Đánh giá tính đa dạng của các virus gây bệnh xoan lá cà chua ở Việt Nam thong qua tách dòng, xác định và so sánh trình tự đoạn gen mã hóa cho protein vỏ

Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) là cây rau được gieo trồng rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới và có giá trị kinh tế cao. Quả cà chua ngoài tác dụng làm các món ăn, làm quả tươi tráng miệng, nước gi

MỞ ĐẦU

Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) là cây rau được gieo trồng rộng rãi ở

nhiều nơi trên thế giới và có giá trị kinh tế cao Quả cà chua ngoài tác dụng làm các món ăn, làm quả tươi tráng miệng, nước giải khát và những dạng thực phẩm chế biến cung cấp dinh dưỡng, vitamin, và chất khoáng, còn có tác dụng chữa bệnh thiếu vitamin C, bệnh về tim mạch, ung thư Diện tích trồng cà chua liên tục tăng lên trong những năm gần đây Từ năm 1990 đến 2002 diện tích cà chua trên thế giới từ 2,8 triệu ha tăng lên 3,7 triệu ha và sản lượng từ 76 triệu tấn tăng lên 100 triệu tấn Ở Việt Nam, năm 1996 diện tích trồng cà chua khoảng 8 nghìn ha thì đến năm 2001 lên đến 18 nghìn ha, đóng góp hàng trăm tỉ đồng vào nền kinh tế quốc dân [1].

Năng suất cà chua bị giảm sút đáng kể do nhiều nguyên nhân như: giống, điều kiện canh tác, chế độ chăm sóc, bệnh do nấm, vi khuẩn, tuyến trùng Trong đó bệnh do vi rút được xác định là tác nhân gây hại nghiêm trọng Bệnh do vi rút không những làm giảm năng xuất mà còn làm giảm chất lượng của sản phẩm Xoăn lá cà

chua do vi rút (Tomato yellow leaf curl virus-TYLCV) gây ra là bệnh phổ biến và gây

thiệt hại nặng nề nhất ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới [24].

Việc sử dụng các biện pháp canh tác, cách li vùng bị bệnh, loại bỏ cây bị bệnh, phun thuốc trừ sâu để phòng trừ bệnh vi rút vừa hiệu quả thấp vừa gây ảnh hưởng đến cây trồng, môi trường và cả con người Những biện pháp này chỉ làm giảm sự lan truyền của bệnh và mang tính chất phòng chứ không thể ngăn chặn bệnh một cách triệt để Hiện nay, cùng với sự tiến bộ của Công nghệ sinh học, tạo cây chuyển gen kháng lại vi rút được coi là một biện pháp hữu hiệu nhất để ngăn chặn và hạn chế tác hại do vi rút gây ra đồng thời đáp ứng yêu cầu phát triển một nền nông nghiệp sạch và bền vững Vấn đề đặt ra là các giống cây chuyển gen thường có tính kháng đặc hiệu Các giống cây chuyển gen được tạo ra bằng cách sử dụng các vật liệu di truyền từ các vi rút gây bệnh (gen CP, gen mã hoá replicase ) chỉ kháng lại được các dòng vi rút gây bệnh có gen được sử dụng để tạo cây chuyển gen hoặc là các dòng vi rút có quan hệ di truyền gần gũi Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã

tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Đánh giá tính đa dạng của các virus gây bệnh xoan

lá cà chua ở Việt Nam thong qua tách dòng, xác định và so sánh trình tự đoạn

gen mã hóa cho protein vỏ” với mục đích thu được hiểu biết sâu sắc ở mức độ di

truyền phân tử của các vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua của Việt Nam từ đó làm cơ sở cho việc hoạch định các chiến lược thích hợp cho nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng bệnh xoăn lá cà chua ở Việt Nam.

Chơng 1 Tổng quan tài liệu

1.1 Đặc điểm phân loại, nguồn gốc, sự phân bố và giá trị sử dụng của cây Cà chua

1.1.1 Phân loại

Cà chua thuộc họ Cà (Solanaceae), chi Lycopersicon Chi này gồm 12 loài, tất

cả đều có nguồn gốc từ châu Mĩ Đã có nhiều tác giả đa ra các hệ thống phân loại cho cà chua, nhng cho đến nay hệ thống phân loại của Breznep (1955) đợc sử dụng rộng rãi và đơn giản nhất [21] Chi Lycopersicon có 2 chi phụ:

- Chi phụ Eriopersicon: quả luôn xanh, có sọc tía, có lông, hạt nhỏ Chi này có

5 loài hoang dại:

Lycopersicon hisrutum HumbLycopersicon peruviarum Mill Lycopersicon cheesmaniiLycopersicon chilenseLycopersicon glandulosum

- Chi phụ Eulycopersicon: quả chín đỏ hoặc vàng, hoa to Chi này có 2 loài: Lycopersicon esculentum: cà chua thông thờng

Lycopersicon pimpinellifolium: cà chua bán hoang dại

1.1.3 Giá trị sử dụng

Cà chua rất dễ trồng ở Việt Nam, do điền kiện thời tiết thuận lợi, có thể trồng cà chua ở hầu hết các tỉnh và đợc trồng gần nh quanh năm Vụ sớm từ tháng 7 đến tháng 12, vụ chính từ tháng 9 đến tháng 2 năm sau, vụ muộn từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau, vụ xuân hè từ tháng 1 đến tháng 6 [6].

Trong quả cà chua chín có nhiều chất dinh dỡng nh: đờng, vitamin A, vitamin C và các chất khoáng quan trọng nh: canxi, sắt, phospho, kali, magiê, v.v Thành…phần hoá học trong quả cà chua chín gồm có: nớc (94-95%), chất khô (5-6%), trong đó: 55% đờng, 21% chất không hoà tan trong rợu (nh protein, xenlulôzơ, pectin, polisaccarit), 12% axit hữu cơ (nh xitric, malic, galacturonic, pirolidoncacboxilic), 7% chất vô cơ và 5% các chất khác (nh carotenoit, axit ascorbic, chất dễ bay hơi, amino axit, v.v ) [1].…

Cà chua không những đợc dùng nh rau cung cấp vitamin, chất khoáng mà còn có nhiều tác dụng về mặt y học Trong cà chua có chất licopen (thành phần tạo màu đỏ của cà chua) có khả năng giúp giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch Theo Võ Văn Chi (1997), quả cà chua có vị ngọt, tính mát, có tác dụng tạo năng lợng, làm cân bằng tế bào, khai vị, giải nhiệt, chống hoại huyết Hàng ngày, mỗi ng… ời sử dụng 100-200 g cà chua sẽ thỏa mãn nhu cầu vitamin và chất khoáng cần thiết [3].1.2 Bệnh xoăn lá cà chua do vi rút

1.2.1 Đặc điểm của bệnh xoăn lá cà chua do vi rút

Bệnh xoăn lá cà chua do vi rút (Tomato yellow leaf curl) rất phổ biến ở khu

vực Đông Nam châu á, các nớc Trung Cận Đông và Đông Phi Đây là một trong những bệnh do vi rút gây thiệt hại nặng nề nhất cho cà chua Theo thống kê của Polston và Anderson (1997), từ năm 1988 đến năm 1995, bệnh đã làm giảm 5% đến 95% sản lợng cà chua ở nớc Cộng hòa Dominica, Venezuela và một số nớc ở Trung Mĩ, làm thiệt hại cho nền kinh tế tổng cộng 140 triệu đô la Mĩ [28] Bệnh lan truyền qua vật truyền trung gian là loài bọ phấn (Bemisia tabaci)

Bọ phấn chích hút nhựa cây chủ yếu ở ngọn và lá non, mang TYLCV [4]

Cây bị bệnh có triệu chứng xoăn ngọn lá, làm cho lá co quắt, cây thấp nhỏ, hoa phát triển kém, dễ bị rụng Cây còn nhỏ nếu bị nhiễm bệnh sẽ còi cọc, không thể phát triển [8].

ở Việt Nam, bệnh xoăn lá cà chua do vi rút phát triển mạnh trong vụ cà chua sớm và vụ xuân hè Khi nhiệt độ không khí từ 25-300C, độ ẩm hơn 70%, bọ phấn nở rộ, mật độ bọ phấn trên một cây tăng dẫn đến tăng khả năng truyền bệnh [8]

1.2.2 Vi rút gây bệnh xoăn lá cà chuab)

Hình 1 Bọ phấn Bemisia tabaci [34]

Hình 2 Biểu hiện hình thái của bệnh xoăn lá trên cây cà chua

a) Cây đối chứng không bị bệnh; b) Cây bị nhiễm bệnh xoăn lá; c) Ruộng cà chua bị bệnh xoăn lá

Vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV)

thuộc họ Geminiviridae, chi Begomovirus Dựa vào sự tơng đồng về trình tự

nucleotit, tác nhân truyền bệnh và phổ vật chủ, họ Geminiviridae đợc chia thành bốn

chi: Mastrevirus, Begomovirus, Curtovirus và Topocuvirus [37] Trong đó Begomovirus là chi có số lợng loài lớn nhất trong họ, tác nhân truyền bệnh là bọ

phấn (Bemisia tabaci), vật chủ là cây 2 lá mầm nh: đậu, da hấu, bông, hồ tiêu, thuốc

lá, khoai tây và cà chua [25] Khác với các chi khác trong họ đều có hệ gen gồm…một vòng ADN sợi đơn, hệ gen của các loài trong chi Begomovirus tìm thấy ở châu

Mĩ có thể gồm hai vòng ADN sợi đơn Trong khi đó, hệ gen của những loài tìm thấy ở châu á, châu âu và châu Phi có thể có một vòng hoặc hai vòng ADN sợi đơn [36]

1.2.2.2 Đặc điểm cấu tạo

Geminivirus đợc Goodman mô tả lần đầu tiên vào năm 1977 TYLCV có

dạng hình chày, kích thớc khoảng 18 nm x 30 nm Lớp protein vỏ có trọng lợng khoảng 28-34 x 103 đvc gồm 22 capsom giống nhau, mỗi capsom gồm 5 phân tử protein vỏ [25].

TYLCV lần đầu tiên đợc phân lập hoàn chỉnh vào năm 1991 ở Sardinia [19] và Israel [26] Hệ gen gồm một vòng ADN sợi đơn, có kích thớc khoảng 2,8 Kb, gồm sáu gen nằm trong hai vùng dịch mã ngợc chiều, ngăn cách bởi một vùng liên gen có khoảng 300 nucleotit Họ Geminiviridae có vùng khởi đầu sao chép nằm

trong vùng liên gen đều có trình tự là TAATATTAC (vùng có dấu chấm đen) [25], [37].Hình 3 ảnh chụp vi rút xoăn lá cà chua dới kính hiển vi điện tử [17]

Bốn gen: C1, C2, C3, C4, có chiều dịch mã ngợc chiều với hai gen V1 và V2 Trong đó gen V1 mã hóa loại protein cần thiết cho sự tạo vỏ ngoài genom, sự lan truyền và nhận ra vectơ truyền nhiễm ; gen C1 mã hóa loại protein cần thiết cho quá trình sao chép của cả hai vùng dịch mã ; gen C2 mã hóa protein có vai trò hoạt hóa quá trình phiên mã gen V1 và V2 ; gen C3 mã hóa loại protein có tác dụng hoạt hóa quá trình sao mã và cùng với gen C1 tăng cờng khả năng phân chia hệ gen của vi rút ; gen C4, V2 mã hóa protein liên quan đến sự gây bệnh đối với thực vật và sự vận chuyển của vi rút [37].

1.2.2.3 Sự đa dạng về hệ gen của các vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua

Bởi những thiệt hại nghiêm trọng do TYLCV gây ra, nghiên cứu về TYLCV đợc nhiều nớc quan tâm nh: Thái Lan, Australia, Trung quốc, Brazil, Mĩ, ấn Độ, Đài Loan, Nhật Bản Hiện nay, ngoài loại vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua có một vòng…ADN sợi đơn ngời ta còn phát hiện ra loại vi rút có hai vòng ADN sợi đơn kí hiệu là vòng ADN-A và vòng ADN-B [15], [27] Trong đó, vòng ADN-A gồm các gen mã hoá protein cần thiết cho sự sao chép và lắp ráp của vi rút, còn vòng ADN-B gồm các gen mã hoá protein cần thiết cho sự lan truyền của vi rút [36].

Hình 4 Cấu trúc hệ gen của TYLCV có một vòng ADN sợi đơn [25]

Có loại vi rút cũng có hai vòng ADN sợi đơn, một là vòng ADN-A còn vòng thứ hai không phải là vòng ADN-B mà vòng ADN-B đợc thay thế bằng một vòng ADN vệ tinh, gọi là vòng ADN-beta [20] Trình tự nucleotit của vòng ADN-beta đợc phân lập ở những vùng khác nhau có sự khác nhau rõ rệt Ngời ta còn thấy rằng, với những cây cà chua bị nhiễm TYLCV có vòng ADN-beta thì biểu hiện bệnh nặng hơn cây nhiễm TYLCV không mang vòng ADN-beta [40] Chowda Reddy và cộng sự (2005) đã tiến hành thí nghiệm với 103 mẫu cà chua từ những vùng trồng cà chua chính ở ấn độ, có 81 mẫu cho kết quả dơng tính với vi rút TYLCV Trong đó 65 mẫu, hệ gen vi rút gồm hai vòng ADN sợi đơn, một vòng là ADN-A, vòng thứ hai hoặc là vòng ADN-B hoặc là vòng ADN-beta [13] Li và cộng sự (2004) đã tiến hành thí nghiệm với 14 mẫu cà chua thu từ ba huyện trong tỉnh Vân Nam, Trung Quốc Cả 14 mẫu đều cho kết quả dơng tính với TYLCV và những chủng TYLCV này thuộc vào bốn nhóm khác nhau Nhóm I và III hệ gen đều có vòng ADN-beta Khi phân lập hoàn chỉnh trình tự nucleotit vòng ADN-beta với ba mẫu ở nhóm III, thì ngời ta thu đợc những trình tự ADN-beta khác với những vòng ADN-beta công bố trớc đó [23] ở Nhật Bản Shimizu và Ikeami (1999) đã tiến hành phân lập hệ gen của chủng vi rút TYLCV có một vòng ADN sợi đơn Qua kết quả so sánh cho thấy trình tự nucleotit của chủng vi rút phân lập giống nhất là với TYLCTwV (TYLCV ở Đài Loan) (76%), so với các chủng vi rút khác thì chúng có sự khác nhau tơng đối [32] Trình tự các gen cấu trúc của vi rút nh gen C1, C2, C3, C4, V1, V2 mã hoá các protein chức năng tơng ứng của vi rút cũng có sự khác nhau ở những loại vi rút xâm nhiễm ở cây trồng khác vùng Có loại vi rút có vùng trình tự các nucleotit hoàn toàn không giống với những vùng tơng ứng của những loại vi rút đã phát hiện trớc đó [39] Xie và Zhou (2003) ở Trung Quốc đã phân lập hoàn chỉnh vòng ADN-A của

Hình 5 Cấu trúc hệ gen của TYLCV gồm hai vòng ADN sợi đơn [30]

TYLCV thì kết qủa cho thấy ADN-A giống nhất với TYLCThV (TYLCV ở Thái Lan) giống 84% Vòng ADN-A của chủng vi rút phân lập có vùng từ nucleotit 74-2071 là giống 95% với TYLCThV, vùng nucleotit 2071-2457 giống 91% với PeLCBDV (Pepper leaf curl virus from Bangladesh), và vùng còn lại thì rất khác với những chủng vi rút đợc công bố trình tự trớc đó [39] Qua những nghiên cứu trên chúng ta có thể thấy rằng các vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua có độ đa dạng rất lớn về bộ gen Ngoài ra các nghiên cứu này còn cho thấy có xảy ra sự tái tổ hợp của các chủng TYLCV để hình thành các chủng mới.

1.2.2.4 Cơ chế lây truyền của vi rút

TYLCV xâm nhập vào cây trồng qua bọ phấn trắng (Bemisia tabaci) Khi

nhiễm vào tế bào thực vật, phần ADN vòng đơn của vi rút sẽ xâm nhập vào nhân của tế bào chủ và sử dụng những nguyên liệu của vật chủ để sao chép và tổng hợp ra protein vỏ, hoàn thiện cấu trúc vi rút Theo Revington và cộng sự (1989), sự sao chép hệ gen của vi rút bắt đầu từ một vị trí đặc biệt trong vùng mở đầu gồm khoảng 30 nucleotit và diễn ra theo 2 hớng quanh phân tử, tạo thành hai vòng khép kín [28] Một nuclease cắt một trong hai vòng và đầu 3’-OH của sợi bị cắt sẽ làm mồi để gắn thêm các nucleotit Sợi nguyên vẹn bổ sung đợc làm khuôn Nh vậy, đầu 5’-OH bị thay thế và sau đó đợc sao chép Theo cách này phân tử sợi kép đợc tổng hợp có thể dài gấp nhiều lần NST của vi rút, sau đó bị cắt thành những NST của hạt vi rút Các NST này sẽ đợc dịch mã để tạo các protein cần thiết cho vi rút [35].

Hình 6 Sơ đồ minh họa cơ chế phiên mã ADN sợi đơn dạng vòng [35]

1.3 cây chuyển gen kháng vi rút và một số thành tựu đ đạt đã ợc trong cải tiến giống cây trồng bằng công nghệ gen

1.3.1 Cơ chế kháng bệnh vi rút của cây chuyển gen

Cây trồng có tính kháng khác nhau với các loại vi rút khác nhau, nó có thể là vật chủ hoặc không là vật chủ của những loại vi rút xác định Vi rút có thể xâm nhiễm vào cây chủ, lan truyền gây bệnh làm cây chủ giảm hay mất khả năng sinh tr-ởng, phát triển, sinh sản Trong quá trình tiến hóa, vi rút dần hình thành những cơ chế bảo vệ khỏi tính kháng tự nhiên của vật chủ để dễ dàng xâm nhập và gây bệnh [5].

Với cây chuyển gen, chúng ta đã tạo ra tính kháng tích cực và hiệu quả cho cây trồng chống lại vi rút Có nhiều cách giải thích về tính kháng của cây chuyển gen, theo Baulcombe (1996) tính kháng của cây chuyển gen gọi là tính kháng có đ-ợc nhờ chính yếu tố gây bệnh-PDR (pathogen-derived resistance) [12] Gen đợc chuyển vào cây là những gen có chức năng khác nhau của vi rút nh: gen mã hóa protein vỏ, gen mã hóa protein vận chuyển , hay gen đ… ợc thiết kế có đầu là những đoạn lặp lại ngợc chiều PDR có thể có cơ chế thông qua protein (post translation), sản phẩm của những gen đợc chuyển vào sẽ cản trở quá trình tạo lớp protein vỏ, làm quá trình lắp ráp không xảy ra đợc và cản trở sự lan truyền của vi rút trong cây PDR có thể có cơ chế thông qua ARN (post transcription) Mặc dù cơ chế của nó cha đợc xác định rõ, xong có thể là liên quan đến ARN sợi đôi và những sợi ARN đơn ngắn, RdRps, ARN helicases và RNase [16] Khi vi rút TYLCV xâm nhập, trong tế bào xuất hiện tín hiệu bảo vệ, sợi ARN đôi đợc tạo thành từ những ARN của vi rút và ARN của những gen chức năng của vi rút TYLCV đã đợc chuyển vào cây trớc đó d-ới tác dụng của RdRp Sợi ARN này sẽ bị cắt thành những đoạn ARN đôi ngắn, với hai đầu có 2-3 nucleotit nhô ra, dới tác dụng của Dicer (một nuclease) Những đoạn ARN ngắn này có tác dụng làm mồi để tổng hợp nên những sợi ARN đôi, dựa vào những ARN lạ làm khuôn (chính là những ARN của vi rút), và nó còn tạo phức RNase, khi kết hợp với protein elF2C (nhân tố khởi đầu), ARN helicase, Dicer (một loại nuclease) Phức này có thể cắt những ARN đôi tiếp tục lại tạo thành những ARN đôi ngắn với hai đầu có 2-3 nucleotit nhô ra, ARN này lại làm mổi, để loại bỏ dần những ARN lạ Nh vậy theo mô hình kháng này thì hiệu quả của nó phụ thuộc vào độ tơng đồng của những đoạn ARN làm mồi với ARN lạ

1.3.2 Một số thành tựu đã đạt đợc trong cải tiến giống cây trồng bằng công nghệ gen

Việc chuyển gen vào cây trồng cho đến nay không là vấn đề còn phải tranh cãi nữa mà đã trở thành kĩ thuật thông dụng trong tạo giống cây trồng Đã có hơn 50 loại gen đã đợc chuyển nạp vào cây trồng và ít nhất có khoảng 400 loại cây mang gen biến nạp đợc trồng thử ở điều kiện đồng ruộng nh cà chua, bông, cải dầu, ngô, khoai tây [2], với các đặc tính nh… : kháng vi rút, kháng côn trùng, chín chậm, chống chịu chất diệt cỏ, tăng hàm lợng chất dinh dỡng [10] Đến hết năm 2002 đã có trên…52,6 triệu ha cây trồng chuyển gen đợc canh tác trên thế giới [18] Các quốc gia hiện nay trồng các cây chuyển gen nh: Achentina, úc, Bungary, Canada, Trung Quốc, Pháp, Đức, Mexico, Rumani, Tây Ban Nha, Nam Phi, Urugoay, Brazil và Mỹ [10] Bên cạnh những vấn đề cha rõ về cây chuyển gen nh: mối nguy cơ trong việc vô tình đa những chất gây dị ứng hoặc làm giảm dinh dỡng sản phẩm, khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ hàng hoang dại , thì chúng ta không…thể phủ nhận những giá trị kinh tế của nó đem lại Do các đặc tính u việt của nó, cây chuyển gen ngày càng đợc nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi.

1.4 Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứu bệnh vi rút

1.4.1 Kĩ thuật PCR

Kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction-chuỗi phản ứng trùng hợp nhờ Polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 Đây là kĩ thuật nhân nhanh một đoạn ADN, dựa vào một ADN khuôn (là một đoạn ADN mang đoạn ADN ngắn cần nhân) và cặp mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn ADN ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ enzym ADN polimerase (ngày nay sử dụng phổ biến loại enzym bền với nhiệt nh Taq polimerase) xúc tác nối

dài mồi để thành mạch mới, trong sự có mặt của các nucleotit tự do (dNTP), Mg2+….Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp Mỗi chu kì gồm ba bớc:

+ Bớc 1 -Biến tính ADN- ADN đợc biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ Tm

của phân tử, thờng khoảng 94-950C trong vòng từ 30 giây đến 1 phút, để tạo ADN sợi đơn.

+ Bớc 2 -Bắt cặp- Mồi bắt cặp với ADN, ở nhiệt độ từ 40-700C, tùy thuộc vào tỉ lệ và số lợng từng loại nucleotit của đoạn mồi và kéo dài khoảng 30 giây-1 phút.

+ Bớc 3 -Tổng hợp chuỗi ADN- Nhiệt độ đợc tăng lên 720C, giúp cho enzym

Taq polimerase hoạt động tốt nhất, để tổng hợp mạch ADN mới bổ sung theo chiều

5’-3’ bắt đầu từ vị trí gắn mồi, thời gian tổng hợp tùy thuộc vào độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại, từ 30 giây đến vài phút.

Số lợng ADN sau mỗi một chu kì tăng lên gấp đôi Vậy sau n chu kì thì số ợng chuỗi ADN sẽ là 2n [7].

l-1.4.2 Kỹ thuật tách dòng

Tách dòng thực chất là nhằm thu một gen hay một trình tự ADN với số lợng lớn Đầu tiên, là gắn một gen mong muốn vào vectơ tách dòng để tạo nên vectơ tái tổ hợp sau đó chuyển vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ Trong các tế bào chủ, các vectơ tách dòng đợc nhân lên một số lợng lớn bản sao của gen ban đầu Ta sẽ thu đ-ợc ADN qua các bớc tách chiết Tách dòng gồm 5 bớc:

+ Chọn và xử lí vectơ: Vectơ tách dòng là các phân tử ADN có kích thớc nhỏ cho phép gắn các gen, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào Vectơ đợc xử lí bằng các enzym giới hạn, và hai đầu chỗ mối cắt đợc xử lí để không thể nối lại với nhau

+ Xử lí ADN cần đợc tạo dòng: Chọn những đoạn ADN có kích thớc gần giống nhau và tơng ứng với vectơ đã chọn, sau đó ADN đợc xử lí để có hai đầu tơng ứng với vectơ (bằng cách xử lí với cùng loại enzym với vectơ).

+ Tạo vectơ tái tổ hợp: Trộn vectơ tách dòng và các đoạn ADN cần gắn với một tỉ lệ xác định, có sự tham gia của ADN ligase để tạo vectơ tái tổ hợp ADN sẽ gắn vào vectơ ở hai đầu tơng ứng.

+ Chuyển vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ: Chuyển bằng phơng pháp biến nạp, với mục đích qua tế bào chủ các vectơ tái tổ hợp sẽ đợc nhân lên với số lợng lớn các bản sao Các tế bào chủ đợc chọn phù hợp với vectơ tái tổ hợp, thờng là tế bào

+ Chọn và sàng lọc ra các thể tái tổ hợp: Nuôi cấy vi khuẩn có vectơ tái tổ hợp trong môi trờng thích hợp Sử dụng các gen chỉ thị để tiến hành chọn lọc các khuẩn mang gen tái tổ hợp [4].

1.4.3 Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)

Hiện nay, có rất nhiều phơng pháp để xác định tế bào vi khuẩn có plasmit mang gen mong muốn, nh phơng pháp colony-PCR, cắt plasmit bằng các enzym hạn chế, hoặc PCR từ plasmit Trong đó phơng pháp colony-PCR cho phép phát hiện

nhanh khuẩn lạc mang plasmit tái tổ hợp mong muốn Phơng pháp này có u điểm là nhanh, ít tốn kém và đơn giản Hiện nay, kỹ thuật này đợc ứng dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu sinh học phân tử

Nguyên tắc kỹ thuật colony-PCR dựa trên nguyên tắc kỹ thuật PCR, chỉ khác ở chỗ mẫu ADN đợc thay bằng ADN plasmit giải phóng từ khuẩn lạc ở nhiệt độ cao (94-950C), màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, giải phóng plasmit tái tổ hợp Plasmit tái tổ hợp này sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu.

1.4.4 Kỹ thuật xác định trình tự ADN

Hiện nay có nhiều phơng pháp xác định trình tự ADN Chúng tôi sử dụng ơng pháp enzym học của Sanger và cộng sự (1977) [32] Phơng pháp này tiến hành phản ứng tổng hợp các phân tử ADN, dới xúc tác của enzym ADN polymerase, với khuôn là đoạn ADN cần xác định trình tự, trong sự có mặt của một hàm lợng nhỏ dẫn xuất dideoxy của các nucleotit (ddNTP) Nhóm 3’OH của nucleotit đợc thay bằng H Điều này khiến cho các dideoxynucleotit không còn khả năng hình thành các cầu nối phosphodiester và do đó ngừng quá trình tổng hợp Trong kỹ thuật đọc trình tự nucleotit tự động, mỗi dideoxynucleotit đợc đánh dấu bằng một fluochrome có màu khác nhau Nh vậy, tất cả oligonucleotit cùng chấm dứt tại một loại dideoxynucleotit sẽ có cùng một màu Sau khi điện di trong ống vi mao quản, tạo ra một dãy các phân đoạn ADN hơn kém nhau một nucleotit Thiết bị phát hiện huỳnh quang (detector) phát hiện các băng theo thời gian, băng nào xa nhất đợc phát hiện trớc Detector phát tín hiệu lên máy tính Detector là một thiết bị khuếch đại tín hiệu Kết quả xác định trình tự sẽ đợc xử lý bằng phần mềm máy tính chuyên dụng.

ph-Chơng 2 Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu

2.1.Vật liệu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Các mẫu lá cà chua bị nghi nhiễm bệnh xoăn lá đợc chúng tôi thu thập tại những vùng chuyên canh cây cà chua thuộc các các tỉnh: Hà Nội, Bắc Ninh, Hng Yên, Thái Bình, Hải Dơng, Quảng Ninh Do điều kiện thời gian không cho phép nên chúng tôi mới chỉ tiến hành thí nghiệm với 6 tỉnh trên (bảng 1).

Bảng 1 Danh sách các mẫu lá cà chua nhiễm TYLCV đợc sử dụng trong nghiên cứu

22 AB116630 Nhật Bản TLCV-JP-AB116630

- Bộ hoá chất sử dụng cho phản ứng PCR của Applied Biosystem (Mỹ).

- Các hoá chất thông dụng khác đợc mua của các hãng Merck (Đức), Sigma (Mỹ), Amersham Pharmacia Biotech (Thụy Điển).

+ Môi trờng nuôi cấy vi sinh vật

Bảng 3 Thành phần môi trờng nuôi cấy vi sinh vật

LB lỏng 10 g/l Bacto-tryptone; 5 g/l Yeast extract; 10 g/l NaCl.LB đặc LB lỏng + 15 g/l Bacto- agar.

+ Thiết bị

Máy ly tâm, bàn soi gel, bộ điện di, tủ nuôi cấy vi sinh vật, máy chụp ảnh, pipet man, máy làm khô ADN, máy PCR, máy xác định trình tự nucleotit tự động và các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm về công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học.

2.2 Phơng pháp nghiên cứu

2.2.1 Tách chiết ADN tổng số

ADN tổng số của lá cà chua nhiễm bệnh đợc tách chiết theo phơng pháp của Accotto và cộng sự (2000).

- Nghiền 0,15 g lá cà chua nhiễm bệnh trong nitơ lỏng.

- Bổ sung 500 àl Extraction buffer, đảo đều ủ hỗn hợp ở 65oC trong 5 phút.- Bổ sung thêm 500 àl Kaliacetat 5 M ủ 00C trong 10 phút Li tâm 13.000 v/p trong 5 phút.

- Chuyển khoảng 500 àl dịch nổi sang ống mới

- Loại protein bằng cách bổ sung 500 àl Phenol:Chloroform:Isoamin (25:24:1) Đảo đều hỗn hợp, li tâm 13.000 v/p trong 15 phút Chuyển 350 àl pha nớc trên sang ống mới

Thu thập mẫu TYLCV

Hình 7 Sơ đồ thí nghiệmTách ADN tổng số

- Bổ sung thêm 350 àl Isopropanol lạnh, đảo đều Li tâm 13.000 v/p trong 5 phút

- Rửa ADN bằng 500 àl ethanol 70%.

- Để khô tủa và hoà tan trong 100 àl TE (có bổ sung RNase).

Extraction bufer: 100 mM Tris HCL, pH=8 ; 50 mM EDTA; 500 mM NaCl; 1% SDS; 10 mM β-mercaptoethanol, hoặc axit xitric 10 mM.

2.2.2 Nhân gen đặc hiệu bằng phơng pháp PCR

Trên cơ sở trình tự gen CP đã đợc công bố trong ngân hành gen thế giới, chúng tôi thiết kế cặp mồi, để nhân gen CP của vi rút thông qua phản ứng PCR

Bảng 4 Thành phần phản ứng PCR

Nớc cất hai lầnBuffer PCR (10X)

dNTP MgCl2

prC324NprV889NADN mẫu

Taq ADN polymerase

Bảng 5 Chu trình thực hiện phản ứng PCR

2.2.3 Điện di phân tích ADN trên gel Agarose

Nguyên tắc: Phơng pháp này dựa vào đặc tính cấu trúc tích điện âm của axit nucleic ADN với những kích thớc và khối lợng khác nhau, sẽ di chuyển với tốc độ

Biến tínhBiến tínhBắt cặpKéo dài

Hoàn tất kéo dàiKết thúc phản ứng

2 phút30 giây30 giây45 giây10 phút∞

1 1

x 30

Hoá chất: Agarose 0,8-1% pha trong TAE 1X đợc đun sôi, để nguội khoảng 50-600C, đổ dung dịch vào khay gel Khi gel đông đặc đặt khay gel vào bể điện di Tra mẫu ADN trộn với đệm tra mẫu (với tỉ lệ 1V mẫu:1V đệm 2X) vào các giếng trên bản gel Chạy với điện thế 80-120V Quan sát các dải ADN bằng cách nhuộm gel vào dung dịch EtBr 100 àl/l khoảng 5 phút trên máy lắc nhẹ, sau đó rửa bản gel bằng nớc và soi dới ánh sáng tử ngoại 300 nm.

2.2.4 Thôi gel, gắn đầu-A và tinh sạch sản phẩm PCR 2.2.4.1 Thôi gel

- Cắt phần gel chứa băng ADN quan tâm cho vào ống Eppendorf 2 ml

- Bổ sung 500 àl buffer QG, ủ ở nhiệt độ 520C khoảng 10 phút cho đến khi gel hòa tan hết Cho dịch thu đợc vào cột QIAquick 50 Li tâm 13.000 v/p trong 1 phút Loại bỏ dịch ở phía dới.

- Bổ sung 750 àl buffer PE, li tâm 13.000 v/p trong 1 phút Loại bỏ dịch phía dới Li tâm thêm 1 phút để loại bỏ hết PE.

- Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 ml Bổ sung 30 àl EB Để yên 5 phút rồi li tâm 13.000 v/p trong 1 phút

dNTP MgCl2

ADN mẫu

Taq ADN polymerase

ủ hỗn hợp trong ở 720C, 15 phút

- Hòa tan ADN trong 30 àl EB.

2.2.5 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pGEM-T

Sau khi thu đợc ADN nhân bản từ phản ứng PCR, chúng tôi tiên hành gắn sản phẩm PCR vào vectơ pGEM-T.

+ Chuẩn bị tế bào khả biến

Chọn một khuẩn lạc E.coli nuôi cấy trong 10 ml LB lỏng, lắc 200 v/p, 370C, qua đêm Hút 0,5 ml dịch tế bào cho vào 50 ml LB lỏng, lắc 200 v/p, 370C, trong 4 giờ Ly tâm 4000 v/p, 40C, 5 phút, thu tủa Tan tủa tế bào trong 5 ml CaCl2 0,1M (để lạnh sẵn ở 00C), ly tâm thu tủa

Tan tủa tế bào trong 0,85 ml CaCl2 0,1M và 0,15 ml glyxerol Chia nhỏ 200 àl vào các ống Eppendorf 1,5 ml, bỏ nhanh vào N2 lỏng, giữ ở 800C.

+ Biến nạp

Bổ sung trực tiếp vào ống đựng tế bào khả biến 10 àl ADN plasmit, ủ 30 phút trong đá Sốc nhiệt ở 420C trong 1 phút 30 giây rồi chuyển ngay sang giữ trong đá 5 phút Trải 100 àl dịch tế bào lên trên đĩa LB đặc chứa ampicillin nồng độ cuối cùng 100 mM , IPTG 100 mM và X-Gal 0,04% rồi ủ ở 370C qua đêm.

2.2.7 Kiểm tra sự có mặt của gen CP trong vectơ tách dòng

Hòa tan một phần khuẩn lạc trắng vào 16 àl nớc cất 2 lần, ủ ở 1000C trong 5 phút để phá vỡ tế bào Bổ sung các thành phần của phản ứng PCR theo thứ tự sau:

Bảng 8 Thành phần phản ứng PCR

Bảng 9 Chơng trình thực hiện phản ứng PCR

Biến tínhBiến tínhBắt cặpKéo dài

Hoàn tất kéo dàiKết thúc phản ứng

2 phút30 giây30 giây45 giây10 phút ∞

x301

2.2.8 Tách vectơ tái tổ hợp (ADN plasmit tái tổ hợp) từ E.coli

Song song với PCR kiểm tra sự có mặt của gen CP trong vectơ tách dòng pGEM-T Chúng tôi nuôi các khuẩn lạc trắng tơng ứng vào môi trờng LB lỏng có

Thành phần Thể tích (àl)Dịch khuẩn

Dung dịch đệm (10X)dNTP

Taq ADN polymerase

162,522110,5

bổ sung Amp 100mg/l Những khuẩn lạc PCR dơng tính thì chung tôi tiến hành tách plasmit.

- Lấy 2 ml dịch khuẩn đã nuôi qua đêm vào ống Eppendorf 2 ml, li tâm 13.000 v/p trong 5 phút, thu tủa.

- Bổ sung 250 àl P1 (có bổ sung RNase), đảo kĩ cho đến khi khuẩn tan hoàn toàn.

- Bổ sung 250 àl P2, đảo nhẹ 4-6 lần.

- Bổ sung ngay 350 àl N3, đảo nhẹ, li tâm 13.000 v/p trong 10 phút ở 4oC.- Chuyển pha trên vào cột QIA prep spin, li tâm 13.000 v/p trong 1 phút.- Bổ sung vào cột bằng 500 àl buffer PB, li tâm 13.000 v/p trong 1 phút - Rửa cột bằng 750 àl buffer PE, li tâm 13.000 v/p trong 1 phút Li tâm thêm một phút để loại hết PE.

- Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 ml, bổ sung 50 àl EB, để yên 5 phút, li tâm 13.000 v/p trong 1 phút

2.2.9 Xác định trình tự gen bằng máy phân tích trình tự nucleotid tự động

Gen đợc xác định trình tự trên máy tự động ABI PRIMSđ 3100 Avant Genetic Analyzer, bằng cách sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDyeđ Terminator v3.1 Cycle Sequencing.

Bảng 10 Thành phần phản ứng PCR cho xác định trình tự

Thành phần Thể tích(àl)D ung dịch đệm(5X)

M ồi x uôi

AD N mẫu (~100 ng)BigD ye

31,2757,7253

Bảng 11 Chơng trình phản ứng PCR cho xác định trình tự

Biến tínhBiến tínhBắt cặpKéo dài

H oàn tất kéo dàiKết thúc phản ứng

1 phút10 giây5 giây4 phút8 phút30phút