Phân tích trình tự gen Nuclear Inclusion Body protein của Papaya Ringspot virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ ở Việt Nam

Kü thuËt PCR

Đây là kỹ thuật in vitro, tơng đối đơn giản cho phép nhân nhanh một số lợng không hạn chế nguyên bản một đoạn ADN nhất định trong một khoảng thời gian ngắn, nhờ sự xúc tác của ADN polymerase. Loại polymerase dùng trong PCR là loại chịu nhiệt (Taq polymerase) đợc tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus, một loại vi khuẩn đợc phân lập từ suối nớc nóng.

Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E. coli

Để tránh hiện tợng bắt cặp không đặc thù, phản ứng tổng hợp nên đợc thực hiện ở 720C. Nh vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng lợng ADN cần nhân bản sẽ tăng gấp đôi, với N sợi khuôn ban đầu sau n chu kỳ sẽ có Nx2n sợi ADN đợc nhân lên.

Kỹ thuật tách dòng

Các nhân tố nh vectơ, tế bào chủ có thể thay đổi nhng tiến trình tách dòng nói chung đợc thực hiện qua 4 bớc: xử lý ADN cần tạo dòng, tạo vectơ tái tổ hợp, biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ, chọn dòng. Sản phẩm PCR sau đó đợc làm sạch để thu đợc phân đoạn ADN có kích thớc nh mong muốn, loại bỏ mồi và các thành phần khác trong phản ứng PCR. Bớc này nhằm tạo điều kiện cho bớc chọn dòng đợc thực hiện nhanh và hiệu quả, tránh những plasmit tái tổ hợp có kích thớc không mong muốn.

Thông thờng, sau khi chạy PCR với enzym Taq polymerase, enzym này sẽ gắn thêm một nucleotit là Adenin vào đầu 3’ của đoạn gen đợc nhân lên. Lợi dụng tính chất này các nhà khoa học đã nghiên cứu thiết kế các thế hệ vectơ tách dòng có mang một nucleotit là Thymin ở đầu 5’ của vectơ đã. Bớc này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vectơ tái tổ hợp thành một số lợng lớn bản sao.

Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp theo hai cách thông dụng: chọn lọc theo phơng pháp kháng sinh (kanamycin hoặc ampicillin) nhằm loại trừ các tế bào vi khuẩn.

Vật liệu nghiên cứu

Quang, Kon Tum, Sài Gòn và Cần Thơ là các dòng có tính đại diện cao nhất cho các vùng đợc nghiên cứu. Từ cơ sở trên 4 mẫu lá đu đủ nhiễm PRSV đợc thu từ 4 vùng trên của Việt Nam đã đợc sử dụng trong nghiên cứu này (Bảng 4). Danh sách các mẫu lá đu đủ nhiễm PRSV đợc sử dụng trong nghiên cứu.

Hoá chất, thiết bị + Hoá chất

- Kit tinh sạch ADN (QIAquick Gel Extraction Kit), và tách chiết plasmit (QIAprep Spin Miniprep Kit) của hãng QIAGEN (Đức). - Các hoá chất thông dụng khác (Ampicillin, IPTG, X-gal, Agarose, ) của… hãng Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech. Máy ly tâm, máy soi gel, bộ điện di, tủ cấy vô trùng, máy chụp ảnh, pipet man, máy làm khô ADN (Speed Vac), máy PCR, máy xác định trình tự nucleotit tự.

Phơng pháp RT-PCR

Sau khi tổng hợp cADN, tiến hành chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu NIb-F1 và CP-R3 để khuếch đại gen NIb. Biến tính Gắn mồi Kéo dài chuỗi Hoàn tất kéo dài Kết thúc phản ứng.

Phơng pháp tạo plasmit tái tổ hợp mang gen NIb

Hỗn hợp đợc ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ và sau đó đợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Tế bào E.coli DH5α đợc cấy ria trên môi trờng LB đặc và nuôi qua đêm ở 370C. Bổ sung 20àl vectơ đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ.

Phơng pháp xử lý trình tự gen thu đợc

+ Lập cây phân loại và bảng hệ số đồng dạng so sánh mức độ tơng đồng di truyền của 4 trình tự nucleotit của 4 dòng gen NIb thu đợc với nhau và với trình tự gen NIb của các PRSV từ nhiều khu vực khác nhau trên thế giới đã đợc công bố trong ngân hàng dữ liệu gen (NCBI) (bảng 5). Với mục đích chỉ sử dụng 1 cặp mồi có thể nhân đợc nhiều dòng virus khác nhau, chúng tôi đã chọn những vùng trình tự có độ bảo thủ cao nhất và kết quả đã thiết kế. Đến nay có khá nhiều phơng pháp tách chiết ARN tổng số của thực vật đã đợc nghiên cứu, cải tiến và ứng dụng cho phù hợp với từng đối tợng và điều kiện thí nghiệm khác nhau nh phơng pháp của Napoli và cộng sự (1990), Sambrook và cộng sự (2001).

Trong thí nghiệm này, để tách chiết ARN tổng số từ mẫu lá đu đủ nhiễm PRSV có chất lợng tốt, chúng tôi đã sử dụng bộ kit Trizol Regents của hãng Invitrogen (Mü). Hiệu quả của phản ứng RT-PCR có thể giảm do những nguyên nhân nh: lợng ARN virus quá ít hoặc quá nhiều, nồng độ mồi quá cao hoặc quá thấp hoặc nhiệt độ bắt cặp mồi cha phù hợp Vì vậy, trong quá trình tiến hành phản ứng chúng tôi tiến… hành điều chỉnh lợng mẫu, nồng độ mồi, Mg2+, nhiệt độ bắt cặp mồi để đảm bảo… cho phản ứng RT-PCR xảy ra đặc hiệu nhất. Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do trong vectơ pGEM-T mang lac-operon hoạt động bình thờng, không có đoạn gen đợc chèn vào, khi có chất cảm ứng của IPTG sẽ tổng hợp enzym β-galactosidase, enzym này sẽ chuyển hoá cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh.

Còn những khuẩn lạc trắng có thể là do nhận đợc plasmit mang lac-operon không hoạt động, chính vì vậy, khi có chất cảm ứng IPTG thì gen không tổng hợp enzym β-galactosidase và không xảy ra sự chuyển hoá X-gal.

Kết quả colony PCR

Tuy nhiên không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang plasmit tái tổ hợp chứa đoạn ADN thuộc gen NIb. Mặc dù vậy, việc chọn các khuẩn lạc trắng để tiến hành nghiên cứu tiếp đã loại bỏ. Để hiệu quả hơn, chúng tôi tiếp tục tiến hành chạy phản ứng colony PCR.

Những đờng chạy còn lại lên một băng duy nhất có kích thớc khoảng 2250bp, phù hợp với kích thớc mà chúng tôi dự tính. Để khẳng định một cách chắc chắn kết quả cuối cùng, chúng tôi tiến hành tách plasmit của những khuẩn lạc có kết quả colony mong muốn, sau đó giải trình tự của.

Kết quả tách plasmit

Kết quả điện di trên hình 10 cho thấy sản phẩm tách plasmit rất sạch, đảm bảo chất lợng và số lợng để tiến hành đọc trình tự và subclone.

Kết quả subclone

Do phản ứng cắt có thể xảy ra không hoàn toàn, nên khi điện di chỉ chạy với hiệu điện thế khoảng 50 vol, vì chạy điện di với hiệu điện thế này có thể phân tách các băng ADN tốt hơn, phần plasmit không đợc cắt trong hỗn hợp phản ứng có thể tách khỏi băng ADN 4400bp. Sản phẩm cắt enzym (băng ADN 4400bp) sau đó đợc thôi gel và tinh sạch theo bộ kit QIAquick Spin Miniprep (nh mô tả trong phần phơng pháp 2.2.4). 2) Kết quả biến nạp plasmit vào tế bào E. Dới sự có mặt của dNTPs tự do, enzym này sẽ xúc tác tổng hợp bổ sung các nucleotit vào các đầu dính để tạo ra hai đầu bằng cho vectơ.

Sản phẩm plasmit sau đó đợc tinh sạch để loại bỏ những thành phân d thừa nh dNTPs, đệm, enzym Klenow; rồi đợc gắn lại nhờ enzyme T4 ligase. Kết quả biến nạp (đợc trình bày trên hình 12) cho thấy đã thu đợc một lợng lớn các khuẩn lạc kháng Ampicillin. Chứng tỏ vectơ tái tổ hợp đã đợc biến nạp thành công vào E. Tuy nhiên, để biết chính xác khuẩn lạc nào mang vectơ tái tổ hợp nh mong muốn thì cần phải chọn dòng tế bào bằng colony PCR. 3) Kết quả chọn dòng tế bào. 5 khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu đã đợc chọn để chạy colony PCR với cặp mồi pUC18-F1 và CP-R3 và đồng thời các khuẩn lạc này đợc nuôi trong môi trơng LB lỏng có bổ sung Ampicilin để tách plasmit.

Những đờng chạy còn lại đều cho lên một băng có kích thớc khoảng 1500bp nh mong muốn, là do vectơ có chứa đoạn gen gắn vào có kích thớc khoảng 1400bp.

So sánh sự giống nhau của gen NIb ở mức độ nucleotit

Tuy nhiên, để có kết luận cụ thể thì phải tiến hành tách plasmit và xác định trình tự đoạn gen subclone. Sản phẩm plasmit đã tinh sạch đợc xác định trình tự trên máy đọc tự động ABI PRIMS 3100 Avant Genetic Analyzer.

Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng việt

Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trơng Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003), áp dụng các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. Lâm Đại Nhân (2000), Phân lập và thiết kế gen mã hoá protein vỏ của virus gây bệng đốm vòng đu đủ ở Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sinh học,. (1991), “Relationships among the positive strand and double- strand RNA viruses as viewed through their RNA-dependent RNA polymerases”, Nucleic acids Res, 19, pp.

(2004), “Pathogen-derived resistance in potato to Potato virus Y- aspects of stability and biosafety under field conditions”, Virus Res, 100(1), pp. (1997), “Efficient transcription of the tRNA-like structure of turnip yellow mosaic virus by a template-dependent and specific viral RNA polymerase obtained by a new procedure”, J Virol Methods, 64(2), pp. (1998), “Specificity of resistance to pea seed-borne mosaic potyvirus in transgenic peas expressing the viral replicase (NIb) gene”, J Gen Virol, (790), pp.

(1993), “Function of the tobacco etch virus RNA polymerase (Nib): subcellular transport and protein- protein interaction with VPg/proteinase (NIa)”, J Virol, 71, pp.