Luận văn : SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÕNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP part 6 ppt

39 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Hiện trạng canh tác cây đu đủ ở nơi lấy mẫu Huyện Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp Cao Lãnh là một vùng đất khá trù phú, màu mỡ dù đất đai có nhiều nơi bị nhiễm phèn song có thể khắc phục đƣợc. Nơi đây lại có nguồn nƣớc tƣới dồi dào với hệ thống kênh rạch chằng chịt, khí hậu nóng ẩm nên rất thích hợp cho việc trồng đu đủ. Đu đủ ở đây thƣờng đƣợc trồng xen với các cây lâu năm nhƣ xoài, bƣởi, cam, chanh. Do đƣợc trồng xen với cây ăn trái do đó việc bón phân cho cây trồng chính cũng phần nào cung cấp đƣợc dinh dƣỡng cần thiết cho cây đu đủ vì thế đu đủ ở đây có sức sống mạnh mẽ, xanh tốt, cho trái sai, kích thƣớc lớn. Đồng thời nhờ đó mà cây còn tăng sức chống chịu cũng nhƣ tính đề kháng với các loại bệnh, đặc biệt là bệnh về virus. Song cũng có những vƣờn do cây nhiễm virus từ khi còn nhỏ nên cây suy tàn sớm, buộc phải chặt bỏ. Huyện Tân Phú và Định Quán, tỉnh Đồng Nai Đây là vùng đất cũng khá màu mỡ song khí hậu có sự thay đổi lớn trong năm. Do sự khác biệt rõ rệt về khí hậu cũng nhƣ nguồn nƣớc tƣới giữa hai mùa mƣa và nắng nên ngƣời dân nơi đây chỉ trồng đu đủ vào mùa mƣa khi trời nóng ẩm và nguồn nƣớc tƣới dồi dào. Cũng tƣơng tự, cây đu đủ nơi đây cũng chỉ đƣợc trồng xen với cây khác nhƣ cây điều, mãng cầu,… nhƣng so với Đồng Tháp thì đất đai nơi đây nhìn chung nghèo dinh dƣỡng và khô cằn hơn với cấu hình đá tổ ong, chính vì vậy việc trồng đu đủ có nhiều khó khăn nhƣ: phải thƣờng xuyên bón phân, tƣới nƣớc, cây có sức chống chịu kém nên khi nhiễm bệnh cây nhanh chóng suy tàn,… Nhìn chung, do hiện nay ở nƣớc ta chƣa có sự đầu tƣ thích đáng cho việc sản xuất cũng nhƣ chế biến sản phẩm nên đu đủ ở nƣớc ta có giá trị kinh tế khá thấp (thƣờng chỉ khoảng 600 - 1200 đồng/ kg trái tƣơi). Chính nguyên nhân này kèm theo dịch bệnh virus càng làm cho nền sản xuất đu đủ chỉ ở mức nhỏ, tự phát, không tập trung, trồng xen tạm thời để lấy ngắn nuôi dài. 40 Về giống, chủ yếu ngƣời dân chọn cây cho trái tốt, thu quả, giữ hạt lại rồi tự ƣơm giống cho vụ sau chứ không mua từ trung tâm hay trại giống. Về phân bón, do cây đu đủ sử dụng rất nhiều dinh dƣỡng do đó cần bón nhiều. Các loại phân thƣờng sử dụng là N-P-K, Super lân, kali, urê … Thuốc bảo vệ thực vật thƣờng là các thuốc diệt côn trùng gây bệnh nhƣ thuốc diệt rệp, nhện, rầy… bao gồm Supracide, Admire 50EC, Danitol, Sherzol… Phƣơng pháp trồng nhìn chung là trồng xen thành từng hàng hoặc thành từng líp bao quanh các cây trồng chính. Qua đánh giá sơ bộ khi lấy mẫu, các vƣờn có tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng là khá cao, hầu nhƣ tất cả các cây trong vƣờn đều nhiễm bệnh với các dấu hiệu nhƣ có sọc dầu trên thân, cuống; lá biến dạng ở nhiều mức độ; trái có các đốm hình vòng nhẫn. Mức độ thiệt hại còn tùy thuộc vào thời điểm cây bị nhiễm bệnh (nếu cây nhiễm bệnh ở giai đoạn 3 – 4 tháng thì cây suy tàn, còi cọc, không cho trái; cây nhiễm ở giai đoạn 8 - 9 tháng thì vẫn cho trái nhƣng trái nhỏ, đôi khi bị biến dạng) và tình trạng dinh dƣỡng của cây (cây đƣợc chăm sóc tốt có sức chống chịu và đề kháng bệnh tốt hơn). 4.2. Kết quả thu đƣợc từ thí nghiệm với bộ kit DAS- ELISA 4.2.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo địa bàn điều tra Bảng 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo địa bàn điều tra Địa điểm Số mẫu điều tra Số mẫu nhiễm Tỉ lệ nhiễm bệnh (%) Tỉnh Đồng Tháp Huyện Cao Lãnh Xã Mỹ Hiệp 41 38 92,68 Xã Bình Thạnh 31 24 77,42 Tỉnh Đồng Nai Huyện Định Quán Xã Phú Tân 19 9 47,37 Huyện Tân Phú Xã Phú Lộc 19 9 47,37 Xã Phú An 25 4 16,00 Tổng 135 84 62,22 41 92.68 77.42 47.37 47.37 16.00 0.00 25.00 50.00 75.00 100.00 Xã Mỹ Hiệp Xã Bình Thạnh Xã Phú Tân Xã Phú Lộc Xã Phú An ĐỊA ĐIỂM LẤY MẪU TỈ LỆ NHIỄM BỆNH Tỉ lệ nhiễm bệnh (%) Đồ thị 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh trên các địa bàn điều tra Qua đánh giá kết quả từ Bảng 4.1 và Đồ thị 4.1, nhận thấy tỉ lệ nhiễm bệnh theo các vùng nhƣ sau: - Xã Mỹ Hiệp: 92,68 % - Xã Bình Thạnh: 77,42 % - Xã Phú Tân: 47,37 % - Xã Phú Lộc: 47,37 % - Xã Phú An: 16 % Nhận xét thấy tỉ lệ nhiễm bệnh ở vùng Đồng Tháp cao hơn hẳn Đồng Nai mặc dù điều kiện dinh dƣỡng và khí hậu ở Đồng Tháp tốt và thuận lợi hơn Đồng Nai. Nguyên nhân có thể do ở Đồng Tháp dù cây đã bị nhiễm virus song do đƣợc chăm sóc tốt nên cây có khả năng chống chịu cao vì thế vẫn sinh trƣởng đến khi ra hoa, kết trái; còn ở Đồng Nai, điều kiện tự nhiên khắc nghiệt hơn cộng với sự chăm sóc không tốt bằng ở Đồng Tháp nên một khi cây nhiễm bệnh sẽ nhanh chóng suy tàn, còi cọc và sớm bị loại bỏ, do đó cây còn tồn tại đƣợc thƣờng là cây có tính kháng bệnh hoặc chỉ nhiễm virus dòng nhẹ. 42 4.2.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây Bảng 4.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh Đốm vòng theo giống cây Địa điểm Giống cây Da bông (Db) Mã Lai (Ml) Địa phƣơng (Đp) (+)/Σ % (+) (+)/Σ % (+) (+)/Σ % (+) Tỉnh Đồng Tháp Huyện Cao Lãnh Xã Mỹ Hiệp 28/31 90,32 10/10 100 - - Xã Bình Thạnh 17/21 80,95 6/10 60 - - Tỉnh Đồng Nai Huyện Định Quán Xã Phú Tân - - - - 9/19 4,74 Huyện Tân Phú Xã Phú Lộc - - - - 9/19 47,37 Xã Phú An - - - - 4/25 16,00 Tổng 45/52 86,54 16/20 80 22/63 34,92 (+)/Σ: Số cây nhiễm bệnh trong tổng số cây % (+): Tỉ lệ cây nhiễm bệnh “-“ : không có lấy mẫu 86.54 80 34.92 0.00 25.00 50.00 75.00 100.00 Da bông (Db) Mã Lai (Ml) Địa phương (Đp) GIỐNG CÂY TỈ LỆ NHIỄM BỆNH Tỉ lệ nhiễm bệnh (%) Đồ thị 4.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây Nhận xét Từ Bảng 4.2 và Đồ thị 4.2 nhận thấy tỉ lệ nhiễm bệnh trên các giống cây nhƣ sau: - Giống Da Bông: 86,54 % - Giống Mã Lai: 80 % - Giống Địa phƣơng: 34,92 % 43 Giống Địa phƣơng chủ yếu thu mẫu từ tỉnh Đồng Nai do đó ở chỉ tiêu này ta chỉ có thể so sánh tình hình nhiễm bệnh trên hai giống Da bông và Mã Lai thu thập tại tỉnh Đồng Tháp. Theo đồ thị trên, nhận thấy giống Da bông có tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng cao hơn giống Mã Lai. 4.2.3. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây Bảng 4.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây Tuổi cây Số mẫu Số mẫu nhiễm bệnh Tỉ lệ nhiễm (%) 4 - 5 tháng (chƣa trái) 20 14 70,00 6 - 8 tháng 63 54 85,71 8 - 11 tháng 16 2 12,50 Trên 1 năm 36 13 36,11 Tổng 135 83 61,48 70.00 85.71 12.50 36.11 0.00 25.00 50.00 75.00 100.00 TỈ LỆ NHIỄM BỆNH 4-5 tháng (chưa trái) 6-8 tháng 8-11 tháng Trên 1năm TUỔI CÂY Tỉ lệ nhiễm (%) Đồ thị 4.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây Nhận xét Từ Bảng 4.3 và Đồ thị 4.3 nhận thấy tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây nhƣ sau: - Từ 4 - 5 tháng: 70 % - Từ 6 - 8 tháng: 85,71 % - Từ 8 - 11 tháng: 12,5 % - Trên 1 năm: 36,11 % 44 Nhƣ đã biết, virus PRSV này thƣờng phát triển và lây lan mạnh vào thời kì cây bắt đầu trƣởng thành (6 – 8 tháng), tuy nhiên cũng xuất hiện khi cây còn nhỏ (4 - 5 tháng). Còn tỉ lệ nhiễm bệnh trên độ tuổi 8 – 11 tháng và hơn 1 năm chiếm tỉ lệ thấp là do số lƣợng mẫu lấy ở độ tuổi này quá ít (16 mẫu 8 - 11 tháng tuổi, 36 mẫu hơn một năm tuổi). Do đó, đánh giá sự nhiễm bệnh theo độ tuổi trong thí nghiệm này do lƣợng mẫu lấy ở mỗi độ tuổi là quá ít nên không phản ánh chính xác mức độ nhiễm bệnh theo độ tuổi mà chỉ có thể cho ta biết rằng cây có thể nhiễm bệnh ở mọi độ tuổi, mọi giai đoạn của quá trình phát triển. 4.3. Kết quả thí nghiệm PCR Thiết kế thí nghiệm Chúng tôi tiến hành tách chiết RNA tổng số từ lá đu đủ bằng kit ly trích Aurum TM Total RNA Mini Kit (Catalog #732-6820) của công ty Bio- Rad. Từ dung dịch RNA thu đƣợc, tiến hành phản ứng sao chép ngƣợc thành DNA với bộ kit iScript TM cDNA Synthesis Kit cũng do Bio- Rad cung cấp. Sau đó, từ nguồn cDNA thu đƣợc, thực hiện phản ứng khuếch đại PCR với cặp mồi 1 (nêu ở phần vật liệu và phƣơng pháp). Sản phẩm nhân bản đƣợc phát hiện bằng điện di trên gel agarose 1,5 % cùng với thang 100 bp, nhuộm bằng ethium bromide, đọc kết quả bằng máy đọc gel. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: a) b) Hình 4.1 a) Chạy PCR với hóa chất và chu kì nhiệt chuẩn b) Chạy PCR với hóa chất chuẩn và chu kì nhiệt 1 và 2 LD: Ladder ĐQ: Mẫu lấy ở huyện Định Quán MH: Mẫu lấy ở xã Mỹ Hiệp TP: Mẫu lấy ở huyện Tân Phú BT: Mẫu lấy ở xã Bình Thạnh 300 bp 100 bp 650 bp 400 bp 300 bp 100 bp 45 Nhận xét: Khi thực hiện phản ứng PCR trên quy trình nhiệt chuẩn, chúng tôi thấy chỉ xuất hiện 1 band duy nhất có kích thƣớc 300 bp, không thấy band 900 bp. Để hoạt động của mồi đặc hiệu hơn, chúng tôi tiến hành thay đổi thông số về nhiệt độ (chu kì nhiệt 1 và 2) song sản phẩm thu đƣợc lại có nhiều band, và cũng không thấy xuất hiện band mong muốn. Do nhiệt độ thay đổi khá nhiều và gần đến nhiệt độ biến tính của mồi mà không thu đƣợc kết quả nên chúng tôi tiến hành giữ nguyên chu kì nhiệt chuẩn và chuyển sang thay đổi các thông số hóa chất trong phản ứng PCR. Qua nghiên cứu tài liệu về các chất có tác dụng hỗ trợ cho phản ứng PCR (enhancers of PCR), nhận thấy chất DMSO (Dimethylsulfoxide) là một chất có tác dụng duy trì sự tách mạch của DNA trong giai đoạn biến tính, qua đó hỗ trợ cho phản ứng khuếch đại hoàn toàn trình tự DNA, nhất là đối với những trình tự khá dài (Sambrook; Newton C.R., 1997). Nồng độ DMSO trong hỗn hợp phản ứng là 2 %. Kết quả thu đƣợc từ nghiệm thức với chu kì nhiệt chuẩn và thành phần hóa chất có bổ sung DMSO: Hình 4.2 Kết quả chạy PCR với cặp mồi 1 Nhận thấy, sản phẩm PCR xuất hiện nhiều band bao gồm band 900 bp (band có kích thƣớc mong muốn), 350 bp và 100 bp. Nhƣ vậy, DMSO đã phát huy tác dụng trong nghiệm thức này. Tuy nhiên, sản phẩm thu đƣợc đa kích thƣớc và band mong muốn khá mờ, nhƣ vậy chứng tỏ cặp mồi đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này là không đặc hiệu. Thật vậy, qua 900 bp 350 bp 100 bp 46 tra cứu các thông tin về độ đặc hiệu của cặp mồi 1 trên trang web NCBI- BLAST thấy chỉ mồi antisense là bắt cặp với đoạn gene CP của PRSV, còn mồi sense thì không thấy sự bắt cặp nào với gene CP. Độ đặc hiệu của mồi xuôi 1 Query = Sense 5‟- ATC ATT CCA TGG GCG TGT TCC ATG AAT CAA- 3‟ (30 letters) Taxonomy reports Distribution of 5 Blast Hits on the Query Sequence Hình 4.3 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi xuôi 1 Các trình tự đích có khả năng bắt cặp với mồi xuôi 1 (đƣợc xắp xếp theo thứ tự giảm dần về độ đặc hiệu của mồi)  gi|21627138|gb|AE003811.3| Drosophila melanogaster chromosome 2R, section 39 of 74 of the complete sequence  gi|49609491|emb|BX950851.1| Erwinia carotovora subsp. atroseptica SCRI1043, complete genome  gi|24653840|ref|NM_166092.1| Drosophila melanogaster CG16801-PA, isoform A (CG16801) mRNA, complete cds  gi|24653838|ref|NM_137188.1| Drosophila melanogaster CG16801-PB, isoform B (CG16801) mRNA, complete cds  gi|13430987|gb|AC008342.12|AC008342 Drosophila melanogaster, chromosome 2R, region 51F-51F, BAC clone BACR33K06, complete sequence Độ đặc hiệu của mồi ngƣợc 1 Query = Antisense 5‟- AGC TAA CCA TGG GCG AGT ATT CAG TTG CGC- 3‟ (30 letters) 47 Taxonomy reports Distribution of 40 Blast Hits on the Query Sequence Hình 4.4 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi ngƣợc 1 Các trình tự đích có khả năng bắt cặp với mồi ngƣợc 1 (đƣợc xắp xếp theo thứ tự giảm dần về độ đặc hiệu của mồi)  gi|29469899|gb|AY231130.1| Papaya ringspot virus Mex-VrPO, complete genome  gi|3882013|emb|AJ012649.1|PRI012649 Papaya ringspot virus CP gene, isolate Veracruz (VTB-6), partial cds  gi|247640|gb|S89893.1| 3' region: coat protein [papaya ringspot virus PRSV, type W Australian isolate, Cucurbita pepo cv. Green Ruffles (Northrup King), Genomic RNA, 1070 nt]  gi|6694283|gb|AF196839.1|AF196839 Papaya ringspot virus isolate H1K coat protein gene, partial cds  gi|6694281|gb|AF196838.1|AF196838 Papaya ringspot virus isolate Puerto Rico coat protein gene, partial cds 48  gi|3511154|gb|AF063220.1| Papaya ringspot virus isolate P polyprotein gene, partial cds  gi|12744709|gb|AF319507.1|AF319507 Papaya ringspot virus isolate VrCo-7 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744707|gb|AF319506.1|AF319506 Papaya ringspot virus isolate VrCa-15 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744705|gb|AF319505.1|AF319505 Papaya ringspot virus isolate VrAc-27 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744703|gb|AF319504.1|AF319504 Papaya ringspot virus isolate TbC-43 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744701|gb|AF319503.1|AF319503 Papaya ringspot virus isolate TbC-42 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744699|gb|AF319502.1|AF319502 Papaya ringspot virus isolate SpT-27 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744697|gb|AF319501.1|AF319501 Papaya ringspot virus isolate CpPM- 40 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744695|gb|AF319500.1|AF319500 Papaya ringspot virus isolate CpPM- 39 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744693|gb|AF319499.1|AF319499 Papaya ringspot virus isolate YcY-15 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744689|gb|AF319497.1|AF319497 Papaya ringspot virus isolate VrCo-1 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744687|gb|AF319496.1|AF319496 Papaya ringspot virus isolate VrAl-18 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744685|gb|AF319495.1|AF319495 Papaya ringspot virus isolate TmLC- 70 coat protein (CP) gene,partial cds  gi|12744683|gb|AF319494.1|AF319494 Papaya ringspot virus isolate TmCM- 25 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744681|gb|AF319493.1|AF319493 Papaya ringspot virus isolate QrFC-3 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744679|gb|AF319492.1|AF319492 Papaya ringspot virus isolate QrFC-2 coat protein (CP) gene, partial cds . nhiễm bệnh ở vùng Đồng Tháp cao hơn hẳn Đồng Nai mặc dù điều kiện dinh dƣỡng và khí hậu ở Đồng Tháp tốt và thuận lợi hơn Đồng Nai. Nguyên nhân có thể do ở Đồng Tháp dù cây đã bị nhiễm virus. 4/25 16, 00 Tổng 45/52 86, 54 16/ 20 80 22 /63 34,92 (+)/ : Số cây nhiễm bệnh trong tổng số cây % (+ ): Tỉ lệ cây nhiễm bệnh “-“ : không có lấy mẫu 86. 54 80 34.92 0.00 25.00 50.00 75.00 100.00 Da. trên hai giống Da bông và Mã Lai thu thập tại tỉnh Đồng Tháp. Theo đồ thị trên, nhận thấy giống Da bông có tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng cao hơn giống Mã Lai. 4.2.3. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây