Chơng 3 Kết quả và thảo luận
3.4.3. Kết quả colony PCR
Chúng tôi chọn 5 khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu chạy phản ứng colony PCR với cặp mồi pUC18-F1 và pUC18-R1 để xác định khuẩn lạc có plasmit mang gen NIb. Vì hai mồi này nằm trên vectơ, nên nếu khuẩn lạc có plasmit mang gen NIb, thì sản phẩm PCR sẽ cho một băng có kích thớc khoảng 2250 bp. Một câu hỏi đợc đặt ra là tại sao không chạy colony PCR với mồi đặc hiệu nằm trong gen. Là do, khi gắn gen vào vectơ một lợng lớn ADN không đợc gắn vào vectơ vẫn tồn tại trong hỗn hợp phản ứng, do đó khi cấy trải lên đĩa thạch xung quanh khuẩn lạc vẫn còn một l- ợng sản phẩm PCR nhất định. Do đó ta có thể chọn nhầm khuẩn lạc dơng tính. Sản phẩm colony PCR đợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (hình 9). Đồng thời, nuôi những khuẩn lạc này vào 3ml LB lỏng có bổ sung Ampicillin 100mg/l để tách plasmit phục vụ cho việc xác định trình tự.
Từ kết quả điện di trên hình 9 cho thấy sản phẩm colony PCR từ những khuẩn lạc ở các đờng chạy số 1, 7, 14 cho kết quả âm tính có thể do trong quá trình colony-PCR lợng mẫu (khuẩn lạc quá ít hoặc quá nhiều) dẫn đến PCR không nhân lên đợc đoạn gen mong muốn mặc dầu khuẩn lạc có màu trắng. Còn những đờng chạy còn lại có kết quả dơng tính. Tuy nhiên có những đờng chạy số 4, 8, 12, 15, 18
Hình 9. Kết quả điện di sản phẩm colony PCR trên gel agarose 1% M. Thang AND 1 Kb; 1-5.TQ; 6-10. CT; 11-15. KT, 16-20. SG
cho lên băng thấp hơn 2000bp; đờng chạy số 4 cho băng có kích thớc khoảng 250bp, điều này có thể do vectơ tự đóng vòng và tại PCS bị dứt gẫy một vài nucleotit làm dịch chuyển khung đọc, do đó operon lac bị ức chế hoạt động, tế bào không tổng hợp ra enzym β-galactosidase; đờng chạy số 8, 12, 15 và 18 do trong quá trình thao tác làm thí nghiệm, sản phẩm ADN bị gãy thành những đoạn có kích thớc bé hơn 2000bp, những đoạn này gắn vào vectơ thì sản phẩm colony-PCR sẽ cho những băng có kích thớc nằm giữa 250bp và 2000bp. Những đờng chạy còn lại lên một băng duy nhất có kích thớc khoảng 2250bp, phù hợp với kích thớc mà chúng tôi dự tính. Ph- ơng pháp này cũng đã loại đợc nhiều khuẩn lạc mang plasmit không mong muốn. Để khẳng định một cách chắc chắn kết quả cuối cùng, chúng tôi tiến hành tách plasmit của những khuẩn lạc có kết quả colony mong muốn, sau đó giải trình tự của đoạn ADN đã gắn vào vectơ.
