Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen của gen mã hoá protein vỏ (coat protein) từ virus gây bệnh đốm vòng cây đu đủ (PRSV) ở việt nam

Phần 1 Tổng quan tài liệu 1.1. Đặc điểm của cây đu đủ 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại 1.1.2. Giá trị kinh tế 1.1.3. Phân bố

Mục lụcMở đầuPhần 1 Tổng quan tài liệu1.1. Đặc điểm của cây đu đủ1.1.1. Nguồn gốc và phân loại 1.1.2. Giá trị kinh tế 1.1.3. Phân bố1.1.4. Các bệnh về cây đu đủ1.2. Đặc điểm virus gây bệnh đốm vòng ở đu đủ (PRSV)1.2.1. Cấu trúc 1.2.2. Cơ chế lan truyền 1.2.3. Các biện pháp phòng trừ 1.2.4. Gen kháng virus1.2.5. Những thành tựu trong việc chống lại PRSV ở cây đu đủ1.2.5.1. Trường đại học Hawaii và đại học Cornell, Mỹ1.2.5.2. Trường đại học Kasetsart, Thailand và Queensland, Austrailia1.2.5.3. Trung tâm Công nghệ sinh học, MARDI, Malaysia1.3. Công nghệ sinh học phân tử và ứng dụng để tạo cây chuyển gen1.3.1. Một số vector sử dụng trong sinh học phân tử1.3.1.1 Vector nhân dòng TA-cloning1.3.1.2 Vector biểu hiện protein pRSET1.3.1.3 Vector chuyển gen 1.3.2. Một số loại enzim sử dụng trong sinh học phân tử1.3.2.1 Enzim sao mã ngược (reverse transcriptase)1.3.2.2 Enzim ligase1.3.2.3 Enzim DNA polymerase1.3.2.4 Enzim cắt giới hạn (restriction enzim)1 1.3.2.5 Enzim Mung-bean nuclease1.3.3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử1.3.3.1 Kỹ thuật RT-PCR1.3.3.2 Kỹ thuật Western blotting1.4. Công nghệ thông tin và ứng dụng trong sinh học phân tử1.4.1. Phần mềm tin học DNAstar sử dụng trong SHPT1.4.2. Internet và SHPT.Phần 2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu2.1. Nguyên liệu2.2. Phương pháp2.2.1. Tách RNA tổng số chứa mRNA mã hoá protein vỏ của virus PRSV2.2.2. Phương pháp điện di2.2.3. Thiết kế Primer2.2.4. Phương pháp RT-PCR2.2.5. Phương pháp tách và tinh sạch DNA từ gel Agarose bằng ly tâm2.2.6. Phản ứng ghép nối đoạn gen với vector2.2.7. Phương pháp xử lý với enzim giới hạn và Mung-bean nuclease2.2.8. Phương pháp biến nạp2.2.9. Ki m tra khu n l c ch a vector tái t h p b ng PCRể ẩ ạ ứ ổ ợ ằ2.2.10. Tách chiết DNA plasmid từ E. coli2.2.11. Phân tích trình tự nucleotide2.2.12. Thiết kế vector chuyển gen mang gen PRSVN2.2.13. Biểu hiện gen CP trong E.coli 2.2.14. Western blottingPhần 3 Kết quả và thảo luậnPhần 4 Kết luận và đề nghịPhần 5 Tài liệu tham khảo2 Mở đầuĐu đủ là cây ăn quả được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Quả chín để ăn tráng miệng và quả xanh được dùng làm salad. Ngoài ra nhựa đu đủ còn là nguyên liệu tách chế phẩm enzim papain có giá trị thương mại sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và thuộc da. ở Việt Nam, diện tích trồng đu đủ vào khoảng 2500 ha với sản lượng khoảng 100.000 tấn ước tính đạt 200 - 300 tỉ đồng [17].Nhưng hạn chế lớn nhất đối với sự phát triển cây đu đủ là sự hoành hành của bệnh đốm vòng do virus đốm vòng (papaya ringspot virus) gây ra. Virus này thuộc nhóm Potyirus có vật liệu di truyền là sợi ARN đơn. Khi virus này nhiễm vào cây đu đủ thì làm cho lá cây có những vòng đốm và mất khả năng quang hợp dẫn đến giảm nghiêm trọng năng suất và chất lượng quả. Bệnh được truyền do các loại rệp cây nên lan rộng rất nhanh. Đến nay toàn bộ các vùng trồng đu đủ ở nước ta [17] cũng như Austrailia [16], Thái Lan [14], Đài Loan [18], Malaysia [10] . và đặc biệt là Hawaii [5] đều đã bị nhiễm bệnh.Những phương pháp thường sử dụng để ngăn chặn sự lan rộng của PRSV như chặt bỏ cây bị bệnh, cách ly vùng bị bệnh [7], sử dụng thuốc trừ sâu để diệt rệp truyền bệnh hay sử dụng chủng PRSV yếu cho nhiễm vào cây chưa bị bệnh để ngăn sự nhiễm các chủng mạnh hơn theo cơ chế bảo vệ chéo [19,20]. Nhưng những phương pháp này chỉ làm giảm sự lan truyền mang tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại bệnh này.Hiện nay nhờ ứng dụng tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền, người ta đã tạo ra các giống cây trồng có khả năng kháng lại bệnh do virus gây ra bằng cách đưa gen mã hoá protien vỏ (coat proetin gene) của virus vào genom của thực vật. Thành công đầu tiên là ở thuốc lá và cà chua kháng lại virus khảm thuốc lá [12]. Sau đó là sự kháng lại nhiều loại virus khác như cucumber mosaic virus [1], alfalfa mosaic 3 virus [6] và potato leaf roll virus [4]. Gần đây ở Hawaii đã tạo được dòng đu đủ 55-1 kháng lại PRSV [2,3]. Dòng đu đủ được chuyển gen này đã trở thành giống thương mại sau khi lai với giống Kapoho [9]. Nhưng tính kháng của cây đu đủ chuyển gen này chỉ có hiệu quả đối với các chủng virus của Hawai mà không kháng với các chủng virus từ các vùng khác [15]. Chính vì vậy mà cần phải tách dòng gen mã hoá protien vỏ (coat protein gene) từ chính các virus gây bệnh của vùng đó thì mới có khả năng tạo ra cây kháng bệnh.Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi đã xây dựng đề tài: " Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen của gen mã hoá protein vỏ (coat protein) từ virus gây bệnh đốm vòng cây đu đủ (PRSV) ở việt nam". Với mục đích là tạo được một vector chuyển gen mang gen mã hoá cho protein vỏ của PRSV của Việt Nam phục vụ cho việc chuyển gen này vào cây đu đủ tạo ra giống đu đủ mới có khả năng kháng lại PRSV ở Việt Nam.4 Phần 1Tổng Quan tài liệu1.1 Đặc điểm cây đu đủ1.1.1 Nguồn gốc và phân loại:Đu đủ (Carica papaya L.) thuộc giống Carica, chi Caricaeae, họ hai lá mầm. Trong chi còn 3 giống khác là Cyclimorpha, Jacaratia và Jarilla. Đu đủ đợc biết có tới 45 loài trong giống Carica (Willis 1973).Các loài của Carica papaya L. đã đợc tìm thấy dạng dại trong tự nhiên. Nó có thể đợc bắt đầu từ vùng đất thấp của Trung Mỹ, giữa Nam Mexico và Nicaragua (Story 1969), có thể từ sự lai giống giữa hai loài Carica Mexico. Đu đủ đợc phát tán dọc theo đờng biển thơng mại vùng nhiệt đới nhờ những ngời thám hiểm và nhà buôn vào giữa thế kỷ 16. Năm 1601, ngời Bồ Đào Nha đã phổ biến cây đu đủ tới ấn độ và Malaca, ngời Tây Ban Nha đã đa cây đu đủ vào Philippin . Ngày nay, đu đủ có thể thấy trong phạm vi từ vĩ tuyến 320 Bắc đến 320 Nam của xính đạo. Nó đợc trồng phổ biến trong đồn điền hoặc mùa vụ tiểu nông.Đu đủ là loại cây trồng cho quả ăn nhỏ, dạng cây thảo. Cây sinh trởng lâu năm nhng thời kỳ cây con ngắn, trung bình khoảng 6 tháng. Sau một năm có thể cho thu hoạch quả chín và sau đó là thu hoạch liên tục trong vòng nhiều năm. Hầu hết cây trồng mang tính thơng mại chỉ đợc thu hoạch trong vòng 3 hoặc 4 năm trớc khi tàn lụi và cây trở lên quá cao gây khó khăn cho việc thu hoạch. Một cây cho sản lợng từ 30 đến 40 kg quả chín trong một năm. Năng suất từ 30 - 40 tấn/ha/năm và có thể đạt 100 tấn/ha/năm.5 Đu đủ là cây đa tính, nhiều loài là khác gốc (cây đực và cái riêng rẽ), nhiều loài là cùng gốc (cây lỡng tính). Cây khác gốc phải đợc thụ phấn chéo do sự chia rẽ của nhị và nhuỵ hoa và hầu nh sự phân tán của phấn hoa là nhờ gió. Cây cùng gốc có hoa lỡng tính nên có hiện tợng tự thụ phấn.1.1.2. Giá trị dinh dỡng và kinh tế của cây đu đủĐu đủ đợc sử dụng chủ yếu là quả chín làm món ăn tráng miệng vì quả có vị ngon, rất giầu vitamin và muối khoáng(Table 1), một phần quả xanh đợc dùng làm salad, lá xanh dùng để hầm thịt trong một số món ăn truyền thống. Ngoài ra, nhựa đu đủ còn đợc sử dụng làm nguyên liệu tách chế phẩm papain (chiếm 1% chất khô của quả xanh) là enzim thơng mại đợc sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và thuộc da. Thêm nữa, đu đủ còn đợc coi là một loại dợc liệu quí: rễ, hoa, lá đợc dùng rộng rãi trong đông y nh hoa đu đủ đực đợc dùng để trị ho, hạt dùng làm thuốc chống giun sán, hạ sốt .(Vũ Công Hậu)Table 1: Thành phần dinh dỡng của quả đu đủ chín (100g)Thành phần 100g quả chínNăng lợng 35.0 - 59 calNớc 88.4 - 90.7 gProtein 1.0 - 1.5 gChất béo 0.1 gCarbohydrates 7.1 - 13.5 gAsh 0.1 gCalcium 11.0 - 31.0 mgPhospho 7.0 - 17 mgIron 0.6 - 0.7 mgSodium 2.0 - 3.0 mgPotassium 39 - 337 mgCarotene 1.16 - 2.43 mgVitamin B1 0.03 - 0.08 mgVitamin B2 0.7 - 0.15 mgNiacin 0.1 mgVitamin C 69.3 - 71.0 mgSản lợng quả đu đủ chín ở nớc ta ớc tính đạt 100.000 tấn/năm. Mỗi kg quả chín trị giá khoảng 2500đ đến 3500đ thì tổng giá trị đạt từ 2500 - 3500 tỉ đồng (khoảng 150 -200 triệu USD). 6 Tổng sản lợng quả đu đủ tơi trên thế giới năm 1995 ớc tính đạt 5.9 triệu tấn đạt giá trị khoảng 15 đến 20 tỉ USD (Sản lợng quả đu đủ hàng năm của một số nớc sản xuất chính đợc đa ra trong bảng 2). Bảng 2: Sản lợng quả đu đủ hàng năm của một số nớcNớc sản xuất Tổng sản lợng các năm ( x1000 tấn)1984 1987 1990 1993 1995Châu Phi 237 247 282 -Nam Mỹ - - 685 723 754Bắc Mỹ - - 1697 1738 1872Hawaii - - - 2866 3208Thailan - - 206.5 363 342.9Malaysia - 84.28 - - 66Philipine - - 65 64.8 58.1Việt Nam - - - - 100Indonexia - - 349.6 422.4 714.1(-) số liệu không đợc xác định1.1.3. Phân bốở nớc ta đu đủ đợc trồng trong vờn nhà ( từ 5 đến 10 cây) của gần 50% hộ nông dân. Đu đủ cũng đợc trồng tập trung trong các nông trờng hoặc trang trại vùng đồng bằng sông hồng, ven biển miền trung, đồng bằng sông Mekong và sờn núi đá vôi. Tổng diện tích vào khoảng 2500 ha gồm khoảng 1250 ha trồng tập trung (Bảng 3) và 1250 ha trồng trong vờn nhà Bảng 3: Vùng phân bố tập trung của cây đu đủ ở Việt NamVùng phân bố Diện tích (ha)Vùng núi và trung du phía bắc - Sơn La - Lạng Sơn500Đồng bằng sông Hồng - Hà Nội - Hng Yên - Nam Hà - Ninh Bình250Ven biển miền trung - Nghệ An1007 - Thanh hoáĐồng bằng sông Mekong - Ninh Thuận - Nha Trang - Tây Ninh - Tiền Giang 500-5501.1.4. Các bệnh và sâu hại của cây đu đủ- Bệnh đốm vòng: Hạn chế lớn nhất đối với sự phát triển cây đu đủ là sự hoành hành của bệnh đốm vòng do virus đốm vòng (papaya ringspot virus) gây ra. Khi virus này nhiễm vào cây đu đủ thì lá cây có những vòng đốm, các gân lá xoăn lại và phồng lên làm mất khả năng quang hợp, ở quả có những vòng xanh ô lu. Cây chậm phát triển dẫn đến giảm nghiêm trọng năng suất và chất lợng quả. Bệnh đợc truyền do các loại rệp cây nên lan rộng rất nhanh. Hiện nay tất cả các vùng trồng đu đủ ở nớc ta đều đã bị nhiễm bệnh kể cả khi lấy hạt của những cây đu đủ không bị bệnh đem gieo thì cũng chỉ khoảng 4- 5 tháng sau khi trồng cha kịp thu hoạch đã thấy xuất hiện triệu trứng bệnh.- Rệp sáp, rệp mình mềm, bọ nhảy . ngoài việc hút nhựa gây tác hại trực tiếp còn là vật truyền bệnh PRSV nhất thiết phải trị bằng những thuốc hiện có nh Bi 58ND, Mipcin 20ND, Trebon 10ND, Applaud-BAM 50ND Những cây đu đủ trồng lẻ tẻ, không chăm sóc có rất nhiều loại côn trùng và thực sự là những ổ dịch nếu không phá bỏ thì nghề trồng đu đủ rất khó phát triển. - Tuyến trùng: tấn công vào rễ, gây những nốt sần. Bệnh bị nặng ở nơi đất cát, nơi đã trồng đu đủ nhiều vụ. Phòng trị bằng luân canh, đổ formalin 4% 25cc vào mỗi hố trồng.- Nhện đỏ: Gây hại chủ yếu vào mùa khô, đẻ trứng ở phía dới lá, cả sâu non và sâu trởng thành đều hút nhựa làm cho phiến lá mất diệp lục, chuyển màu vàng. Trị bằng Kelthane hoặc nếu không dùng Trebon phun vào dới lá.- Bệnh nấm Helminthosporium: gây cháy lá làm cho lá bị biến màu và khô rụng (Phun Kitazin 0,2% có thể hỗn hợp với vôi 1%)- Bệnh phấn trắng: do nấm Oidium caricae gây ra (phun Benomyl, Zineb và cácthuốc thuộc nhóm lu huỳnh)8 - Bệnh nấm Phytophtora: Vừa hại rễ, vừa hại quả. Nấm ở trong đất khó phòng trị, ở Hawaii ngời ta dùng thuốc xông hơi để trị. Tạo những điều kiện không thuận lợi cho nấm phát triển nh: trồng trên lip đất cao, luân canh, tránh cuốc xới làm đứt rễ.1.2. Đặc điểm của PRSV1.2.1 Cấu trúcPRSV thuộc loại potyvirus, nhóm gồm có khoảng 160 loại khác nhau. Nhóm potyvirus là lớn nhất và quan trọng nhất về sự ảnh hởng đến kinh tế của virus gây bệnh ở thực vật. Những virus của nhóm này có genome là sợi RNA đơn cuốn vòng với kích thớc 780x12nm. Nó chứa khoảng 10kb liên kết với protein ở đầu 5' (VPg) và có đuôi polyA đầu 3' (Shukla et.al 1994). Sợi RNA genome này đ-ợc bao bọc bằng vỏ protein (Capsid). Vỏ protein là sự lặp lại của những tiểu phần nhỏ là protein vỏ (coat protein). RNA genome của PRSV đợc dịch mã trong tế bào chủ tạo ra polyprotein. Polyprotein này thuỷ phân tạo ra 12 protein trong đó có protein vỏ (viral coat protein). Trong suốt quá trình nhiễm trong tế bào chủ, virus sử dụng nguyên liệu của tế bào chủ để tạo ra những bản sao genome cũng nh các protein của nó. Sau đó RNA và những tiểu phần protein vỏ tự lắp ráp với nhau tạo ra những virus hoàn chỉnh riêng biệt có khả năng nhiễm sang các tế bào khác trong cây hoặc sang các cây khác nhờ côn trùng.Genome của virus mã hoá khoảng 12 loại protein. Một vài loại thì chức năng của nó không hoàn toàn đợc xác định, một vài loại thì có nhiều chức năng khác nhau. Một số chức năng đã đợc xác định là vỏ protein, nhân, thân hình trụ, phần bổ trợ liên quan đến sự truyền nhờ côn trùng, helicase và nhiều protease, replicase, protein liên kết genome, ATPase.1.2.2. Cơ chế lan truyền của PRSVPRSV đợc truyền dễ dàng đến tế bào chủ thân thuộc nhờ nhiều loài rệp cây khác nhau với phơng thức không liên tục. Virus đợc truyền không liên tục nhờ rệp cây là vì sự tồn tại trong vật truyền trung gian là rất ngắn, ngắn hơn cả thời gian 9 tồn tại của virus trong dịch chiết lá cây. Trong quá trình truyền không liên tục, virus đợc truyền sang côn trùng sau khi sinh trởng một thời gian ngắn trong cây bị nhiễm và có thể đợc truyền tới một hoặc vài cây ngay lập tức hay sau nhiều giờ. Có sự khác nhau trong vật truyền đặc hiệu của từng loại virus riêng biệt trong nhóm thậm chí giữa các dạng sinh học của cùng một loại virus. Điều này nói lên rằng cơ chế của sự tơng tác virus - vector vợt ra ngoài tính chất sinh học chung của virus và vector truyền của nó [ ]. 1.2.3. Các biện pháp phòng trừ - Sử dụng các chất hoá học tiêu diệt rệp truyền bệnh. - Loại bỏ các cây bị bệnh, tránh trồng gần các cây họ bầu bí là ký chủ của các côn trùng truyền bệnh.- Cách ly với các vùng có cây bị bệnh. Các vùng cách ly có thể tạm thời không bị bệnh nhng do sự bùng phát của PRV thì các vùng trên cũng sẽ bị nhiễm. Điều này thấy rõ ở các vùng trồng đu đủ qui mô lớn ở Hawaii (isherwood,1994)Các phơng pháp này chỉ áp dụng đợc khi cây cha bị nhiễm bệnhvà mang tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại đợc bệnh này- Cơ chế kháng chéo: sử dụng một chủng PRV yếu cho nhiễm vào cây (ví dụ chủng HA5-1) để ngăn chặn sự lây nhiễm của các chủng PRV mạnh hơn. Nhợc điểm của phơng pháp này là các cây bị nhiễm chủng PRV yếu tuy có các dấu hiệu bị bệnh nhẹ hơn nhng thiệt hại về sản lợng cũng lên tới 10-20%.(Yeh và Gonsalves, 1994).1.2.4. Gen kháng virusTừ nhiều năm, ngời ta đã biết cây cỏ có thể trở nên kháng đối với các chủng virus gây bệnh nếu trớc đó gây nhiễm chúng với cùng loại hay với virus tơng tự. Hiện tợng này gọi là bảo vệ chéo. Hình nh protein vỏ của thể virus đóng vai trò quyết định đối với tính kháng chéo, bởi vì khi gen CP của nhiều loại virus RNA đ-ợc thể hiện trong cây (cũng không nhất thiết phải có sự biểu hiện gen mã hoá protein vỏ ở mức độ cao) thì phản ứng bảo vệ chéo biểu hiện. Tính kháng virus còn có thể đạt đợc khi biến nạp thực vật với DNA có những đoạn mã hoá RNA vệ tinh. Cơ chế bảo vệ chéo còn cha đợc giải thích đầy đủ nhng có thể giả thiết rằng giữa 10 [...]... Gen CP của dòng virus PRSV HA 5-1 vào vector pGA482 và chuyển thành công vào giống đu đủ "Sunset" bằng súng bắn gen Họ đã tạo ra hai dòng đu đủ mang tên 55-1 và 63-1 có mang gen CP trong genom và đã kiểm tra bằng lai Southern và ELISA Kết quả thử nghiệm khả năng kháng bệnh của thế hệ R1 từ dòng 55-1 cho thấy nó có tính kháng bệnh rất cao (chỉ có 5% của 128 cây đợc thử nhiễm bệnh) đối với các dòng virus. .. Hassan Matd Daud tách phân lập gen CP từ các chủng virus của Malaysia Dr Tan Chong Seng thiết kế cấu trúc CP gen, đa vào vector p2K7 dùng cho chuyển gen bằng súng bắn gen và vector pCAMBIA2300 dùng cho chuyển gen bằng Agrobacterium Dr Vilasini Pillai: chuyển gen CP vào giống đu đủ Ekotika Hiện nay đã thu đợc cây chuyển gen Ro đợc khẳng định bằng lai southern nhng cha đợc thử khả năng kháng bệnh 1.3 Sinh...thể virus gây nhiễm và tế bào chủ có sự hoà trộn sản phẩm biểu hiện của gen nên đã tạo ra tính kháng virus của cây Bằng việc sử dụng các tiến bộ trong kỹ thuật di truyền, ngời ta đã chuyển gen CP của virus vào giống đu đủ, tạo cho cây có khả năng kháng bệnh virus Đây là một thành tựu lớn của công nghệ sinh học trong việc chống lại bệnh PRSV Các dòng đu đủ chuyển gen này sẽ góp phần... giống cây trồng kháng bệnh virus Nhóm các nhà khoa học gồm có: Dr Dennis Gonsalves, Khoa bệnh học thực vật, đại học Cornell, tham gia trong việc tách phân lập gen CP từ virus PRSV Dr Jerry Slightom thiết kế cấu trúc gene CP dùng cho chuyển gen Dr Maureen Fitch (USDA) chuyển gen CP vào đu đủ Dr Richarh Manshardt, Khoa trồng trọt, đại học Hawaii, tham gia kiểm tra và khảo nghiệm các dòng cây chuyển gen. .. phòng trừ bệnh PRSV 1.2.5 Những thành tựu trong việc chống lại PRSV ở cây đu đủ Trên thế giới đã có nhiều phòng thí nghiệm làm về chuyển gen ở thực vật, nhng đối với sự chuỷên gen CP để tạo cây kháng PRSV thì chỉ có một số phòng thí nghiệm nổi bật là: 1.2.5.1 Trờng đại học Hawaii và đại học Cornell, Mỹ Hai nơi này đã đi tiên phong trong việc chuyển gen CP vào đu đủ để kháng bệnh đốm vòng và đã mở ra một... đối với các dòng virus tách từ Hawaii Nhng không kháng đợc các dòng tách từ nơi khác (vd: Thailand) Vì thịt quả của dòng 55-1 có mầu hồng không phù hợp với thị trờng nên dòng 55-1 này đã đợc lai với giống Kapoho tạo ra dòng "Rainbow" có thịt quả mầu vàng mang đầy 11 đủ các đặc tích của giống gốc Hiện nay dòng "Rainbow" đã đợc đăng ký bản quyền và trở thành giống đu đủ chuyển gen thơng mại đầu tiên... chèn vào (hình ) Hình : Bản đồ vector TA-cloning pCR2.1 13 1.3.1.2 Vector biểu hiện protein pRSET Vector pRSET có nguồn gốc là các vector biểu hiện pUC, đợc thiết kế cho sự biểu hiện protein và tinh chế protein ở mức độ cao trong E coli Sự biểu hiện ở mức độ cao của các trình tự DNA đợc đa vào vector pRSET đợc tạo ra do sự điều khiển của T7 promoter Đoạn DNA đợc đa vào vị trí trong khung dịch mã với... khung dịch mã của vector và đoạn DNA đợc chèn vào Vector tái tổ hợp pRSET đợc chuyển vào E coli TOP 10F để nhân dòng và duy trì Muốn biểu hiện protein tái tổ hợp thì cấu trúc vector này phải đợc chuyển 14 vào E coli BL21 (DE3) là chủng E coli biểu hiện T7 polymerase dới sự điều khiển của lacUV5 promoter và một plasmid biểu hiện T7 lysozyme Sự biểu hiện của T7 polymerase cần thiết cho sự tổng hợp protein. .. [11] - Sự biểu hiện của các gen vir đợc điều khiển bởi hệ thồng gồm hai thành phần là protein VirA và protein VirG Protein VirA là định vị trên màng tế bào, nó có khả năng tự phosphoryl hoá ở gốc histidine 474 và gốc photphat này đợc chuyển tới protein VirG Sau đó protein VirG hoạt hoá sự phiên mã của các gen vir khác [14] Tuy nhiên các hoạt động cần thiết cho quá trình tạo T-ADN và hình thành phức... trình phát triển cây đu đủ chuyển gen kháng bệnh PRSV đợc tài trợ của ACIAR kết hợp giữa trờng đại học Kasetsart, Thailand và Queensland, Austrailia Gen CP đã đợc tách từ các chủng virus của Thailand Gen này đợc chuyển vào hai giống Khak-Dum và Khak-Nual bằng phơng pháp bắn gen với nguyên liệu là phôi non qua giai đoạn mô sẹo Hiện nay họ cũng đã thu đợc cây chuyển gen, đang thử nghiệm tính kháng PRSV . " Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen của gen mã hoá protein vỏ (coat protein) từ virus gây bệnh đốm vòng cây đu đủ (PRSV) ở việt nam& quot;. Với. được một vector chuyển gen mang gen mã hoá cho protein vỏ của PRSV của Việt Nam phục vụ cho việc chuyển gen này vào cây đu đủ tạo ra giống đu đủ mới có