Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen của gen mã hoá protein vỏ (coat protein) từ virus gây bệnh đốm vòng cây đu đủ (PRSV) ở việt nam

Phần 1 Tổng quan tài liệu 1.1. Đặc điểm của cây đu đủ 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại 1.1.2. Giá trị kinh tế 1.1.3. Phân bố

Mục lụcMở đầu

Phần 1 Tổng quan tài liệu1.1 Đặc điểm của cây đu đủ

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại 1.1.2 Giá trị kinh tế

1.2.5 Những thành tựu trong việc chống lại PRSV ở cây đu đủ1.2.5.1 Trường đại học Hawaii và đại học Cornell, Mỹ

1.2.5.2 Trường đại học Kasetsart, Thailand và Queensland, Austrailia1.2.5.3 Trung tâm Công nghệ sinh học, MARDI, Malaysia

1.3 Công nghệ sinh học phân tử và ứng dụng để tạo cây chuyển gen1.3.1 Một số vector sử dụng trong sinh học phân tử

1.3.1.1 Vector nhân dòng TA-cloning1.3.1.2 Vector biểu hiện protein pRSET1.3.1.3 Vector chuyển gen

1.3.2 Một số loại enzim sử dụng trong sinh học phân tử1.3.2.1 Enzim sao mã ngược (reverse transcriptase)1.3.2.2 Enzim ligase

1.3.2.3 Enzim DNA polymerase

1.3.2.4 Enzim cắt giới hạn (restriction enzim)

1.3.2.5 Enzim Mung-bean nuclease1.3.3 Một số kỹ thuật sinh học phân tử1.3.3.1 Kỹ thuật RT-PCR

1.3.3.2 Kỹ thuật Western blotting

1.4 Công nghệ thông tin và ứng dụng trong sinh học phân tử1.4.1 Phần mềm tin học DNAstar sử dụng trong SHPT1.4.2 Internet và SHPT.

Phần 2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu2.1 Nguyên liệu

2.2 Phương pháp

2.2.1 Tách RNA tổng số chứa mRNA mã hoá protein vỏ của virus PRSV2.2.2 Phương pháp điện di

2.2.3 Thiết kế Primer2.2.4 Phương pháp RT-PCR

2.2.5 Phương pháp tách và tinh sạch DNA từ gel Agarose bằng ly tâm2.2.6 Phản ứng ghép nối đoạn gen với vector

2.2.7 Phương pháp xử lý với enzim giới hạn và Mung-bean nuclease2.2.8 Phương pháp biến nạp

2.2.9 Ki m tra khu n l c ch a vector tái t h p b ng PCRểm tra khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp bằng PCR ẩn lạc chứa vector tái tổ hợp bằng PCR ạc chứa vector tái tổ hợp bằng PCR ứa vector tái tổ hợp bằng PCR ổ hợp bằng PCR ợp bằng PCR ằng PCR2.2.10 Tách chiết DNA plasmid từ E coli

Mở đầu

Đu đủ là cây ăn quả được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới.Quả chín để ăn tráng miệng và quả xanh được dùng làm salad Ngoài ra nhựa đuđủ còn là nguyên liệu tách chế phẩm enzim papain có giá trị thương mại sử dụngtrong công nghiệp thực phẩm và thuộc da ở Việt Nam, diện tích trồng đu đủ vàokhoảng 2500 ha với sản lượng khoảng 100.000 tấn ước tính đạt 200 - 300 tỉ đồng [17].

Nhưng hạn chế lớn nhất đối với sự phát triển cây đu đủ là sự hoành hànhcủa bệnh đốm vòng do virus đốm vòng (papaya ringspot virus) gây ra Virus nàythuộc nhóm Potyirus có vật liệu di truyền là sợi ARN đơn Khi virus này nhiễmvào cây đu đủ thì làm cho lá cây có những vòng đốm và mất khả năng quang hợpdẫn đến giảm nghiêm trọng năng suất và chất lượng quả Bệnh được truyền do cácloại rệp cây nên lan rộng rất nhanh Đến nay toàn bộ các vùng trồng đu đủ ở nướcta [17] cũng như Austrailia [16], Thái Lan [14], Đài Loan [18], Malaysia [10] vàđặc biệt là Hawaii [5] đều đã bị nhiễm bệnh.

Những phương pháp thường sử dụng để ngăn chặn sự lan rộng của PRSVnhư chặt bỏ cây bị bệnh, cách ly vùng bị bệnh [7], sử dụng thuốc trừ sâu để diệtrệp truyền bệnh hay sử dụng chủng PRSV yếu cho nhiễm vào cây chưa bị bệnh đểngăn sự nhiễm các chủng mạnh hơn theo cơ chế bảo vệ chéo [19,20] Nhưngnhững phương pháp này chỉ làm giảm sự lan truyền mang tính chất phòng trừ chứkhông thể chống lại bệnh này.

Hiện nay nhờ ứng dụng tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền, người ta đãtạo ra các giống cây trồng có khả năng kháng lại bệnh do virus gây ra bằng cáchđưa gen mã hoá protien vỏ (coat proetin gene) của virus vào genom của thực vật.Thành công đầu tiên là ở thuốc lá và cà chua kháng lại virus khảm thuốc lá [12].Sau đó là sự kháng lại nhiều loại virus khác như cucumber mosaic virus [1],

alfalfa mosaic virus [6] và potato leaf roll virus [4] Gần đây ở Hawaii đã tạođược dòng đu đủ 55-1 kháng lại PRSV [2,3] Dòng đu đủ được chuyển gen nàyđã trở thành giống thương mại sau khi lai với giống Kapoho [9] Nhưng tínhkháng của cây đu đủ chuyển gen này chỉ có hiệu quả đối với các chủng virus củaHawai mà không kháng với các chủng virus từ các vùng khác [15] Chính vì vậymà cần phải tách dòng gen mã hoá protien vỏ (coat protein gene) từ chính cácvirus gây bệnh của vùng đó thì mới có khả năng tạo ra cây kháng bệnh.

Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi đã xây dựng đề tài: " Tách dòng và thiếtkế vector chuyển gen của gen mã hoá protein vỏ (coat protein) từ virus gây bệnhđốm vòng cây đu đủ (PRSV) ở việt nam" Với mục đích là tạo được một vectorchuyển gen mang gen mã hoá cho protein vỏ của PRSV của Việt Nam phục vụcho việc chuyển gen này vào cây đu đủ tạo ra giống đu đủ mới có khả năng khánglại PRSV ở Việt Nam.

Phần 1Tổng Quan tài liệu

1.1 Đặc điểm cây đu đủ

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại:

Đu đủ (Carica papaya L.) thuộc giống Carica, chi Caricaeae, họ hai lámầm Trong chi còn 3 giống khác là Cyclimorpha, Jacaratia và Jarilla Đu đủ đợcbiết có tới 45 loài trong giống Carica (Willis 1973).

Các loài của Carica papaya L đã đợc tìm thấy dạng dại trong tự nhiên Nócó thể đợc bắt đầu từ vùng đất thấp của Trung Mỹ, giữa Nam Mexico vàNicaragua (Story 1969), có thể từ sự lai giống giữa hai loài Carica Mexico Đu đủđợc phát tán dọc theo đờng biển thơng mại vùng nhiệt đới nhờ những ngời thámhiểm và nhà buôn vào giữa thế kỷ 16 Năm 1601, ngời Bồ Đào Nha đã phổ biếncây đu đủ tới ấn độ và Malaca, ngời Tây Ban Nha đã đa cây đu đủ vào Philippin Ngày nay, đu đủ có thể thấy trong phạm vi từ vĩ tuyến 320 Bắc đến 320 Nam củaxính đạo Nó đợc trồng phổ biến trong đồn điền hoặc mùa vụ tiểu nông.

Đu đủ là loại cây trồng cho quả ăn nhỏ, dạng cây thảo Cây sinh trởng lâunăm nhng thời kỳ cây con ngắn, trung bình khoảng 6 tháng Sau một năm có thểcho thu hoạch quả chín và sau đó là thu hoạch liên tục trong vòng nhiều năm Hầuhết cây trồng mang tính thơng mại chỉ đợc thu hoạch trong vòng 3 hoặc 4 năm trớckhi tàn lụi và cây trở lên quá cao gây khó khăn cho việc thu hoạch Một cây chosản lợng từ 30 đến 40 kg quả chín trong một năm Năng suất từ 30 - 40 tấn/ha/nămvà có thể đạt 100 tấn/ha/năm.

Đu đủ là cây đa tính, nhiều loài là khác gốc (cây đực và cái riêng rẽ), nhiềuloài là cùng gốc (cây lỡng tính) Cây khác gốc phải đợc thụ phấn chéo do sự chia rẽcủa nhị và nhuỵ hoa và hầu nh sự phân tán của phấn hoa là nhờ gió Cây cùng gốccó hoa lỡng tính nên có hiện tợng tự thụ phấn.

1.1.2 Giá trị dinh dỡng và kinh tế của cây đu đủ

Đu đủ đợc sử dụng chủ yếu là quả chín làm món ăn tráng miệng vì quả cóvị ngon, rất giầu vitamin và muối khoáng(Table 1), một phần quả xanh đợc dùnglàm salad, lá xanh dùng để hầm thịt trong một số món ăn truyền thống Ngoài ra,nhựa đu đủ còn đợc sử dụng làm nguyên liệu tách chế phẩm papain (chiếm 1%chất khô của quả xanh) là enzim thơng mại đợc sử dụng trong công nghiệp thựcphẩm và thuộc da Thêm nữa, đu đủ còn đợc coi là một loại dợc liệu quí: rễ, hoa, lá

đợc dùng rộng rãi trong đông y nh hoa đu đủ đực đợc dùng để trị ho, hạt dùng làmthuốc chống giun sán, hạ sốt (Vũ Công Hậu)

Table 1: Thành phần dinh dỡng của quả đu đủ chín (100g)

Tổng sản lợng quả đu đủ tơi trên thế giới năm 1995 ớc tính đạt 5.9 triệu tấnđạt giá trị khoảng 15 đến 20 tỉ USD (Sản lợng quả đu đủ hàng năm của một số nớcsản xuất chính đợc đa ra trong bảng 2)

Bảng 2: Sản lợng quả đu đủ hàng năm của một số nớc

ở nớc ta đu đủ đợc trồng trong vờn nhà ( từ 5 đến 10 cây) của gần 50% hộnông dân Đu đủ cũng đợc trồng tập trung trong các nông trờng hoặc trang trạivùng đồng bằng sông hồng, ven biển miền trung, đồng bằng sông Mekong và sờnnúi đá vôi Tổng diện tích vào khoảng 2500 ha gồm khoảng 1250 ha trồng tậptrung (Bảng 3) và 1250 ha trồng trong vờn nhà

Bảng 3: Vùng phân bố tập trung của cây đu đủ ở Việt Nam

- Hà Nội - Hng Yên - Nam Hà - Ninh Bình

Ven biển miền trung - Nghệ An - Thanh hoá

100Đồng bằng sông Mekong

- Ninh Thuận - Nha Trang - Tây Ninh - Tiền Giang

1.1.4 Các bệnh và sâu hại của cây đu đủ

- Bệnh đốm vòng: Hạn chế lớn nhất đối với sự phát triển cây đu đủ là sựhoành hành của bệnh đốm vòng do virus đốm vòng (papaya ringspot virus) gây ra.Khi virus này nhiễm vào cây đu đủ thì lá cây có những vòng đốm, các gân lá xoănlại và phồng lên làm mất khả năng quang hợp, ở quả có những vòng xanh ô lu Câychậm phát triển dẫn đến giảm nghiêm trọng năng suất và chất lợng quả Bệnh đợctruyền do các loại rệp cây nên lan rộng rất nhanh Hiện nay tất cả các vùng trồngđu đủ ở nớc ta đều đã bị nhiễm bệnh kể cả khi lấy hạt của những cây đu đủ khôngbị bệnh đem gieo thì cũng chỉ khoảng 4- 5 tháng sau khi trồng cha kịp thu hoạchđã thấy xuất hiện triệu trứng bệnh.

- Rệp sáp, rệp mình mềm, bọ nhảy ngoài việc hút nhựa gây tác hại trựctiếp còn là vật truyền bệnh PRSV nhất thiết phải trị bằng những thuốc hiện có nhBi 58ND, Mipcin 20ND, Trebon 10ND, Applaud-BAM 50ND Những cây đu đủtrồng lẻ tẻ, không chăm sóc có rất nhiều loại côn trùng và thực sự là những ổ dịchnếu không phá bỏ thì nghề trồng đu đủ rất khó phát triển.

- Tuyến trùng: tấn công vào rễ, gây những nốt sần Bệnh bị nặng ở nơi đấtcát, nơi đã trồng đu đủ nhiều vụ Phòng trị bằng luân canh, đổ formalin 4% 25ccvào mỗi hố trồng.

- Nhện đỏ: Gây hại chủ yếu vào mùa khô, đẻ trứng ở phía dới lá, cả sâu nonvà sâu trởng thành đều hút nhựa làm cho phiến lá mất diệp lục, chuyển màu vàng.Trị bằng Kelthane hoặc nếu không dùng Trebon phun vào dới lá.

- Bệnh nấm Helminthosporium: gây cháy lá làm cho lá bị biến màu và khôrụng (Phun Kitazin 0,2% có thể hỗn hợp với vôi 1%)

- Bệnh phấn trắng: do nấm Oidium caricae gây ra (phun Benomyl, Zineb vàcácthuốc thuộc nhóm lu huỳnh)

- Bệnh nấm Phytophtora: Vừa hại rễ, vừa hại quả Nấm ở trong đất khóphòng trị, ở Hawaii ngời ta dùng thuốc xông hơi để trị Tạo những điều kiện khôngthuận lợi cho nấm phát triển nh: trồng trên lip đất cao, luân canh, tránh cuốc xớilàm đứt rễ.

1.2 Đặc điểm của PRSV

1.2.1 Cấu trúc

PRSV thuộc loại potyvirus, nhóm gồm có khoảng 160 loại khác nhau.Nhóm potyvirus là lớn nhất và quan trọng nhất về sự ảnh hởng đến kinh tế củavirus gây bệnh ở thực vật Những virus của nhóm này có genome là sợi RNA đơncuốn vòng với kích thớc 780x12nm Nó chứa khoảng 10kb liên kết với protein ởđầu 5' (VPg) và có đuôi polyA đầu 3' (Shukla et.al 1994) Sợi RNA genome này đ-ợc bao bọc bằng vỏ protein (Capsid) Vỏ protein là sự lặp lại của những tiểu phầnnhỏ là protein vỏ (coat protein) RNA genome của PRSV đợc dịch mã trong tế bàochủ tạo ra polyprotein Polyprotein này thuỷ phân tạo ra 12 protein trong đó cóprotein vỏ (viral coat protein)

Trong suốt quá trình nhiễm trong tế bào chủ, virus sử dụng nguyên liệu củatế bào chủ để tạo ra những bản sao genome cũng nh các protein của nó Sau đóRNA và những tiểu phần protein vỏ tự lắp ráp với nhau tạo ra những virus hoànchỉnh riêng biệt có khả năng nhiễm sang các tế bào khác trong cây hoặc sang cáccây khác nhờ côn trùng.

Genome của virus mã hoá khoảng 12 loại protein Một vài loại thì chứcnăng của nó không hoàn toàn đợc xác định, một vài loại thì có nhiều chức năngkhác nhau Một số chức năng đã đợc xác định là vỏ protein, nhân, thân hình trụ,phần bổ trợ liên quan đến sự truyền nhờ côn trùng, helicase và nhiều protease,replicase, protein liên kết genome, ATPase.

1.2.2 Cơ chế lan truyền của PRSV

PRSV đợc truyền dễ dàng đến tế bào chủ thân thuộc nhờ nhiều loài rệp câykhác nhau với phơng thức không liên tục Virus đợc truyền không liên tục nhờ rệp

cây là vì sự tồn tại trong vật truyền trung gian là rất ngắn, ngắn hơn cả thời giantồn tại của virus trong dịch chiết lá cây Trong quá trình truyền không liên tục,virus đợc truyền sang côn trùng sau khi sinh trởng một thời gian ngắn trong cây bịnhiễm và có thể đợc truyền tới một hoặc vài cây ngay lập tức hay sau nhiều giờ Cósự khác nhau trong vật truyền đặc hiệu của từng loại virus riêng biệt trong nhómthậm chí giữa các dạng sinh học của cùng một loại virus Điều này nói lên rằng cơchế của sự tơng tác virus - vector vợt ra ngoài tính chất sinh học chung của virus vàvector truyền của nó [ ]

1.2.3 Các biện pháp phòng trừ

- Sử dụng các chất hoá học tiêu diệt rệp truyền bệnh

- Loại bỏ các cây bị bệnh, tránh trồng gần các cây họ bầu bí là ký chủ củacác côn trùng truyền bệnh.

- Cách ly với các vùng có cây bị bệnh Các vùng cách ly có thể tạm thờikhông bị bệnh nhng do sự bùng phát của PRV thì các vùng trên cũng sẽ bị nhiễm.Điều này thấy rõ ở các vùng trồng đu đủ qui mô lớn ở Hawaii (isherwood,1994)

Các phơng pháp này chỉ áp dụng đợc khi cây cha bị nhiễm bệnhvà mangtính chất phòng trừ chứ không thể chống lại đợc bệnh này

- Cơ chế kháng chéo: sử dụng một chủng PRV yếu cho nhiễm vào cây (vídụ chủng HA5-1) để ngăn chặn sự lây nhiễm của các chủng PRV mạnh hơn Nhợcđiểm của phơng pháp này là các cây bị nhiễm chủng PRV yếu tuy có các dấu hiệubị bệnh nhẹ hơn nhng thiệt hại về sản lợng cũng lên tới 10-20%.(Yeh vàGonsalves, 1994).

1.2.4 Gen kháng virus

Từ nhiều năm, ngời ta đã biết cây cỏ có thể trở nên kháng đối với các chủngvirus gây bệnh nếu trớc đó gây nhiễm chúng với cùng loại hay với virus tơng tự.Hiện tợng này gọi là “bảo vệ chéo” Hình nh protein vỏ của thể virus đóng vai tròquyết định đối với tính kháng chéo, bởi vì khi gen CP của nhiều loại virus RNA đ-ợc thể hiện trong cây (cũng không nhất thiết phải có sự biểu hiện gen mã hoáprotein vỏ ở mức độ cao) thì phản ứng bảo vệ chéo biểu hiện Tính kháng virus còncó thể đạt đợc khi biến nạp thực vật với DNA có những đoạn mã hoá RNA vệ tinh.Cơ chế bảo vệ chéo còn cha đợc giải thích đầy đủ nhng có thể giả thiết rằng giữathể virus gây nhiễm và tế bào chủ có sự hoà trộn sản phẩm biểu hiện của gen nênđã tạo ra tính kháng virus của cây.

Bằng việc sử dụng các tiến bộ trong kỹ thuật di truyền, ngời ta đã chuyểngen CP của virus vào giống đu đủ, tạo cho cây có khả năng kháng bệnh virus Đâylà một thành tựu lớn của công nghệ sinh học trong việc chống lại bệnh PRSV Các

dòng đu đủ chuyển gen này sẽ góp phần có hiệu quả trong việc phòng trừ bệnhPRSV.

1.2.5 Những thành tựu trong việc chống lại PRSV ở cây đu đủ

Trên thế giới đã có nhiều phòng thí nghiệm làm về chuyển gen ở thực vật,nhng đối với sự chuỷên gen CP để tạo cây kháng PRSV thì chỉ có một số phòng thínghiệm nổi bật là:

1.2.5.1 Trờng đại học Hawaii và đại học Cornell, Mỹ

Hai nơi này đã đi tiên phong trong việc chuyển gen CP vào đu đủ để khángbệnh đốm vòng và đã mở ra một phơng pháp mới cho việc tạo các giống cây trồngkháng bệnh virus Nhóm các nhà khoa học gồm có:

Dr Dennis Gonsalves, Khoa bệnh học thực vật, đại học Cornell, tham giatrong việc tách phân lập gen CP từ virus PRSV.

Dr Jerry Slightom thiết kế cấu trúc gene CP dùng cho chuyển genDr Maureen Fitch (USDA) chuyển gen CP vào đu đủ.

Dr Richarh Manshardt, Khoa trồng trọt, đại học Hawaii, tham gia kiểm travà khảo nghiệm các dòng cây chuyển gen.

Nhóm nghiên cứu này đã đa Gen CP của dòng virus PRSV HA 5-1 vàovector pGA482 và chuyển thành công vào giống đu đủ "Sunset" bằng súng bắngen Họ đã tạo ra hai dòng đu đủ mang tên 55-1 và 63-1 có mang gen CP tronggenom và đã kiểm tra bằng lai Southern và ELISA Kết quả thử nghiệm khả năngkháng bệnh của thế hệ R1 từ dòng 55-1 cho thấy nó có tính kháng bệnh rất cao(chỉ có 5% của 128 cây đợc thử nhiễm bệnh) đối với các dòng virus tách từHawaii Nhng không kháng đợc các dòng tách từ nơi khác (vd: Thailand) Vì thịtquả của dòng 55-1 có mầu hồng không phù hợp với thị trờng nên dòng 55-1 này đãđợc lai với giống Kapoho tạo ra dòng "Rainbow" có thịt quả mầu vàng mang đầyđủ các đặc tích của giống gốc Hiện nay dòng "Rainbow" đã đợc đăng ký bảnquyền và trở thành giống đu đủ chuyển gen thơng mại đầu tiên có khả năng khánglại PRSV.

1.2.5.2 Trờng đại học Kasetsart, Thailand và Queensland, Austrailia

Để kiểm soát bệnh PRV thì từ năm 1987 Thailand đã tạo ra các giống cókhả năng chịu bệnh cao theo phơng pháp bảo vệ chéo nhng hiệu quả không cao.Năm 1995, Thailand đã có chơng trình phát triển cây đu đủ chuyển gen khángbệnh PRSV đợc tài trợ của ACIAR kết hợp giữa trờng đại học Kasetsart, Thailandvà Queensland, Austrailia.

Gen CP đã đợc tách từ các chủng virus của Thailand Gen này đợc chuyểnvào hai giống Khak-Dum và Khak-Nual bằng phơng pháp bắn gen với nguyên liệulà phôi non qua giai đoạn mô sẹo Hiện nay họ cũng đã thu đợc cây chuyển gen,đang thử nghiệm tính kháng PRSV.

1.2.5.3 Trung tâm Công nghệ sinh học, MARDI, Malaysia

Nhóm nghiên cứu gồm

Dr Hassan Matd Daud tách phân lập gen CP từ các chủng virus của Malaysia.Dr Tan Chong Seng thiết kế cấu trúc CP gen, đa vào vector p2K7 dùng chochuyển gen bằng súng bắn gen và vector pCAMBIA2300 dùng cho chuyển genbằng Agrobacterium.

Dr Vilasini Pillai: chuyển gen CP vào giống đu đủ Ekotika.

Hiện nay đã thu đợc cây chuyển gen Ro đợc khẳng định bằng lai southern nhngcha đợc thử khả năng kháng bệnh.

1.3 Sinh học phân tử và ứng dụng để tạo cây chuyển gen

1.3.1 Một số vector sử dụng trong sinh học phân tử

1.3.1.1 Vector nhân dòng TA- cloning

Vector này đợc thiết kế riêng cho việc nhân dòng và xác định trình tựnucleotit của một đoạn gen nào đó Do tính chất của sản phẩm phản ứng PCR khisử dụng enzim Taq DNA polymerase để nhân lên một đoạn gen nào đó thì bao giờtrên mỗi mạch đơn hai đầu của sản phẩm cũng gắn d thêm một dATP vào nênvector TA-cloning đợc thiết kế dạng mở và trên mỗi mạch đơn ở hai đầu có gắnthêm một dTTP Vì vậy, đoạn DNA sản phẩm của phản ứng PCR có thể gắn trựctiếp vào vector nhờ T4 ligase Xung quanh điểm chèn đoạn DNA này có vị trí nhậnbiết của một số enzim giới hạn để dễ dàng cho việc thiết kế cấu trúc gene sau này.Phía trái của điểm chèn đoạn DNA là lac promoter cho việc biểu hiện của genlacZ, trùm qua điểm chèn là đoạn gen lacZ mã hoá 146 a xít amin của -galactosidase giúp cho việc chon lọc khuẩn lạc xanh/trắmg Vector này mang vùnggen tự sao mã ColE1 origin biểu hiện số lợng cao bản sao trong E.coli và gen chọnlọc là hai gen kháng kanamycin và Ampicillin Đặc biệt, có trình tự bắt cặp bổsung của hai đoạn mồi M13 forward và M13 reverse nằm ở hai bên của điểm chènphục vụ cho việc xác đinh trình tự đoạn DNA đợc chèn vào (hình )

Hình : Bản đồ vector TA-cloning pCR2.1

1.3.1.2 Vector biểu hiện protein pRSET

Vector pRSET có nguồn gốc là các vector biểu hiện pUC, đợc thiết kế chosự biểu hiện protein và tinh chế protein ở mức độ cao trong E coli Sự biểu hiện ởmức độ cao của các trình tự DNA đợc đa vào vector pRSET đợc tạo ra do sự điềukhiển của T7 promoter Đoạn DNA đợc đa vào vị trí trong khung dịch mã với trìnhtự mã hoá đoạn peptid tín hiệu tận cùng đầu N, một bộ mã khởi đầu dịch mã ATG,một đoạn trình tự mã hoá 6 a xít amin histidine có chức năng là vùng liên kết vớikim loại trong protein đợc dịch mã Vùng liên kết kim loại của đoạn peptide tínhiệu cho phép tinh chế protein tái tổ hợp một cách đơn giản bằng sắc ký ái lực.Một đoạn trình tự có tính năng làm ổn định cho sự sao mã có nguồn gốc từ gen 10của phagơ T7 Một đoạn trình tự qui định vị trí cắt của enzim enterokinase trênchuỗi peptide nằm giữa vùng liên kết với kim loại và protein tái tổ hợp, có tác dụngloại bỏ đoạn peptide tín hiệu đầu N từ protein tái tổ hợp đã tinh sạch

Trong pRSET, vị trí MCS (multiple cloning site) có vị trí cắt của 10 enzimgiới hạn: BamH I; Xho I; Bgl II; Pst I; Pvu II; Kpn I; Nco I; EcoR I; BstB I và HindIII Theo đó, để tạo ra đúng protein tái tổ hợp chá đoạn pepetide tín hiệu cần phảichèn đoạn DNA vào một trong những vị trí trong MSC sao cho đúng khung dịchmã với mã khởi đầu ATG của vector Vector pRSET có 3 loại pRSET A, B và C(hình 2) chỉ khác nhau đoạn trình tự giữa vùng mã cho đoạn peptide tín hiệu và

MCS Để biểu hiện đúng protein đã đợc mã hoá bởi trình tự DNA, yếu tố quyếtđịnh đầu tiên là vị trí cắt giới hạn phải thích hợp cho sự lai ghép đoạn DNA và sauđó là vector nào sẽ duy trì đợc khung dịch mã của vector và đoạn DNA đợc chènvào

Vector tái tổ hợp pRSET đợc chuyển vào E coli TOP 10F’ để nhân dòng vàduy trì Muốn biểu hiện protein tái tổ hợp thì cấu trúc vector này phải đợc chuyểnvào E coli BL21 (DE3) là chủng E coli biểu hiện T7 polymerase dới sự điềukhiển của lacUV5 promoter và một plasmid biểu hiện T7 lysozyme Sự biểu hiệncủa T7 polymerase cần thiết cho sự tổng hợp protein tái tổ hợp, khi có mặt IPTG tếbào đợc cảm ứng để biểu hiện T7 RNA polymerase ở mức độ cao và làm tăng sựtổng hợp protein tái tổ hợp

1.3.1.3 Vector chuyển gen ở thực vật

1.3.1.3.1 Ti - Plasmid

Năm 1974, Zaenen và cộng sự đã phát hiện ra A tumefacien mang một cấutrúc di truyền ngoài nhiễm sắc thể là một plasmit khổng lồ (Ti-plasmid) chứa genliên quan đến sự tạo thành khối u ở vết thơng cây bị chúng xâm nhập[32] Ti-plasmit là một đoạn phân tử ADN mạch vòng, sợi kép có trọng lợng phân tử bằng3-5% so với trọng lợng phân tử của nhiễm sắc thể vi khuẩn Với kích thớc khoảng200kb, trong tế bào chúng tồn tại nh một đơn vị sao chép độc lập

Mặc dù đợc tách ở các chủng Agrobacterium khác nhau, song tất cả plasmit qua phân tích di truyền cho thấy, chúng đều chứa đựng ba vùng quantrọng Vùng T-ADN và vùng vir (virulence) có liên quan trực tiếp đến sự hìnhthành khối u Vùng còn lại là vùng dị hoá opine (opine catabolism region) [28].

Ti Cấu trúc và chức năng của vùng TTi ADN: Nghiên cứu trình tự gen trênvùng T-ADN ở các Ti-plasmit khác nhau ngời ta thấy rằng T-ADN đợc giới hạnbởi các đoạn trình tự lặp lại gần nh hoàn toàn khoảng 25 bp đợc gọi là đoạn đầubiên (T-ADN border sequence) Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyểnT-ADN vào tế bào thực vật ở đoạn đầu biên bên phải có chứa yếu tố cis, cần thiếtcho quá trình chuyển T-ADN vào tế bào cây chủ Đoạn đầu biên bên trái giữ vaitrò để quá trình chuyển T-ADN kết thúc bình thờng T-ADN mang rất nhiều genvà biểu hiện trong quá trình chuyển hoá của tế bào thực vật Các phân tích trình tựgen trên T-ADN cho thấy T-ADN cũng mang các dấu hiệu khởi đầu phiên mã (hộpTATA) và kết thúc phiên mã (hộp AATAAA) Gen tồn tại trên T-ADN đợc chialàm hai hệ chính [11]:

+ Hệ thứ nhất là gen gây ung th onc, gen này mã hoá sinh tổng hợp auxinvà cytokinin, kết quả làm cho các tế bào phân chia liên tục và biến đổi hình dạngtạo ra các nốt sần trên cây.

+ Hệ gen thứ hai mã hoá cho các enzim cần thiết trong quá trình tổng hợpopine Vi khuẩn sử dụng opine làm nguồn năng lợng cung cấp cacbon và nitơ.Dạng opine đợc tổng hợp trong khối u có thể là nopaline, octopine, agropine,manopine và agrocinopine phụ thuộc vào các chủ Agrobacterium sinh ra khối uban đầu [11] Đây cũng là cơ sở để phân loại các chủng Agrobacterium.

+ Vùng các gen độc tố của Ti-plasmit: Vùng các gen độc tố (vir) phụ tráchquá trình gây cảm ứng tạo đoạn T-ADN và vận chuyển T-ADN tới nhân tế bào vật

chủ Có tới 24 gen vir nằm trong vùng này của Ti-plasmit dạng octopine Các gennày đợc bố trí trong 8 operon ký hiệu virA đến virH, tạo thành cấu trúc regulon [11].

- Sự biểu hiện của các gen vir đợc điều khiển bởi hệ thồng gồm hai thànhphần là protein VirA và protein VirG Protein VirA là định vị trên màng tế bào, nócó khả năng tự phosphoryl hoá ở gốc histidine 474 và gốc photphat này đợc chuyểntới protein VirG Sau đó protein VirG hoạt hoá sự phiên mã của các gen vir khác[14].

Tuy nhiên các hoạt động cần thiết cho quá trình tạo T-ADN và hình thànhphức hợp T (T- complex) là do các gen virC, virD và virE điều khiển Operon củavirD mã hoá sinh tổng hợp 4 protein VirD1, VirD2, VirD3 và VirD4 VirD2 là mộtendonuclease có chức năng nhận biết và làm đứt gẫy T-ADN tại vùng đầu biêncùng với sự có mặt của VirD1 Đoạn ADN "định vị nhân" trong gen virD2 giúpcho sự định hớng của phức hợp T tới nhân tế bào thực vật Hai protein VirC1 vàVirC2 đợc mã hoá bởi locus virC, protein VirC1 giữ vai trò thúc đẩy sự tạo thànhT-ADN nhờ sự liên kết với trình tự đoạn gia tốc (overdrive) [26], operon virE mãhoá sinh tổng hợp protein VirE1 và VirE2 VirE2 liên kết với T-ADN ở một đoạnkhông đặc hiệu, có chức năng giữ cho T-ADN không bị đứt gẫy [5] Hơn thế nữaVirE2 giữ cho T-ADN có cấu trúc thẳng không bị gấp quấn và đoạn "định vịnhân" VirE2 đã giúp cho sự vận chuyển của phức hợp T tới nhân tế bào thực vật.Có thể nói locus lớn nhất trong vùng vir là virB , mã hoá cho 11 protein từ VirB1-VirB11 Một số trong những protein này nằm trên màng và dờng nh chúng tạo racác lỗ màng cần thiết cho quá trình vận chuyển phức hợp T vào trong tế bào thựcvật [24].

1.3.1.3.2 Hệ vector nhị thể

Kích thớc lớn của Ti-plasmit gây không ít khó khăn trong chuyển nạp genthông qua Agrobacterium Mặt khác các enzim giới hạn có thể cắt ADN của Ti-plasmit ở nhiều chỗ khác nhau, trong khi đó công nghệ gen lại cần những có vị trícắt duy nhất cho hoạt động của một số enzim giới hạn [3] Ngoài ra mặc dù cácgen onc đợc dùng làm chỉ thị chọn lọc có tính trội, nhng chúng lại cản trở quá trìnhtái sinh bình thờng ở thực vật [31].

Với các lí do trên đây, các nhà khoa học đã cải tiến Ti-plasmit thành mộthệ vector nhị thể gồm có vector chuyển gen (Ti-plasmid tái tổ hợp) và vector bổ trợ(helper Ti-plasmid)

- Vector chuyển gen: Có cấu trúc từ Ti-plasmid với đoạn T-DNA đợc cắt bỏhết các gen không cần thiết nh gen onc và gen tổng hợp opine ở giữa hai trình tựbiên trái (T-border left) và biên phải (T-border right), gắn thêm một số thành phần

tạo ra cấu trúc mới gồm: i) các replicon để ADN plasmit có thể vừa tự nhân trongcả E coli và Agrobacterium; ii) các gen chọn lọc, gen đánh dấu và iii) vùng cónhiều điểm cắt của các enzim giới hạn nằm ở giữa hai trình tự biên trái (T-borderleft) và biên phải để chèn gen mong muốn

- Vector bổ trợ: cấu trúc gồm tất cả các gen vir đợc tách và đa vào chungmột plasmid với đầy đủ promotor để gen hoạt động, các replicon để ADN plasmitcó thể vừa tự nhân trong Agrobacterium và các gen chọn lọc, gen đánh dấu

Hai cấu trúc này cùng đợc đa vào Agrobacterium, Khi các gen trên vector bổ trợhoạt động thì các sản phẩm của nó sẽ tác động tới đoạn T-DNA trên vector chuyểngen dẫn đến sự chuyển đoạn T-DNA sang tế bào thực vật.

1.3.1.3.3 Vector chuyển gen pCAMBIA2300

Vector pCAMBIA2300 đợc Leon Smith thuộc trung tâm CAMBIA thiết kếnăm 1997 để làm vector chuyển gen vào thực vật Vector có kích thớc 8742bp vớicác thành phần theo sơ đồ:

1.3.2 Một số loại enzim thông dụng trong sinh học phân tử

1.3.2.1 Enzim phiên mã ngợc (reverse transcriptase)

Cùng với các enzim giới hạn, enzim phiên mã ngợc có vai trò quyết địnhtrong quá trình hình thành ngành sinh học phân tử, enzim này do các retrovirussản sinh nhằm sao chép bộ gen RNA của chúng trong tế bào chủ Hiện nay trên thịtrờng có hai loại enzim phiên mã ngợc có nguồn gốc từ AMV (AvianMyeloblastosis Virus) và thông dụng hơn là từ Mo-MLV (Moloney MurineLeukemia Virus) vì enzim này hoạt động ở 420C nên đã làm giảm sự tạo vòng củasợi mRNA Cả hai loại enzim này đều có hoạt tính 5' - 3' DNA polymerase sửdụng sợi mRNA làm khuôn mẫu với đoạn mồi là đoạn RNA hoặc DNA có đầu 3'-OH tự do để sao chép ngợc tạo ra sợi cDNA.

1.3.2.2 Enzim DNA ligase

Enzim DNA ligase đợc sử dụng để kết nối hai đoạn DNA Nó xúc tác chophản ứng tạo khung liên kết photphodiester bởi gắn đầu 5'-photphat và đầu 3'-OHcủa hai đoạn DNA theo sơ đồ:

5' pApCpG-OH pApApTpTpCpGpT 3' 3' TpGpCpTpTpApAp HO-GpCpAp 5'

Mg++ Bacteriophage T4 DNA ligaseATP

5' pApCpGpApApTpTpCpGpT 3'3' TpGpCpTpTpApApGpCpAp 5'

Enzim thờng dùng trong SHPT là T4 DNA ligase tách từ thực khuẩn thể T4,có cấu trúc là một chuỗi polypepetit với trọng lợng phân tử là 68kDa, hoạt động tốiu ở pH7,5 đến 8,0 và cần có phụ tố là ion Mg++ và ATP

1.3.2.3 Enzim DNA polymerase

DNA polymerase xúc tác cho phản ứng tổng hợp chuỗi polynucleotit từ cácmononucleotit Quá trình tổng hợp luôn đợc kéo dài từ đầu tận cùng 3'-OH củađoạn mồi Enzim này chủ yếu đợc ứng dụng cho phản ứng PCR Trớc đây, khi mớiphát minh ra PCR vào năm 1985 thì enzim đợc sử dụng là T4 polymerase (enzimKlenow) Nhng điều hạn chế là enzim này chỉ hoạt động ở nhiệt độ thấp (370C), nênsau này đã đợc thay thế bằng các DNA polymerase chịu nhiệt DNA polymerase chịu nhiệt đầu tiên đ-ợc tách từ chủng vi khuẩn Thermus aquaticus Yt1 phân lập từ suối nớc nóng ở vùng Yellow store Trong sốcác enzim chịu nhiệt thì Taq DNA polymerase đợc dùng phổ biến hơn vì nó đã đợc sản xuất từ E.colibằng kỹ thuật ADN tái tổ hợp Ngoài ra còn một số các enzim khác cũng thờng đợc sử dụng nh:

NguồnE.coli đợc biếnnạp gen TaqDNA polumerasetái tổ hợp

Mr 94kDa - 92kDa 92kDa 76kDaTộc Ẽờ tỗng hùp

(nucleotit/s) 75 >80 >25 >60 >120ườ bền vợi

nhiệt Ẽờ97,50C

-> 2h

>3h --

1.3.2.4 Enzim c¾t giợi hỈn (restriction enzim)

enzim giợi hỈn lẾ cẬng cừ cÈ bản phừc vừ cho sinh hồc phẪn tữ, Ẽùc sữ dừngẼể xÌc ẼÞnh Ẽặc Ẽiểm cũa trỨnh tỳ nucleotide cũa ẼoỈn DNA, tỈo ra cÌc ẼoỈn c¾tDNA phừc vừ cho lai ghÐp DNA Enzim giợi hỈn lẾ mờt loỈi enzim cũa vi khuẩncọ tÌc dừng giụp chụng chộng lỈi nhứng DNA ngoỈi lai xẪm nhập Enyme Ẽùc tinhchế lần Ẽầu tiàn vẾo nẨm 1970 tử Haemophilus influenzae Rd enzim giợi hỈn Ẽùcchia lẾm 3 loỈi dỳa tràn sỳ c¾t DNA Ẽặc hiệu hay khẬng Ẽặc hiệu vẾ cÌc yếu tộ phừcần cho hoỈt tÝnh cũa enzim.

+ Enyme giợi hỈn loỈi I: lẾ nhứng enzim c¾t DNA ỡ nhứng vÞ trÝ khẬng Ẽặchiệu cÌch xa vÞ trÝ liàn kết hoặc vÞ trÝ ghi nhận trỨnh tỳ cÌc nucleotide tràn mỈchDNA khoảng 7000bp vẾ Ẽể cho enzim hoỈt Ẽờng cần 3 phừ tộ lẾ Mg2+, ATP vẾadenozylmethionyl.

+ Enzim giợi hỈn loỈi III: enyme nẾy cúng c¾t ỡ nhứng vÞ trÝ khẬng Ẽặc hiệunhng vÞ trÝ c¾t cÌch vÞ trÝ nhận biết chì khoảng 25 Ẽến 27bp vẾ cần hai phừ tộ lẾATP vẾ Mg2+

Hai loỈi enzim nẾy do vÞ trÝ c¾t khẬng Ẽặc hiệu nàn khẬng Ẽùc sữ dừngtrong ký thuật gen.

+ enzim giợi hỈn loỈi II: loỈi nẾy chì cần Mg2+ cho hoỈt tÝnh phẪn c¾t DNAvẾ vÞ trÝ c¾t cũa nọ rất Ẽặc hiệu ưiểm c¾t ngay tỈi nÈi enzim g¾n vẾo hoặc kề cận.Phần lợn vÞ trÝ nhận biết cũa enzim nẾy lẾ mờt trỨnh tỳ gổm 4 Ẽến 6 bp (ẼẬi khi lẾ 7Ẽến 8bp) Khi chụng c¾t chuối DNA kÐp thỨ sé tỈo thẾnh cÌc ẼoỈn c¾t giợi hỈn cọẼầu tận củng bÍng hoặc tủ vợi trỨnh tỳ cÌc nucleotide Ẽặc trng vẾ xÌc ẼÞnh.

1.3.2.5 Enzim Mung-bean nuclease

Mung-bean nuclease Ẽùc tinh chế tử mầm cẪy Ẽậu xanh (mung bean) cọhoỈt tÝnh nuclease Enzim nẾy chì c¾t sùi RNA hoặc sùi ẼÈn DNA mẾ khẬng c¾tDNA sùi ẼẬi thậm chÝ cúng khẬng c¾t ỡ trong nhứng Ẽiểm mỡ tràn sùi DNA Nọ Ẽ-ùc dủng Ẽể loỈi bõ Ẽầu dÝch sau khi sữ lý vợi enzim giợi hỈn khÌc, tỈo ra cÌc ẼầubÍng giụp cho việc g¾n nội cÌc ẼoỈn DNA Ẽùc dễ dẾng hÈn.

5' pApCpG-OH pApApTpTpCpGpT 3'

3' TpGpCpTpTpApAp HO-GpCpAp 5'Mung Bean nuclease Zn++

<100mM NaCl 5' pApCpGp + CpGpT 3'

3' TpGpCp GpCpAp 5'

1.3.3 Một số kỹ thuật sinh học phân tử

1.3.3.1 Kỹ thuật điện di phân tích ADN

Phân tử RNA và DNA với các đoạn cắt có khối lợng khác nhau đợctách ra khi di chuyển trong điện trờng từ cực âm sang cực dơng của máyđiện di với nồng độ agarose, điện thế và cờng độ thích hợp thích hợp thì cógiải phân tách các đoạn DNA kích thớc khác nhau.

Nồng độ gel agarose Độ phân giải (Kb)0,3

60 - 520 - 110 - 0,8

7 - 0,56 - 0,44 - 0,23 - 0,1

- Kỹ thuật điện di cho phép phát hiện vệt DNA 10ng khi nhuộm vớiethidium bromide Ethidium là một chất tơng đồng với các bazơ nên nó xen kẽvào sợi DNA, dới ánh sáng UV thì phát quang và độ phát quang tỉ lệ thuận với l-ợng DNA Chiều dài bớc sóng tối u là 254nm nhng để trách làm đứt gãy sợi DNAtrong thực tế dung bớc sóng 300nm Sự chuyển động của DNA phụ thuộc vào haiyếu tố:

- Độ lớn của đoạn DNA: những đoạn DNA kích thớc bé chuyển động nhanhhơn và sự chuyển động có mối quan hệ logarit với độ dài đoạn DNA.

- Kiểu hình của DNA: Điều này thờng thấy đối với plasmid dạng siêu xoắn,sợi vòng, sợi thẳng Vì vậy để tách và phân biệt kích thớc plasmid thờng phải dùngmột số enzim giới hạn để cắt plasmid tạo ra dạng mạch thẳng.

1.3.3.2 Kỹ thuật điện di phân tích protein

Phơng pháp này dùng để xác định sự có mặt và trọng lợng phân tử của

protein Nguyên tắc của kỹ thuật là dựa vào tính chất liên kết giữa acrylamide và

bisacrylamide theo tỉ lệ 29:1 tạo ra dạng chuỗi polyacrylamide có tác dụng nh mộtrây phân tử Các protein sau khi kết hợp với chất tích điện âm SDS sẽ di chuyểnđợc trong điện trờng từ cực âm sang cực dơng Khi cho protein di chuyển qua bảngel acylamide trong điện trờng thì theo thời gian các protein có trọng lợng phân tửkhác nhau sẽ phân bố trên các vị trí khác nhau của bản gel Protein nào có trọng l-

ợng phân tử nhỏ hơn sẽ di chuyển về cực dơng nhanh hơn Tuỳ vào nồng độ củaacrylamide mà có thể phân tách đợc các protein với giải trọng khác nhau theobảng:

Nồng độ gel acrylamide (%) Giải trọng lợng phân tách (kD)15

12  4316  6836  9457  212

Sau khi dừng điện di, vạch protein trên gel đợc phát hiện bằng nhuộm gelvới chất màu là Coomassie Brillian Blue R250 hoặc muối nitrate Bạc So sánh vị trícủa các protein này với thang protein chuẩn ta sẽ xác định đợc trọng lợng phân tửcủa chúng Phơng pháp này có thể phát hiện vạch protein với hàm lợng 10ng.

Ngoài ra, phơng pháp còn có thể xác định số chuỗi polypeptit của phân tửprotein bằng cách bổ sung vào đệm mẫu protein -Mecaptoetanol Chất này sẽ cắtcác cầu liên kết disulfua giữa các chuỗi polypeptit tạo các tiểu phần nhỏ So sánhbăng điện di khi không có -Mecaptoetanol ta sẽ biết đợc phân tử protein cấu trúctừ bao nhiêu tiểu phần cùng với kích thớc phân tử của các tiểu phần.

1.3.3.3 Kỹ thuật RT-PCR

Kỹ thuật RT-PCR là sự kết hợp của hai phản ứng sao mã ngợc (reversetranscription) và PCR để nhân lên một đoạn gen quan tâm từ RNA tổng số trongđó có chứa RNA thông tin gồm hai giai đoạn

- Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất (sơ đồ):

dNTP Reverse transcriptase

Cấu trúc mũ đầu 5'

AAA(A)n đuôi poly(A) đầu 3'mRNA

Cấu trúc mũ đầu 5'

n đuôi poly(A) đầu 3'Oligo(dT)

12-18 primer3'-OH 5'

AAA(A)n đuôi poly(A) đầu 3'Oligo(dT)

12-18 primer3'-OH 5'

5' 3'

cDNA : mRNA

Do tính chất mRNA của tế bào eukaryot bao giờ cũng đợc gắn thêm mộtđoạn đuôi poly(A) nên trong điều kiện invitro với sợi khuôn là mRNA có trongRNA tổng số, nếu ta sử dụng một đoạn mồi oligo(dT) khoảng 12 đến 18 base thìđoạn mồi này sẽ bắt cặp bổ sung với đuôi poly(A) của mRNA Khi có mặt enzimreverse transcriptase và các dNTP tự do, ở nhiệt độ 420C trong 2h đoạn mồi này sẽđợc kéo dài tạo thành các sợi DNA mới bổ sung với mRNA Nh vậy sợi cDNA thứnhất đã đợc tổng hợp Để tăng hiệu quả của quá trình tổng hợp, lợng oligo(dT) đợccho vào lớn hơn rất nhiều lợng mRNA và chất kìm hãm RNase cũng đợc đa vào đểbảo vệ cho RNA khỏi bị phân huỷ bởi RNase

- Khuếch đại gen quan tâm bằng PCR: Sau khi sợi cDNA thứ nhất đợc tổnghợp thì kỹ thuật PCR đợc áp dụng để nhân gen quan tâm với các cặp mồi đặc hiệucho gen đó Trớc tiên sợi cDNA tách khỏi mRNA bởi nhiệt, sau đó đoạn mồi 1 sẽkết cặp bổ sung với sợi cDNA thứ nhất để tổng hợp sợi DNA thứ hai Tiếp theo cácsợi DNA kép này sẽ đợc nhân lên sau mỗi vòng lặp của phản ứng.

1.3.3.4 Kỹ thuật Western blotting

Kỹ thuật western blotting là kỹ thuật lai protein-protein Protein mẫu saukhi đợc phân tách bằng điện di gel acrylamide sẽ đợc chuyển sang cố định trênmột chất giá cũng bằng điện di Chất giá thờng sử dụng là các loại màng khác nhaunh màng nitrocellulose, diazophenylthio (DPT), diazobenzyloxymethyl (DBM),nylon Protein đã cố định trên màng sẽ đợc phát hiện bằng phản ứng miễn dịchkép gồm hai giai đoạn

+ Protein mẫu cố định trên màng đóng vai trò một kháng nguyên sẽ kết hợpvới protein khác có tính chất là một kháng thể kháng lại protein này (kháng thể thứnhất) Kháng thể đợc tạo ra nhờ gây phản ứng miễn dịch khi tiêm protein mẫu vàothỏ hoặc chuột và sau đó tách lấy kháng thể từ huyết thanh của chúng.

+ Kháng thể thứ nhất lại tiếp tục đợc lai với kháng thể thứ hai (kháng thểkháng globulin miễn dịch anti-immunoglobulin) đã đợc gắn với một protein cóhoạt tính enzim thờng là peroxidase củ cải ngựa hoặc alkaline phosphatase Chínhcác enzim này sẽ phân huỷ cơ chất BCIP/NBT từ không màu thành màu xanh giúpchúng ta quan sát đợc sự có mặt và vị trí của protein mẫu trên bản gel.

1.4 ứng dụng công nghệ tin học trong sinh học phân tử

1.4.1 Phần mềm tin học DNAstar sử dụng cho sinh học phân tử

Cùng với sự phát triển của SHPT, Công nghệ thông tin đã phát triển mạnhmẽ và đợc ứng dụng vào nhiều lĩnh vực trong đó có sinh học phân tử Có nhiều hệthống phần mềm khác nhau nh ‘NTSYSpc’ dùng để vẽ cây phân loại các loài nhờxử lý các số liệu của kỹ thuật RADP, ‘Vector NTI’ dùng để vẽ sơ đồ các plasmide,

‘CP/gene’ dùng phân tích trình tự nucleotide và protein Nhng tiện dụng nhất là hệthống phần mềm ‘DNAstar’ của một nhóm các nhà khoa học Mỹ Phần mềm nàybao gồm nhiều chơng trình với các chức năng khác nhau dùng để phân tích và xửlý các số liệu trong sinh học phân tử Đó là:

- Editseq (Peter Rahaim, công ty Omni Gene) là chơng trình phân tích, xửlý trình tự nucleotid và axit amin Nó có thể nhận biết và xử lý rất nhiều dạng sốliệu (file) của các chơng trình khác nhau nh Text, GeneBank, FASTA, Macvector,GeneMan Editseq đa ra các số liệu về DNA và protein Nó còn có nhiều chứcnăng khác nh: bổ sung, đảo ngợc sợi DNA khuôn; dịch mã từ trình tự nucleotidesang trình tự axit amin và ngợc lại.

- MapDraw (Mark Corchan, Syntro Research): dùng để lập bản đồ enzimcắt giới hạn Chỉ cần chọn trình tự DNA đa vào (sợi đơn hoặc kép, ở dạng thẳnghoặc vòng), chong trình này sẽ xử lý và cho kết quả về vị trí cắt cùng các thông sốcủa các enzim giới hạn; 6 trình tự axit amin của protein đựoc mã hoá từ các khungđọc khác nhau Điều này giúp dễ dàng chọn đợc các enzim giới hạn thích hợp chosự nhân dòng gen, kiểm tra trình tự các đoạn gen đợc nhân và biết đợc trình tự axitamin đúng của protein đợc mã hoá.

- Protean (Harry Mangalam, Đại học California-Irvine): là phần mềm đểphân tích cấu trúc của protein Nó có thể dự đoán về cấu trúc bậc 2, sự thay đổi vềcấu trúc và các tính chất hoá lý của protein; giúp xác định vùng kháng nguyên; dựđoán kiểu phân cắt của protein; xác định những đột biến ảnh hởng lên tính chất củachuỗi peptid

- Megalign (William Gilbert, Viện Whitehead): sử dụng 6 phơng pháp khácnhau (nh Jotun Hein, Clustal ) để so sánh sự giống và khác nhau của các trình tựnucleotid và các acid amin Các trình tự nucleotid hoặc acid amin đợc đa vào phântích và máy tính sẽ đa ra kết quả về mức độ tơng đồng của các trình tự này dớidạng cây phân loại hoặc bảng số

- Genequest (Keith Joho, Công ty Sugen): dùng để xác định vị trí khởi đầuvà kết thúc dịch mã; dự đoán vùng mã hoá protein, vùng intron và exon Chơngtrình này còn xác định các trình tự lặp lại trực tiếp hoặc lặp lại đảo ngợc; tìm kiếmvị trí của các nhân tố sao mã; dự đoán cấu trúc vòng của RNA và DNA

- PrimerSelect ( Trevor Jowett, Đại học Newcastle Upon Tyne): dùng choviệc thiết kế và phân tích các đoạn oligonucleotid bao gồm những đoạn mồi sửdụng cho PCR, những trình tự đoạn dò (probe) cho lai ghép nhờ sử dụng sợi khuônlà DNA, RNA hoặc trình tự protein đã đợc dịch mã ngợc Chơng trình này đa rachi tiết tính chất nhiệt động của đoạn mồi cho phản ứng kết cặp; đa ra danh sách