Tách dòng, xác định và so sánh trình tự gen mã hoá Nuclear Inclusion Body protein (NIb) của một số dòng virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ (Papaya Ringspot virus-PRSV) ở Việt Nam

Đu đủ (Carica papaya L.) là cây ăn quả có giá trị kinh tế cao, quả đu đủ rất giàu dinh dưỡng. Ngoài ra, nhựa đu đủ còn là nguồn nguyên liệu để tách papain, một loại enzym đã được thương mại hoá s

MỞ ĐẦU

Đu đủ (Carica papaya L.) là cây ăn quả có giá trị kinh tế cao, quả đu đủ rất giàu

dinh dưỡng Ngoài ra, nhựa đu đủ còn là nguồn nguyên liệu để tách papain, một loạienzym đã được thương mại hoá sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm vàthuộc da Ở Việt Nam, diện tích trồng đu đủ khoảng 2500 ha, với sản lượng hàng nămkhoảng 100 nghìn tấn, có giá trị tương đương 4,5 triệu USD [6,34].

Đu đủ là cây trồng nhiệt đới và cận nhiệt đới mắc rất nhiều bệnh, trong đó bệnh

đốm vòng do papaya ringspot virus (PRSV) gây ra là một trong những nguyên nhân chính

làm giảm năng suất và chất lượng quả đu đủ Bệnh được truyền do các loài rệp cây nên lanrộng rất nhanh chóng Đến nay, toàn bộ diện tích trồng đu đủ ở nước ta cũng như các vùngkhác trên thế giới như Australia [39], Thái Lan [46] Hawaii [37,45]… đều bị nhiễm bệnhvirus đốm vòng Những biện pháp truyền thống sử dụng để ngăn cản sự lan truyền củaPRSV chỉ mang tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại bệnh này, hơn nữa lại đòi hỏinhiều thời gian và công sức Gần đây, với việc áp dụng những kỹ thuật tiên tiến của sinhhọc phân tử vào nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng, đặc biệt là sử dụng các vật liệu ditruyền từ các virus gây bệnh chuyển vào cây để tạo ra các cây trồng chuyển gen khángbệnh virus đã thu được các kết quả đáng khích lệ, như đu đủ chuyển gen CP (coat protein)kháng PRSV đã được thương mại hoá trên thế giới [25], cây khoai tây chuyển gen NIb

kháng PVY (potato virus Y) [18]

Một trong những thách thức vẫn còn tồn tại là phổ kháng bệnh của những câychuyển gen này phụ thuộc vào độ tương đồng về mặt di truyền của chủng virus có gen đượcsử dụng để tạo cây chuyển gen và các dòng virus gây bệnh trong tự nhiên Chẳng hạn cácgiống đu đủ chuyển gen CP của Hawaii hoàn toàn không có khả năng kháng lại các dòngPRSV của Việt Nam Vì vậy, việc khảo sát tính đa dạng di truyền của gen chuyển có ý nghĩarất quan trọng trong việc nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus Nghiên cứu về đánh giátính đa dạng của các dòng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ của Việt Nam, Chu Hoàng Hà vàcộng sự (2004) cho biết 16 dòng PRSV phân lập từ các khu vực khác nhau của Việt Nam cómức độ giống nhau về trình tự gen CP từ 89,7% đến 99,8% Trong đó 4 dòng virus TuyênQuang, Kon Tum, Sài Gòn và Cần Thơ có tính đại diện cao nhất [4]

Trên cơ sở đó, 4 chủng PRSV trên đã được lựa chọn cho nghiên cứu “Táchdòng, xác định và so sánh trình tự gen mã hoá Nuclear Inclusion Body protein

(NIb) của một số dòng virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ (Papaya Ringspotvirus-PRSV) ở Việt Nam” nhằm tìm hiểu sự đa dạng ở mức độ phân tử ở gen NIb của

các dòng virus này và tạo nguyên liệu cho nghiên cứu tạo cây đu đủ chuyển gen khángPRSV ở Việt Nam.

Chơng 1. Tổng quan tài liệu

1.1 Giới thiệu chung về cây đu đủ

1.1.1 Phân loại

Cây đu đủ (Carica papaya L.) thuộc ngành Mộc lan (hạt kín,

Magnoliophyta), lớp Mộc lan (hai lá mầm, Magnoliopsida), phân lớp Sổ

(Dilleniidae), liên bộ Hoa tím (Violananae), bộ Hoa tím (Violales), họ Đu đủ(Caricaceae) [11] Carica l chi lớn nhất trong họ với 23 loài.à chi lớn nhất trong họ với 23 loài.

1.1.2 Nguồn gốc

Mặc dù có ý kiến cho rằng nguồn gốc của C papaya ở châu Mỹ nhiệt đới [32],

nhng nó có thể bắt nguồn từ vùng đất thấp thuộc phía đông của Trung Mỹ, từMexico tới Panama [38] Hạt của nó đợc phát tán tới Carribean và Đông Nam á nhờnhững ngời thám hiểm Tây Ban Nha vào thế kỷ 16, từ đó nó đợc lan đi nhanh chóngtới ấn Độ, Thái Bình Dơng và châu Phi [44].

Đu đủ đã đợc trồng ở Việt Nam cách đây vài trăm năm và hiện nay đang đợctrồng phổ biến trong các vờn cây từ Bắc chí Nam [10]

Theo các nhà khoa học, những giống đu đủ đầu tiên nhập vào nớc ta bằng hạt vì hạt đu đủ vừa nhiều, vừa nhỏ, lại có thể bảo quản lâu Bắt đầu từ khi những cha cố ng-ời Pháp, Tây Ban Nha khoảng thế kỷ 17, rồi sau này các chuyên gia nông nghiệp Pháp, Mỹ và nhiều quốc tịch khác, không ai biết bao nhiêu giống đu đủ đã vào ViệtNam Đu đủ lại là giống cây ăn quả ngắn ngày thụ phấn ngoại hoa, nhiều biến dị Nhiều giống đã hình thành từ địa phơng với các tên gọi không thống nhất [10].

1.1.3 Giá trị sử dụng

Trớc hết đu đủ là một loại thực phẩm thông dụng giàu dinh dỡng Quả chín làmột món ăn bổ dỡng có vị thơm ngon, chứa nhiều vitamin và muối khoáng (Bảng 1).Quả đu đủ có thể dùng làm rợu, mứt đờng, sấy khô và sắc đờng kính [44] Quả xanh,lá và hoa có thể đợc sử dụng nh một loại rau ăn và chế biến một số món ăn truyềnthống (nh hầm thịt vì trong quả và lá xanh có chứa nhiều enzym có tác dụng giốngnh pepsin của dạ dày, nhất là giống trypsin của tụy trong việc tiêu hoá chất thịt, haynấu cháo cùng thông thảo, ý dĩ và móng dò cho các phụ nữ đang cho con bú, haychế biến món bún chả Hà Nội rất nổi tiếng…).).

Hơn nữa, đu đủ còn đợc sử dụng trong công nghiệp Lá và quả xanh có chứamột số protein và alkaloid ứng dụng quan trọng trong công nghiệp và dợc phẩm.Trong đó papain là enzym thuỷ phân quan trọng nhất đợc sản xuất từ nhựa của quảnon, xanh và đã đợc thơng mại hoá, sử dụng trong công nghiệp đồ uống, thức ăn, vàdợc phẩm, bao gồm các sản phẩm keo dính, chỉ thị bia lạnh, làm mềm thịt, thuốc chữabệnh tiêu hoá và chứng hoại th Papain còn đợc sử dụng trong công nghiệp dệt để kéotơ, làm mềm len và trong công nghiệp mỹ phẩm, xà phòng, dầu gội đầu [39,44].

Bảng 1 Thành phần dinh dỡng của quả đu đủ chín (trên 100g) [43]STT Thành phần 100g quả chín

15 Vitamin C 69,30 – 71,00 mg

Đặc biệt đu đủ còn có tác dụng nh một vị thuốc Papain có tính chất làm dễtiêu hoá và giải độc Nó làm triệt tiêu progesteron, một hormon sử dụng cần thiếtchuẩn bị cho tử cung thụ thai và duy trì sự sống cho bào thai sau đó Hạt đu đủ chứamyrosin và kali myronat khi kết hợp với nhau tạo thành tinh dầu mùi diêm sinh hắc.Quả xanh chỉ đợc chỉ định dùng trong chứng thiểu năng tiêu hoá, dạ dày và tụy,trong sự giảm dịch vị hay sự lên men dạ dày, trong viêm dạ dày mãn tính, lên menruột và viêm dạ dày ruột non của trẻ em Hạt thờng dùng làm thuốc trị giun Rễdùng trị sốt rét và làm thuốc lợi tiểu Lá dùng tiêu mụn nhọt, lá nấu nớc dùng tẩysạch vết máu ở vải và rửa vết loét, vết thơng, sát trùng Nhựa bôi mặt nạ bị tàn nhangvà các vết nhơ khác ở da, hắc lào mới phát, các loại lở sần da ngoan cố Hoa đựcdùng trị ho gà [2].

Nh vậy đu đủ rất có ích cho con ngời, có thể sử dụng ở tất cả các phần, từhoa, quả, lá, rễ cho đến nhựa cây.

1.1.4 Năng suất, chất lợng

Sản lợng quả đu đủ chín ở nớc ta ớc tính đạt 100.000 tấn/năm Mỗi kilôgamquả chín trị giá khoảng 2500đ đến 3500đ thì tổng giá trị đạt từ 250 - 350 tỉ đồng(khoảng 15 -20 triệu đôla Mỹ) [34].

Tổng sản lợng quả đu đủ tơi trên thế giới năm 1995 ớc tính đạt 5 triệu tấn, đạtgiá trị khoảng 1,5 đến 2 tỉ đôla Mỹ [34].

Bảng 2 Sản lợng quả đu đủ hàng năm của một số nớc [12]

Nớc sản xuất Tổng sản lợng các năm ( x1000 tấn)

1989-1991 1995 1996 1997

Đu đủ đợc trồng ở tất cả các nớc nhiệt đới và nhiều vùng cận nhiệt đới trênthế giới [39] ở nớc ta đu đủ đợc trồng trong vờn nhà (từ 5 đến 10 cây) của gần 50%hộ nông dân Đu đủ cũng đợc trồng tập trung trong các nông trờng hoặc trang trạivùng đồng bằng sông Hồng, ven biển miền Trung, đồng bằng sông Mê Kông và sờnnúi đá vôi Tổng diện tích vào khoảng 2500 ha gồm khoảng 1250 ha trồng tập trung(Bảng 3) và 1250 ha trồng trong vờn nhà [34]

1.1.6 Bệnh ở cây đu đủ

- Bệnh đốm vòng: Còn gọi là bệnh đốm hình nhẫn là một bệnh rất phổ biếntrên cây đu đủ ở nớc ta và nhiều nớc khác trên thế giới, đợc coi là một trở ngại lớnnhất cho nghề trồng đu đủ Có thể nói ở đâu có trồng đu đủ là ở đó có bệnh này.

Bệnh do papaya ringspot virus gây ra Đặc điểm chính của bệnh là làm lùn cây, sản

lợng quả bị giảm, lá bị khảm và biến dạng, tạo đốm có dạng nh một cái vòng màuxanh mờ trên quả, cuống lá hay tạo các sọc xanh trên ngọn thân và cuống lá ở quảkhi chín, các vòng lộ rõ có màu vàng, quả bị nhạt, do virut đã làm giảm lợng đờngtrong quả ở mặt trên của các lá gần đỉnh sinh trởng, vùng mô lá ở giữa gân phụ vàgân nhánh bị nhăn phồng Bìa lá non bị cuốn vòng vào theo mặt dới lá Bìa lá già thìcuốn lên [5].

4

- Bệnh khảm: do papaya mosaic virus gây ra Giống nh bệnh đốm vòng, bệnh

khảm cũng là một bệnh rất phổ biến trên cây đu đủ Cây bệnh có lá bị khảm gồmnhiều vết xanh vàng lẫn lộn, khảm càng nặng, lá càng biến sang màu vàng Lá bệnhbị nhỏ lại, biến dạng, số thuỳ lá gia tăng, nhăn phồng Lá bị rụng nhiều, chỉ trừ lạichùm lá bị khảm vàng ở ngọn Quả nhỏ biến dạng, chai sợng [5].

- Bệnh thối gốc: do nấm Pythium spp gây ra, làm cho lá vàng và quả bị rụng,

gốc thân nơi tiếp giáp mặt đất bị úng rồi thối, cây sẽ bị đổ và chết.

- Bệnh cháy lá: do nấm Helminthosporium gây ra, làm chóp lá bị đốm úng

n-ớc, rồi lan dần vào bên trong lá, làm lá bị nâu và khô Nếu nhiễm nặng, cuống lá bịhéo, mềm và lá bị rụng [5].

- Bệnh đốm lá: do nấm Phyllosticta sulata gây ra Trên lá đốm bệnh có hình

tròn, hình trứng hoặc thon dài hay bất dạng Vùng giữa vết bệnh có màu bạc trắng,viền có màu vàng hay nâu, vùng bệnh khô và mỏng dần rồi bị tách [5].

- Bệnh phấn trắng: do nấm Odium caricae gây hại Lá bệnh bị đóng phấn

màu trắng ở mặt dới, nếu nặng lá sẽ phát triển kém, biến dạng ít Quả cũng bị cácđốm phấn trắng tròn hoặc bầu dục và phát triển kém.

- Bệnh thối quả: do nhiều loại nấm (Rhizopus, Colletotrichum, Ascochyta,

Botryodiplodia, Phomopsis, Macrophoma, Fusarium, Alternaria) gây các triệu

chứng khác nhau [5].

- Bệnh do tuyến trùng (Meloidogyne incognita và Rotylenchulus reniformis):

phá hại rễ Cây con nhiễm nặng có thể bị chết và cây lớn có thể giảm sức tăng trởng,có thể dùng các thuốc trị tuyến trùng nh Mocap tới xung quanh vùng rễ [5].

1.2 Giới thiệu về virut gây bệnh đốm vòng ở đu đủ (PRSV)

1.2.1 Phân loại

PRSV là virut thực vật, thuộc chi potyvirus, họ potyviridae [29] PRSV đợc

chia thành hai chủng dựa trên khả năng lây nhiễm của chúng là: w và p PRSV-p là virut phổ biến và gây thiệt hại lớn nhất tới đu đủ và bầu bí khắp thếgiới, còn PRSV-w chỉ ảnh hởng tới họ bầu bí, nhng trên thực tế không tìm thấyPRSV-P trên cây bầu bí, mà chỉ tìm thấy qua các thí nghiệm [18] PRSV đợc tìmthấy lần đầu tiên vào năm 1949 khi phân lập virut từ đu đủ Hawaii và sau đó đợc tìm

PRSV-thấy ở nhiều nớc khác trên thế giới [30] Hai chủng này có quan hệ rất gần gũi vớinhau, có thể PRSV-p tiến hoá từ PRSV-w do đột biến [16].

1.2.2 Cấu trúc

PRSV không có vỏ bọc, nucleocapsid có dạng hình sợi, xoắn, với chiềudài trọn vẹn 760-800nm, đờng kính 12nm (Hình 2) Virion chứa 5,5% axitnucleic là một sợi ARN đơn dơng liên kết với protein (VPg) ở đầu 5’ và cóđuôi poly(A) đầu 3’ [19,29].

Hệ gen của PRSV dài khoảng 10326 nucleotit, ngoại trừ đầu poly(A), vàchứa một khung đọc mở lớn bắt đầu từ vị trí nucleotit 86-88 và kết thúc ở vị trí10118-10120, mã hoá cho một polyprotein với 3344 axit amin [24] Polyproteinnày đợc tự thuỷ phân tạo 12 protein trong đó có protein NIb, là enzympolymerase cần thiết cho sự tái bản của ARN virut Trình tự bảo thủ caoAAAUAAAANANCUCAACACAUA ở đầu 5’ của PRSV cũng đóng vai trò quantrọng cho sự tái bản của potyvirus Tổ chức gen của PRSV đ ợc đa ra tạm thời làVPg-5’ leader-63K NT-52K HC-Pro-46K-72K CI-6K-48K NIa-59K NIb-35Kcoat protein- không mã hóa 3’- vùng poly(A) (Hình 3) [48].

Hình 3 Bản đồ tổ chức genom của PRSV

1.2.3 Đặc tính gây bệnh

PRSV gây bệnh không truyền qua hạt giống, chúng lây bằng hai cách: Một làdo tiếp xúc cơ giới (thông qua các vết thơng cơ giới do trong quá trình canh tác conngời vô ý tạo ra, do ma gió gây xây sát hay do côn trùng hay động vật khác) Hai là

do côn trùng môi giới chủ yếu là các loài rệp thuộc họ Aphididae nh Aphis gosipii,

Aphis crasivora, đặc biệt loài rệp Myzus persicae, loài rệp này cũng thờng gây hại

nhiều cho các loại rau cải, bầu bí, mớp, da Bệnh lây lan rất nhanh, nhất là nhữngcây đợc 5-6 tháng tuổi trở lên [13].

Hình 2 Cấu trúc của PRSV

A: PRSV d ới kính hiển vi điện tử, B: Cấu trúc bên ngoài

1.3 Gen NIb của PRSV

1.3.1 Cấu trúc của gen NIb

Gen NIb (nuclear inclusion body) nằm giữa gen NIa và gen CP, có kích thớckhoảng 1554 bp, nằm từ vị trí nucleotit 7646 đến 9199.

1.3.2 Vai trò của protein NIb

Protein NIb là ARN polymerase phụ thuộc ARN (RNA-dependent RNA polymerase,RdRp) của virut, chịu trách nhiệm tái bản phân tử ARN dơng và âm của virut [20] Có

một vài dẫn chứng thực nghiệm trực tiếp về protein NIb potyvirus: Thứ nhất, đặc điểm

trình tự nổi bật nhất của protein NIb là một motif glycine-aspartate-aspartate (GDD)đặc trng cho phần lớn virut ARN ở vi khuẩn, động vật và thực vật [32] Khi so sánhtrình tự RdRp của virut ARN dơng và phân tích sự tiến hoá của nó có thể phân loại tấtcả các virut thành lớp, bộ, họ và chi [32,33,17] Thứ hai, gần đây ngời ta đã chứng

minh đợc protein NIb có hoạt động RdRp [36] Họ cũng đã tìm thấy protein NIb có ơng tác với cả protein NIa và CP trong tế bào nấm men Protein NIb tơng tác với vùngVPg của protein NIa và tơng tác này đòi hỏi một vị trí gắn ARN chức năng Tơng tácnày có thể quan trọng cho việc kích thích tổng hợp ARN virut trong các tế bào nhiễm.Hoạt động polymerase của protein NIb có thể đợc kích thích bởi protein NIa và VPg T-ơng tác protein CP với NIb có khả năng thay đổi motif GDD Vai trò của tơng tác này tớihoạt động enzym của protein NIb hoặc chức năng của CP cha rõ ràng, nhng có thể cầnthiết cho việc tổng hợp ARN trong tế bào nhiễm virut [22,27].

t-Ngoài chức năng RdRp, protein NIb của TEV (tobacco etch virus) còn có

những chức năng khác, bao gồm những hoạt động dịch chuyển nhân [35] NIb chứahai dấu hiệu định vị nhân độc lập (NLS I và NLS II) NLS I nằm ở vị trí axit amin 1tới 17, và NLS II nằm giữa axit amin 292 và 316 Đột biến điểm cộng gộp dẫn đếnthay thế những gốc cơ bản trong các NLS, làm mất hoạt động dịch chuyển nhân.Những đột biến này cũng làm mất sự khuếch đại ARN TEV khi đợc đa vào genomcủa virut Việc mất khả năng khuếch đại là do mỗi đột biến NLS đợc bổ sung vào sự

dịch chuyển (in trans) các tế bào truyền tin biểu hiện protein NIb chức năng Điều

này chứng tỏ các NLS chồng lớp cần thiết cho chức năng dịch chuyển-hoạt động của

NIb Thực tế chức năng in trans của NIb có nghĩa là nó phải tơng tác với một hoặc

nhiều thành phần khác của bộ máy sao chép của genom Đột biến điểm cộng gộp ảnhhởng motif GDD hoặc NLS II trong vùng trung tâm của protein NIb, nhng không phảiđột biến nào cũng ảnh hởng tới NLS I gần đầu N, làm giảm hoặc mất tơng tác VùngC-terminal proteinase (Pro) của NIa, chứ không phải vùng N-terminal VPg, tơng tácvới NIb Tác động của những đột biến NIb trong vùng NLS I, NLS II, và motif GDDtới tơng tác giữa NIb và Pro-domain giống với ảnh hởng của những đột biến này tới t-ơng tác giữa chiều dài đầy đủ của NIb và NIa [36] NIb điều khiển quá trình tái bảnphức tạp thông qua một tơng tác với Pro-domain của NIa.

RdRp cần thiết cho sự sao chép genom của virut RdRp cùng các thành phầnkhác của virut và tế bào chủ, tạo thành một phức hợp sao chép thực hiện quá trình táibản genom virut RdRp đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn sớm của sự tái bảnvirut và làm tăng khả năng ức chế của enzym này, đợc xem nh chìa khoá tổng hợpmột phân tử đặc biệt, ví dụ scFv ức chế hoạt động enzym RdRp Nói cách khác, việc

ngăn hay ức chế hoạt động RdRp có thể phá vỡ sự tái bản của virut ở giai đoạn sớmhiệu quả hơn [26].

1.4 Các nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virut

PRSV là một trong những nguyên nhân chính gây thiệt hại lớn tới năng suất vàchất lợng cây đu đủ và nhiều loại cây trồng khác có giá trị ở Việt Nam cũng nh thếgiới Vì vậy, trên thế giới đã có rất nhiều nơi nghiên cứu về PRSV Một số gen củaPRSV nh gen CP đã đợc nghiên cứu rất kỹ và đã chuyển vào cây để tạo cây đu đủchuyển gen Nổi bật là phòng thí nghiệm tại trờng đại học Hawaii và đại học Cornell,Mỹ Hai nơi này đã đi tiên phong trong việc chuyển gen CP vào đu đủ để kháng bệnhđốm vòng và đã mở ra một phơng pháp mới cho việc tạo các giống cây trồng khángbệnh virut Các nhà khoa học ở đây đã đa gen CP của dòng virut PRSV HA 5-1 vàovectơ pGA482 và chuyển thành công vào giống đu đủ "Sunset" bằng súng bắn gen,tạo ra hai dòng đu đủ mang tên 55-1 và 63-1 có mang gen CP trong genom và đãkiểm tra bằng lai Southern và ELISA Kết quả thử nghiệm khả năng kháng bệnh của thếhệ R1 từ dòng 55-1 cho thấy chúng có tính kháng bệnh rất cao (chỉ có 5% của 128 cây đ-ợc thử nhiễm bệnh) đối với các dòng virut phân lập ở Hawaii, nhng không kháng đợccác dòng phân lập từ nơi khác Dòng 55-1 này đã đợc lai với giống Kapoho tạo ra giốngđu đủ "Rainbow" đã đợc đăng ký bản quyền và trở thành giống đu đủ chuyển gen thơngmại hoá đầu tiên trên thế giới có khả năng kháng lại PRSV [9].

Ngoài ra, gen NIb của PRSV cũng đợc quan tâm nghiên cứu Đã có nhiều nớc phân lập và xác định trình tự gen NIb nh ở Thái Lan, Poonpipit và cộng sự (2001) đã phân lập đợc gen NIb của PRSV có kích thớc 1596bp [40]; ở Trung Quốc, Ye và cộng sự (2002) phân lập đợc gen NIb của PRSV có kích thớc 1600bp [47] Nhng hiện nay việc nghiên cứu chuyển gen NIb vào cây đu đủ để tạo cây kháng bệnh vẫn còn đang đợc tiếp tục tiến hành, cha có giống thơng phẩm nào đợc đa ra thị trờng

Tuy nhiên, đã có nhiều cây trồng chuyển gen NIb kháng virut gây bệnh khácnhau trên thế giới đợc tạo ra nh cây đậu, cây thuốc lá, cây khoai tây Năm 1998,

Jones và cộng sự đã tạo ra đợc ba dòng đậu chuyển gen NIb kháng PSbMV (pea

seed-borne mosaic potyvirus), trong đó dòng PSbMV-DPD1 biểu hiện tính kháng

cao ngay lần nhiễm đầu tiên Theo ông, tính kháng của cây đậu phụ thuộc vào mậtđộ của virut nhiễm trên cây và số bản copy của gen NIb [31] Khoai tây cũng là đốitợng cây trồng đợc nghiên cứu nhiều về chuyển gen NIb kháng các loại virut khác

nhau nh PVY (potato virus Y), PLRV (potato leafroll virus) Năm 2004, Schubert

và cộng sự đã tạo ra đợc cây khoai tây chuyển gen NIb kháng PVY trong nhà kính[18,21] ở cây thuốc lá, Suzuki và cộng sự cũng đã chuyển gen sao chép ARNs 1 và

2 của CMV (cucumber mosaic virus) thành công tạo ra những dòng thuốc lá V1 và

V2, sau đó đem lai hai dòng này với nhau tạo ra dòng V1V2 Kết quả là dòng V1V2có tính kháng cao hơn so với dòng V1 và V2 [41].

1.5 Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứubệnh virut

1.5.1 Kỹ thuật RT-PCR

Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR) là sự kết hợp của hai phảnứng sao mã ngợc (reverse transcription) và PCR để nhân lên một đoạn gen quan tâmtừ ARN (Hình 4) Kỹ thuật này gồm hai giai đoạn:

- Tổng hợp sợi cADN thứ nhất:

Nguyên lý của phơng pháp này là sử dụng enzym sao mã ngợc (reversetranscriptase) để tổng hợp nên sợi cADN thứ nhất từ ARN Tùy theo mục đích củathí nghiệm mà các loại ARN đợc sử dụng khác nhau Nếu muốn nhân một đoạn gencủa sinh vật bậc cao mà không có intron thì ngời ta thờng tổng hợp cADN từ mARNvới mồi oligo(dT)s Nếu là sinh vật bậc thấp nh vi khuẩn, virut ngời ta có thể tổnghợp cADN từ ARN tổng số với mồi ngẫu nhiên hoặc mồi đặc hiệu cho gen cần nhânlên Khi mồi gắn bổ sung với sợi ARN khuôn enzym sao mã ngợc sẽ xúc tác choquá trình tổng hợp cADN từ các nucleotit tự do có trong thành phần phản ứng ở mộtnhiệt độ thích hợp Phản ứng tổng hợp cADN chỉ xảy ra trong một chu kỳ, theo lýthuyết sau khi kết thúc phản ứng ta sẽ thu đợc lợng cADN tơng ứng với lợng ARNkhuôn ban đầu Để tăng hiệu quả của quá trình tổng hợp, lợng mồi đợc cho vào lớnhơn rất nhiều lợng ARN khuôn và chất kìm hãm RNase cũng đợc đa vào để bảo vệcho ARN khỏi bị cắt bởi RNase.

- Khuếch đại gen bằng PCR:

Sử dụng cADN làm khuôn để khuếch đại gen quan tâm bằng phản ứng PCRvới cặp mồi đặc hiệu (Primer-F và Primer-R) Nguyên tắc của kỹ thuật PCR đợctrình bày ở mục 1.5.2.

1.5.2 Kỹ thuật PCR

dNTPs1 Reverse Transcription

2 PCR

ARN tổng số

cADN (mẫu PCR)Reverse transcriptase

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction – chuỗi phản ứng trùng hợp) đợc

Mullis và cộng sự mô tả đầu tiên năm 1985 Đây là kỹ thuật in vitro, tơng đối đơn giản

cho phép nhân nhanh một số lợng không hạn chế nguyên bản một đoạn ADN nhất địnhtrong một khoảng thời gian ngắn, nhờ sự xúc tác của ADN polymerase Tất cả cácADN polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới từ mạch khuôn đều cần sựhiện diện của những mồi đặc hiệu Mồi là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặpbổ sung với một đầu của mạch khuôn và ADN polymerase sẽ nối dài mồi để hình thànhmạch mới Quá trình nhân bản bằng enzym này bao gồm 3 bớc đợc lặp lại nhiều lần:

- Biến tính ADN từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn bằng cách nâng caonhiệt độ lên 94-950C trong khoảng thời gian 30 giây đến 1 phút.

- Gắn mồi (primer) với đoạn ADN cần nhân thông qua hạ nhiệt độ xuống 600C, trong khoảng thời gian 30 giây đến 1 phút, phụ thuộc vào độ dài và tỉ lệ G+Ccủa đoạn mồi

40 Phản ứng polymerase tổng hợp phân tử ADN kéo dài từ đoạn mồi Hai phântử ADN mới đợc tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu phân tử khuôn banđầu Thời gian kéo dài từ 30 giây đến vài phút Để tránh hiện tợng bắt cặpkhông đặcthù, phản ứng tổng hợp nên đợc thực hiện ở 720C Loại polymerase dùng trong PCR

là loại chịu nhiệt (Taq polymerase) đợc tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus,

một loại vi khuẩn đợc phân lập từ suối nớc nóng Hiện nay, enzym này chủ yếu đợcsản xuất theo con đờng tái tổ hợp

Nh vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng lợng ADN cần nhân bản sẽ tăng gấp đôi, vớiN sợi khuôn ban đầu sau n chu kỳ sẽ có Nx2n sợi ADN đợc nhân lên Ví dụ, sau khoảng20 chu kỳ có tới trên 30 triệu bản đợc nhân lên từ một sợi khuôn ban đầu [1,3].

1.5.3 Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E coli

Biến nạp theo nghĩa rộng là: đa bất kỳ ADN nào vào bất kỳ tế bào nào Trong

trờng hợp các tế bào E coli thì biến nạp có nghĩa là đa ADN plasmit vào trong tế

Lần đầu tiên biến nạp ở vi khuẩn đợc Frederick Griffith mô tả vào năm 1928trong thí nghiệm nổi tiếng của ông về cái gọi là “nguyên lý biến nạp” Trên thực tế,phát minh này về sau đã chứng minh rằng các gen đợc cấu thành từ ADN Tuy nhiên,không phải tất cả các vi khuẩn đều có thể đợc biến nạp một cách dễ dàng Để cho biến

nạp ở E coli có hiệu quả, các tế bào cần trở nên khả biến (competent) Để đạt đợc

điều này, ngời ta ngâm các tế bào trong dung dịch CaCl2 lạnh trong đá, khi đó các tếbào trở nên khả biến theo một cách mà cho đến nay vẫn cha rõ nguyên nhân Việcbiến nạp các tế bào khả biến đợc thực hiện bằng cách trộn ADN plasmit với các tếbào, rồi ủ trong đá 20-30 phút, sau đó tạo một sốc nhiệt ngắn (khoảng 1 phút ở 420C),làm nh vậy ADN sẽ chui vào tế bào Sau khi biến nạp, vi khuẩn đợc nuôi phục hồitrong môi trờng LB ở 370C trong vòng 60 đến 90 phút Sau đó, các tế bào đợc đa lênmôi trờng chọn lọc để nhân lên các tế bào có plasmit.

Trong quá trình biến nạp, chỉ có một phần rất nhỏ các tế bào khả biến đ ợcbiến nạp Mặc dù có nhợc điểm rất lớn này, biến nạp vẫn là một kỹ thuật quantrọng, nó có thể tạo ra tới 109 các tế bào biến nạp (tức các thể biến nạp) khi đa 1

microgam ADN vào thí nghiệm Thờng trên thực tế với 1 microgam ADN ngời tatạo ra đợc 106 đến 107 tế bào biến nạp [8].

1.5.4 Kỹ thuật tách dòng

Tách dòng gen là một công cụ hữu hiệu đợc sử dụng trong kỹ thuật di truyềnvà là bớc khởi nguồn cho các kỹ thuật sau này [7] Mục đích của việc tách dòng lànhằm thu đợc một lợng lớn bản sao của trình tự gen quan tâm Đầu tiên, ADN ngoạilai đợc nối vào một vectơ nhằm tạo ra ADN tái tổ hợp Vectơ sử dụng là plasmit

thích ứng của vi khuẩn E coli Sau đó vectơ tái tổ hợp đợc biến nạp vào tế bào chủ

và tế bào chủ đợc nuôi cấy trong môi trờng thích hợp để nhân vi khuẩn lên nhiều

lần Tế bào chủ ở đây là vi khuẩn E coli Cuối cùng qua các bớc tách chiết ADN,

ngời ta sẽ thu đợc một lợng lớn plasmit tái tổ hợp [3].

Các nhân tố nh vectơ, tế bào chủ có thể thay đổi nhng tiến trình tách dòng nóichung đợc thực hiện qua 4 bớc: xử lý ADN cần tạo dòng, tạo vectơ tái tổ hợp, biếnnạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ, chọn dòng.

- Xử lý ADN cần tạo dòng

Trớc hết ADN cần tạo dòng đợc khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu.Sản phẩm PCR sau đó đợc làm sạch để thu đợc phân đoạn ADN có kích thớc nhmong muốn, loại bỏ mồi và các thành phần khác trong phản ứng PCR Bớc nàynhằm tạo điều kiện cho bớc chọn dòng đợc thực hiện nhanh và hiệu quả, tránhnhững plasmit tái tổ hợp có kích thớc không mong muốn

- Tạo vectơ tái tổ hợp

Vectơ tái tổ hợp đợc tạo ra bằng cách gắn gen quan tâm (đoạn ADN cần tạodòng) vào vectơ tách dòng Thông thờng, sau khi chạy PCR với enzym Taqpolymerase, enzym này sẽ gắn thêm một nucleotit là Adenin vào đầu 3’ của đoạngen đợc nhân lên Lợi dụng tính chất này các nhà khoa học đã nghiên cứu thiết kếcác thế hệ vectơ tách dòng có mang một nucleotit là Thymin ở đầu 5’ của vectơ đãđợc mở vòng sẵn tại PCS (polycloning site-vùng nhân dòng đa điểm cắt) Hiện nay,có rất nhiều vectơ tách dòng có đặc tính này, nh pCR2.1-TOPO, pGEM-T

Vectơ tách dòng và ADN cần tạo dòng đợc trộn chung theo một tỷ lệ nhấtđịnh dới sự xúc tác của enzym T4 ligase, ADN sẽ đợc gắn vào vectơ theo nguyên tắcbổ sung A-T tại vị trí mở vòng.

- Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ

Trong quá trình gắn gen vào vectơ sẽ hình thành nên các vectơ tái tổ hợpkhác nhau Bớc này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chépvectơ tái tổ hợp thành một số lợng lớn bản sao Tuỳ vào mục đích sử dụng, ngời ta sẽ

chọn tế bào chủ là tế bào E coli hay tế bào nấm men.

- Chọn dòng

Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp theo hai cách thông dụng: chọn lọc theo phơngpháp kháng sinh (kanamycin hoặc ampicillin) nhằm loại trừ các tế bào vi khuẩnkhông đợc biến nạp và các loại vi khuẩn nhiễm tạp khác và chọn lọc theo phản ứngvới cơ chất (X-gal) nhằm loại trừ những vi khuẩn có mang vectơ nhng không cóđoạn gen đợc chen vào.

1.4.5 Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)

Hiện nay, có rất nhiều phơng pháp để xác định tế bào vi khuẩn có plasmitmang gen mong muốn, nh phơng pháp colony-PCR, cắt plasmit bằng các enzym hạnchế, hoặc PCR từ plasmit Trong đó phơng pháp colony-PCR cho phép phát hiệnnhanh khuẩn lạc mang plasmit tái tổ hợp mong muốn Phơng pháp này có u điểm lànhanh, ít tốn kém và đơn giản Hiện nay, kỹ thuật này đợc ứng dụng rất rộng rãitrong nghiên cứu sinh học phân tử

Nguyên tắc kỹ thuật colony-PCR dựa trên nguyên tắc kỹ thuật PCR, chỉ khácở chỗ mẫu ADN đợc thay bằng ADN plasmit giải phóng từ khuẩn lạc ở nhiệt độ cao(94-950C), màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, giải phóng plasmit tái tổ hợp Plasmit táitổ hợp này sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu.

1.4.6 Kỹ thuật xác định trình tự nucleotit

Những phơng pháp đọc trình tự axit nucleic đang đợc sử dụng hiện nay đều đợc cải tiến từ phơng pháp enzym học thông qua việc sử dụng các dideoxynucleotit của Sanger và cộng sự (1977) Phơng pháp này dựa vào sự tổng hợp nhờ enzym ADN polymerase mạch bổ sung cho trình tự ADN mạch đơn cần xác định Đặc trng của phơng pháp là ngoài bốn loại nucleotit thông thờng còn sử dụng thêm bốn loại

dideoxynucleotit là những deoxynucleotit trong đó nhóm 3’OH đợc thay bằng H Điều này khiến cho các dideoxynucleotit không còn khả năng hình thành các cầu nối phosphodiester và do đó ngừng quá trình tổng hợp Trong kỹ thuật đọc trình tự nucleotit tự động, mỗi dideoxynucleotit đợc đánh dấu bằng một fluochrome có màu khác nhau Nh vậy, tất cả oligonucleotit cùng chấm dứt tại một loại dideoxynucleotit sẽ có cùng một màu Sau khi điện di trong ống vi mao quản, tạo ra một dãy các phân đoạn ADN hơn kém nhau một nucleotit Thiết bị phát hiện huỳnh quang (detector) phát hiện các băng theo thời gian, băng nào xa nhất đợc phát hiện trớc Detector phát tín hiệu lên máy tính Detector là một thiết bị khuếch đại tín hiệu Kết quả xác định trình tự sẽ đợc xử lý bằng phần mềm máy tính chuyên dụng.

Chơng 2 Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu

2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Nghiên cứu về đánh giá tính đa dạng của các dòng virus gây bệnh đốm vòngđu đủ của Việt Nam thông qua tách dòng, xác định và so sánh trình tự gen mã hoáprotein vỏ (CP) cho thấy 16 dòng PRSV phân lập từ các khu vực khác nhau của ViệtNam có mức độ giống nhau từ 89,7% đến 99,8% Trong đó 4 dòng virus TuyênQuang, Kon Tum, Sài Gòn và Cần Thơ là các dòng có tính đại diện cao nhất cho cácvùng đợc nghiên cứu Từ cơ sở trên 4 mẫu lá đu đủ nhiễm PRSV đợc thu từ 4 vùngtrên của Việt Nam đã đợc sử dụng trong nghiên cứu này (Bảng 4).

Bảng 4 Danh sách các mẫu lá đu đủ nhiễm PRSV đợc sử dụng trong nghiên cứu

STT Tªn vïng thu mÉu Ký hiÖu

2.1.2 Ho¸ chÊt, thiÕt bÞ+ Ho¸ chÊt

- Thang ADN 1 kb (Fermentas)

- Kit t¸ch chiÕt ARN (Trizol Regents Kit), bé ho¸ chÊt sö dông cho PCR (Cloned AMV Reverse Transcriptase Kit) cña h·ng Invitrogen (Mü).- Kit tinh s¹ch ADN (QIAquick Gel Extraction Kit), vµ t¸ch chiÕt plasmit

RT-(QIAprep Spin Miniprep Kit) cña h·ng QIAGEN (§øc).- Kit g¾n gen vµo vect¬ pGEM

2.2 Phơng pháp nghiên cứu

2.2.1 Phơng pháp thiết kế mồi

Khai thác dữ liệu trong Ngân hàng gen Quốc tế để tìm ra tất cả các trình tự gen NIb của PRSV Sử dụng chơng trình phần mềm DNAstar, BioEdit để so sánh các trình tự của các gen NIb với nhau Để nhân đợc toàn bộ gen NIb thì cần phải thiết kế mồi xuôi nằm trong gen NIa và mồi ngợc nằm trong gen CP Việc thiết kế mồi đ-ợc thực hiện tại các vùng có độ bảo thủ cao nhất Trên sơ sở đó, các mồi đặc hiệu NIb-F1 và CP- R3 đợc thiết kế để nhân gen NIb.

- Sau đó chuyển ngay mẫu vào ống eppendorf 2ml

- Bổ sung 1ml Trizol regents, đảo đều ở nhiệt độ phòng (15-300C) trong 5 phút.- Bổ sung 200l Chloroform : Isoamyl (24:1), đảo đều ở nhiệt độ phòng trong 5phút.

- Hút 500l dịch nổi, chuyển sang ống eppendorf 1,5ml.

- Bổ sung 500l isopropanol (40C), lắc nhẹ ống để ARN kết tủa.- Để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Ly tâm 10.000 v/p trong 15 phút.- Loại bỏ dịch nổi, rửa tủa ARN bằng ethanol 70% pha trong DEPC 0,01% - Ly tâm 6000 v/p trong 5 phút.

- Làm khô ARN bằng máy Speed Vac trong khoảng 3 phút.- Pha loãng ARN trong 40l nớc đã xử lý bằng DEPC 0,01% - ủ ở nhiệt độ 550C trong 5 phút để ARN tan hết.

- Lấy 1l ARN tổng số điện di kiểm tra chất lợng trên gel agarose 1%.

Chú ý: Do ARN dễ bị RNase cắt, nên tất cả các dụng cụ đều phải xử lýDEPC trớc khi sử dụng.

- ủ ở 650C trong 5 phút, sau đó đặt vào đá.

- Tiếp tục bổ sung các thành phần sau vào ống phản ứng trên: 4l buffer 5X,1l DTT 0,1M, 1l chất ức chế Ribonuclease tái tổ hợp RNase OUTTM (40 đơn vị/l), 1l Cloned AMV RT (15 đơn vị/l).

- Trộn mẫu nhẹ nhàng, sau đó thực hiện 1 chu kỳ nhiệt nh sau:

Bảng 6 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng tổng hợp cADN

Bảng 8 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

Bớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ1

Biến tínhBiến tínhGắn mồiKéo dài chuỗiHoàn tất kéo dàiKết thúc phản ứng

3 phút1 phút30 giây2 phút10 phút

2.2.4 Phơng pháp tạo plasmit tái tổ hợp mang gen NIb

Sản phẩm PCR của gen NIb đợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.Sau đó đợc làm sạch (thôi gel) theo bộ Kit QIAquick Gel Extraction và gắn vàovectơ tách dòng pGEM-T của hãng Promega Các bớc tiến hành nh sau:

- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel, ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút.Loại bỏ dịch chảy qua cột.

- Bổ sung 500l dung dịch QG, ly tâm 13.000 v/p 1 phút.

- Thêm 750l dung dịch PE vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

- Ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút, đổ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phútđể loại bỏ hết dung dịch PE.

- Hoà tan ADN trong 30 – 50l nớc cất hoặc dung dịch EB, đã đợc làm ấm đến500C, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút.

+ Gắn gen vào vectơ tách dòng pGEM

Đệm gắn gen vào vectơ 2XADN

Vectơ pGEM-TrATP

107,510,5