MỤC LỤC
Do tính chất của sản phẩm phản ứng PCR khi sử dụng enzim Taq DNA polymerase để nhân lên một đoạn gen nào đó thì bao giờ trên mỗi mạch đơn hai đầu của sản phẩm cũng gắn d thêm một dATP vào nên vector TA-cloning đợc thiết kế dạng mở và trên mỗi mạch đơn ở hai đầu có gắn thêm một dTTP. Đoạn DNA đợc đa vào vị trí trong khung dịch mã với trình tự mã hoá đoạn peptid tín hiệu tận cùng đầu N, một bộ mã khởi đầu dịch mã ATG, một đoạn trình tự mã hoá 6 a xít amin histidine có chức năng là vùng liên kết với kim loại trong protein đợc dịch mã. Một đoạn trình tự qui định vị trí cắt của enzim enterokinase trên chuỗi peptide nằm giữa vùng liên kết với kim loại và protein tái tổ hợp, có tác dụng loại bỏ đoạn peptide tín hiệu đầu N từ protein tái tổ hợp đã tinh sạch.
Theo đó, để tạo ra đúng protein tái tổ hợp chá đoạn pepetide tín hiệu cần phải chèn đoạn DNA vào một trong những vị trí trong MSC sao cho đúng khung dịch mã với mã khởi đầu ATG của vector. Sự biểu hiện của T7 polymerase cần thiết cho sự tổng hợp protein tái tổ hợp, khi có mặt IPTG tế bào đợc cảm ứng để biểu hiện T7 RNA polymerase ở mức độ cao và làm tăng sự tổng hợp protein tái tổ hợp. - Cấu trúc và chức năng của vùng T-ADN: Nghiên cứu trình tự gen trên vùng T-ADN ở các Ti-plasmit khác nhau ngời ta thấy rằng T-ADN đợc giới hạn bởi các đoạn trình tự lặp lại gần nh hoàn toàn khoảng 25 bp đợc gọi là đoạn đầu biên (T-ADN border sequence).
Hai protein VirC1 và VirC2 đợc mã hoá bởi locus virC, protein VirC1 giữ vai trò thúc đẩy sự tạo thành T-ADN nhờ sự liên kết với trình tự đoạn gia tốc (overdrive) [26], operon virE mã. Mặt khác các enzim giới hạn có thể cắt ADN của Ti- plasmit ở nhiều chỗ khác nhau, trong khi đó công nghệ gen lại cần những có vị trí cắt duy nhất cho hoạt động của một số enzim giới hạn [3]. - Vector chuyển gen: Có cấu trúc từ Ti-plasmid với đoạn T-DNA đợc cắt bỏ hết các gen không cần thiết nh gen onc và gen tổng hợp opine ở giữa hai trình tự biên trái (T-border left) và biên phải (T-border right), gắn thêm một số thành phần tạo ra cấu trúc mới gồm: i) các replicon để ADN plasmit có thể vừa tự nhân trong cả E. coli và Agrobacterium; ii) các gen chọn lọc, gen đánh dấu và iii) vùng có nhiều điểm cắt của các enzim giới hạn nằm ở giữa hai trình tự biên trái (T-border left) và biên phải để chèn gen mong muốn.
- Vector bổ trợ: cấu trúc gồm tất cả các gen vir đợc tách và đa vào chung một plasmid với đầy đủ promotor để gen hoạt động, các replicon để ADN plasmit có thể vừa tự nhân trong Agrobacterium và các gen chọn lọc, gen đánh dấu. Hai cấu trúc này cùng đợc đa vào Agrobacterium, Khi các gen trên vector bổ trợ hoạt động thì các sản phẩm của nó sẽ tác động tới đoạn T-DNA trên vector chuyển gen dẫn đến sự chuyển đoạn T-DNA sang tế bào thực vật. Cùng với các enzim giới hạn, enzim phiên mã ngợc có vai trò quyết định trong quá trình hình thành ngành sinh học phân tử, enzim này do các retrovirus sản sinh nhằm sao chép bộ gen RNA của chúng trong tế bào chủ.
Cả hai loại enzim này đều có hoạt tính 5' - 3' DNA polymerase sử dụng sợi mRNA làm khuôn mẫu với đoạn mồi là đoạn RNA hoặc DNA có đầu 3'- OH tự do để sao chép ngợc tạo ra sợi cDNA. Enzim thờng dùng trong SHPT là T4 DNA ligase tách từ thực khuẩn thể T4, có cấu trúc là một chuỗi polypepetit với trọng lợng phân tử là 68kDa, hoạt động tối u ở pH7,5 đến 8,0 và cần có phụ tố là ion Mg++ và ATP. + Enyme giới hạn loại I: là những enzim cắt DNA ở những vị trí không đặc hiệu cách xa vị trí liên kết hoặc vị trí ghi nhận trình tự các nucleotide trên mạch DNA khoảng 7000bp và để cho enzim hoạt động cần 3 phụ tố là Mg2+, ATP và adenozylmethionyl.
Chất giá thờng sử dụng là các loại màng khác nhau nh màng nitrocellulose, diazophenylthio (DPT), diazobenzyloxymethyl (DBM), nylon..Protein đã cố định trên màng sẽ đợc phát hiện bằng phản ứng miễn dịch kép gồm hai giai đoạn. + Kháng thể thứ nhất lại tiếp tục đợc lai với kháng thể thứ hai (kháng thể kháng globulin miễn dịch anti-immunoglobulin) đã đợc gắn với một protein có hoạt tính enzim thờng là peroxidase củ cải ngựa hoặc alkaline phosphatase.
Đoạn trình tự acid amin giống nhau nhất về phía hai đầu của các protein đã đợc chọn và chuyển thành trình tự các nucleotid để sử dụng làm primer. - AND sau khi đợc phân tách bằng phơng pháp điện di trên gel agarose, bản gel đợc nhuộm với EtBr trong 15’ và đợc soi dới đèn UV xác định đoạn DNA cần tách. - pCR2.1-TA vector có chứa đoạn gen CP sau khi đã tinh sạch đợc đọc trình tự gen trên máy đọc tự động, sử dụng cặp mồi đọc trình tự là M13 forward và reverse.
Gen PRSVN và vector p2K7 đợc cắt bằng hai enzim Sac I và Xba I, đợc tinh sạch bằng điện di trên gel agarose. Cấu trúc 35S pro - gen PRSVN - Nos ter đợc cắt ra bằng Hind III và Kpn I và đa vào vector chuyển gen pCAMBIA2300 đã đợc mớ vòng cũng bằng hai enzim Hind III và KpnI. Sau đó, đoạn gen và vector này đợc xử lý tạo đầu bằng với enzim Mung Bean, tiếp theo là cắt với enzim Nco I.
Protein tổng số phân tích trên gel acrylamide đợc chuyển sang màng nitrocellulo PVDF bằng điện di ở 60V trong 1 giờ. Do vậy chúng tôi đã chọn cặp này với nhiệt độ kết cặp là 550C cùng với cặp MB11-MB12 để sàng lọc PRSV từ các mẫu thu ở Việt Nam. Sử dụng chơng trình Aligment của phần mềm DNAstar để so sánh trình tự gen CP đợc nhân lên bằng hai cặp primer khác nhau.
Vì trình tự các nucleotide của PRSVN và nh2nh5 tơng đồng nhau nhng do trình tự của PRSVN (907 bp) dài hơn trình tự của nh2nh5 (781 bp) và có điểm cắt của enzim Xba I và Sac I ở hai đầu mút (trong trình tự của primer) thuận tiện hơn cho việc gắn vào các vector nên chúng tôi đã chọn đoạn gen PRSVN cho thí nghiệm tiếp theo. Kiểm tra gen PRSVN nhận đợc bằng PCR nhân lên đoạn đặc hiệu của gen CP Ba cặp primer đặc hiệu cho gen CP của PRSV đã đợc sử dụng. Kết quả là với cặp primer 10U&10L đã nhân lên đợc đoạn ADN khoảng 550bp ở cả hai gen PRSVN từ PRSV của Việt Nam và CP từ PRSV của Malaysia.
Gen PRSVN đã đợc đa vào vector pRSETA và đợc biến nạp vào chủng E.coli kết quả đợc kiểm tra băng cắt với enzim giới hạn (ảnh 8). Sau khi protein tổng số đợc cố định trên màng, lai với kháng thể và phát hiện bằng nhuộm BCIP/NBT , băng protein ~40kD đã xuất hiện trên dòng 2 mà không thấy xuất hiện trên dòng 1 và 3 là mẫu đối chứng âm. 12 mẫu lá đu đủ bị nhiễm PRSV thu từ 12 địa phơng khác nhau đã đợc tách ARN tổng số và sàng lọc PRSV.Trong số mẫu sàng lọc, chúng tôi chỉ xác định.
Gen PRSVN đã đợc khẳng định bằng sự nhân lên đoạn đặc hiệu cho gen CP của PRSV và cả ở mức độ biểu hiện ra sản phẩm protein. Gen PRSVN này đã đợc đa vào vector chuyển gen pCAMBIA2300 và đợc biến nạp vào chủng Agrobacterium LBA 4404 sẵn sàng cho chuyển gen.