacia) …

12 Mồi OPP19 5’GGGAAGGACA 3’13 Mồi UBC391 5’GCGAACCTCG 3’14 Mồi V8 5’GGACGGCGTT 3’15 Mồi Q14 5’GGACGCTTCA 3’16 Mồi GN38

17 Mồi C19 5’GTTGCCAGCC 3’18 Mồi O10 5’TCAGAGCGCC 3’19 MồiO13 5’GTCAGAGTCC 3’20 Mồi O18 5’CTCGCTATCC 3’21 Mồi I13 5’CTGGGGCTGA 3’

C

Chuẩn bị cây mạ: Hạt lúa đợc ngâm, ủ cho nảy mầm Các mầm mạ có độ dài 1,5 - 2,0 cm đợc đặt vào cốc nuôi cây có đờng kính 7 cm, cao 6 cm, dới đáy cốc có lót giấy lọc Mỗi cốc đặt 15 - 20 mầm Nuôi mầm mạ trong dung dịch MS pha loãng 10 lần ở điều kiện ánh sáng bình thờng, hai ngày thay dung dịch một lần Khi cây mạ đợc 3 - 5 lá thật thì tiến hành thu lá để dùng ngay hoặc bảo quản ở tủ lạnh sâu - 800C Ta thu lá non vì lá non có ít sản phẩm trao đổi chất gây trở ngại cho khả năng hoà tan của ADN thu đợc.

2.2.2 Tách chiết ADN tổng số từ lá lúa

Quy trình tách chiết ADN tổng số từ lá lúa theo phơng pháp của Egnin và CS (1998).

a) Hoá chất sử dụng

Tris - HCl 1M, pH = 8,0; 5M NaCl; 0,5 EDTA; PVP; 5% SDS; RNase 10mg/ml; 3M CH3COONa, pH 5,3 hoặc pH 7,0; TE (10mM Tris, pH = 8,0 + 1 mM EDTA, pH = 8,0); Isopropanol: Phenol: Chlorofom: Isoamin (25:24:1); cồn 80%.b) Pha đệm tách chiết ADN

Bảng 3 Nồng độ của hoá chất tách ADN tổng số.

Nồng độ dung dịch stock chuẩnNồng độ cần phaTrong 50ml

c) Quy trình tách chiết ADN tổng số từ lá lúa

- Thu 0,1 - 0,2 g lá lúa non, nghiền nhanh trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ cho đến khi mẫu có dạng bột mịn Nghiền trong nitơ lỏng đảm bảo mẫu đợc nghiền triệt để, ADN thu đợc có dạng sứa, có phân tử lợng cao, không đứt đoạn.

- Thêm 0,8 - 1,0 ml dung dịch đệm tách ADN vào mẫu lá đã nghiền, trộn đều bằng cách đảo ngợc nhẹ.

- Giữ trong đá 5 phút, thêm 0,8 - 1,0 ml dung dịch Phenol: Chlorofom: Isoamin = 25: 24: 1, đảo đều cho đến khi dung dịch có màu trắng sữa, ủ trong đá 5 phút.

- Ly tâm 13.000 vòng/phút, chuyển dịch ở phía trên sang một ống eppendorf 1,5 ml mới, bớc chuyển phải nhẹ nhàng tránh khuấy cặn.

- Thêm 20 àl CH3COONa 3M, lắc đều, thêm 400 àl Isopropanol để tủa lại.- Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi và thêm 0,5 ml cồn 70%.- Ly tâm 13.000 vòng/phút, bỏ phần dịch nổi và làm khô bằng máy Speed - Vac.- Hoà tan lại ADN trong 100 àl TE, để qua đêm ở 40C.

- Bảo quản ADN ở - 200C.

2.2.3 Phơng pháp xác định hàm lợng và độ sạch của ADN

a) Điện di trên gel agarose

- Pha agarose 0,8% trong TAE 1X, đun nóng, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 600C, đổ vào khuôn gel có cài lợc.

- Sau 30 phút rút lợc ra, đổ đệm chạy điện di TAE 1X ngập bản gel 1- 2 mm.

- Lấy 2 àl ADN mẫu + 1 àl thuốc nhuộm + 7 àl H2O trộn đều, dùng pipet tra hỗn hợp mẫu vào giếng.

- Chạy điện di ở 80V trong 30 phút.

- Nhuộm gel: bản gel chạy xong đợc nhuộm trong Ethidium bromide 0,5 àg/ml trong 10 phút, rửa sạch bằng nớc.

- Soi gel trên đèn UV và chụp ảnh.b) Đo bằng máy đo quang phổ hấp thụ

Đo trên máy đo quang phổ có chơng trình xử lý trên máy vi tính- Đo mẫu ở bớc sóng λ = 260 nm.

- Đo mẫu ở bớc sóng λ = 280 nm.

- Chỉnh cân bằng máy: dùng nớc khử ion vô trùng để làm chuẩn.

- Kiểm tra máy: đo một mẫu ADN có nồng độ chuẩn đã biết trớc (ADN của thực khuẩn thể λ).

- Đo mẫu: pha loãng 200 lần theo công thức: lấy 995 àl nớc cất + 5 àl ADN mẫu vào cuvet lắc đều, đặt vào máy đo.

- Sau mỗi lần đo phải rửa sạch cuvet bằng nớc cất.- In kết quả đo đợc.

- Từ đó, ta tính đợc hàm lợng và độ sạch của ADN + Hàm lợng ADN (ng/àl) = 50 x HSPL x OD260

+ Độ sạch ADN = OD260/ OD280

Trong đó HSPL: hệ số pha loãng 50: hằng số

OD260: chỉ số đo đợc ở bớc sóng 260 nm OD280: chỉ số đo đợc ở bớc sóng 280 nm Nếu độ sạch ADN = 1,8 - 2,0 thì mẫu đợc coi là sạch.

2.2.4 Phân tích số liệu RAPD

a) Đoạn mồi

Đoạn mồi ngẫu nhiên sử dụng cho việc phân tích genome của lúa trong nghiên cứu này gồm 21 mồi Operon Các đoạn mồi có kí hiệu và trình tự là:

Bảng 2: Danh sách 21 mồi Operon dùng trong phân tích tập đoàn 36 giống lúa kháng bệnh bạc lá vi khuẩn.

ba) Phản ứng PCR - RAPD

- Mỗi ống phản ứng PCR có 25 àl dung dịch chứa 1X đệm PCR; 2,5 mM MgCl2; 100 àl 4dNTPs; 200 nM đoạn mồi; 0,125 đơn vị Taq polymerase và 10 - 100 ng ADN khuôn.

- Trộn đều hỗn hợp thu đợc (thao tác trong đá để đảm bảo các hóa chất không bị mất hoạt tính).

- Tiến hành nhân bản trong máy PCR - Thermal Cycler PTC 100 theo chu trình:+ Bớc 1: 940C trong 1 phút

+ Bớc 2: 920C trong 1 phút+ Bớc 3: 350C trong 1 phút+ Bớc 4: 720C trong 1 phút+ Bớc 5: 720C trong 10 phút+ Bớc 6: giữ ở 40C

1 Mồi RA31 5 AACCGACGGG 3’ ’

2 Mồi RA32 5 GGGGGTCGTT 3’ ’

3 Mồi RA36 5 TACCACCCCG 3’ ’

4 Mồi RA40 5 GGCGGACTGT 3’ ’

5 Mồi RA45 5 TACCACCCCG 3’ ’

6 Mồi RA46 5 CCAGACCCTG 3’ ’

7 Mồi RA50 5 GCTGTGCAG 3’ ’

8 Mồi RA142 5 CAATCGCCGT 3’ ’

9 Mồi RA143 5 TCGGCGATAG 3’ ’

10 Mồi RA159 5 GTCCACACGG 3’ ’

11 Mồi OPA13

12 Mồi OPP19 5 GGGAAGGACA 3’ ’

13 Mồi UBC391 5 GCGAACCTCG 3’ ’

20 Mồi O18 5 CTCGCTATCC 3’ ’

21 Mồi I13 5 CTGGGGCTGA 3’ ’