Thiết kế Ti-plasmid tái tổ hợp pBI121 mang gen mã hóa kháng nguyên glycoprotein của virus dại phục vụ chuyển gen

Bệnh truyền nhiễm là căn bệnh nguy hiểm cướp đi sinh mạng của rất nhiều người trên thế giới, đặc biệt là ở những nước đang phát triển. Cho đến nay bệnh truyền nhiễm vẫn chưa có thuốc điều

MỞ ĐẦU

Bệnh truyền nhiễm là căn bệnh nguy hiểm cướp đi sinh mạng của rất nhiềungười trên thế giới, đặc biệt là ở những nước đang phát triển Cho đến nay bệnh truyềnnhiễm vẫn chưa có thuốc điều trị hoặc nếu có thì giá thành vẫn còn cao so với mức thunhập của người dân ở các nước này Vì vậy vaccine đã trở thành phương tiện quantrọng và hiệu quả trong việc phòng và chống lại các căn bệnh truyền nhiễm [11].

Nằm trong số những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, bệnh dại vẫn còn là vấn đềnghiêm trọng với các nước đang phát triển, gây ra tỷ lệ tử vong cao cho người và giasúc Hàng năm, có khoảng 50.000 người chết vì những căn bệnh này và có tới 10 triệuliều vaccine được dùng Hơn 99% người chết do bệnh dại là ở châu Phi, châu Á vàNam Mỹ trong đó chỉ tính riêng Ấn Độ mỗi năm có tới 30.000 người chết (Theo báocáo của tổ chức y tế thế giới) Hiện nay, có hơn 2,5 tỷ người đang sống trong vùng cótiềm ẩn bệnh dại, trong đó trẻ em ở vào độ tuổi từ 5 - 15 có nguy cơ mắc bệnh cao nhất[33]

Ở Việt Nam, bệnh dại vẫn đang là vấn đề nan giải Theo số lượng thống kê củaViện Paster chỉ tính riêng thành phố Hồ Chí Minh, năm 2001, trên địa bàn Thành phốcó 82.000 người bị súc vật cắn phải đi tiêm phòng tại các cơ quan y tế Nhưng hiện nayvẫn chưa có thuốc đặc trị căn bệnh này, vì vậy việc phòng chống bệnh bằng vaccine làphương pháp tối ưu nhất Tuy nhiên, những loại vaccine trên thị trường hiện nay phổbiến là loại vaccine bất hoạt Vaccine này có nhiều hạn chế như phản ứng phụ cao,không an toàn tuyệt đối, virus có thể phục hồi lại khả năng gây bệnh.

Sự phát triển của công nghệ sinh học đã cho phép tạo ra những loại vaccinehoàn toàn mới Những loại vaccine này có thể từ trước tới nay chưa hề có, hoặc đơngiản có thể chỉ là những vaccine có hiệu lực cao hơn và phản ứng phụ ít hơn so vớivaccine cổ điển Hiện nay, sử dụng phương pháp ADN tái tổ hợp trên các đối tượng

khác nhau như E coli, nấm men… người ta đã tạo thành công một số loại vaccine thế

hệ mới Nhưng đối với vaccine dại và một số loại vaccine khác việc biểu hiện trong cáctế bào vi sinh vật lại gặp nhiều khó khăn Do đó, việc nghiên cứu sản xuất vaccine trêncác đối tượng cây trồng (khoai lang, đu đủ, lạc, cà chua, thuốc lá…) đang được nhiềunhà khoa học quan tâm vì tính hiệu quả của nó Sản xuất vaccine tái tổ hợp trên các đốitượng cây trồng sẽ giảm giá thành xuống rất nhiều so với vaccine đang được sản xuất

trên tế bào động vật Vì vaccine thực vật có thể sản xuất được một lượng lớn, kỹ thuậtđơn giản phù hợp với trình độ các nước nghèo và đang phát triển Hơn thế nữa, vì làvaccine ăn hoặc uống được, nên vaccine thực vật đơn giản hoá các bước khi sử dụng vàbảo quản [1, 13].

Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Thiết kế plasmid tái tổ hợp pBI121 mang gen mã hóa kháng nguyên glycoprotein của virusdại phục vụ chuyển gen” với mục đích tạo ra vectơ tái tổ hợp mang gen mã hoá kháng

Ti-nguyên vỏ của virus dại có khả năng gây đáp ứng miễn dịch để chuyển vào thực vật,nhằm tạo ra cây trồng chuyển gen có khả năng sản xuất vaccine tái tổ hợp ăn, uốngđược.

Chơng 1 Tổng quan tài liệu

1.1 Giới thiệu chung về Vaccine

1.1.1 Vaccine và hiệu quả phòng chống bệnh truyền nhiễm

Kể từ khi Edward Jenner (1749-1823) tìm ra phơng pháp tiêm chủng mủ đậumùa bò cho ngời để phòng bệnh đậu mùa đến nay đã hơn 200 năm Cho đến nayvaccine vẫn đợc coi là thành tựu vĩ đại nhất của y học hiện đại Công tác tiêm chủng đãđợc thực hiện ở tất cả các quốc gia trên thế giới và trở thành một tấm lá chắn hữu hiệuchống lại nhiều bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do virus gây ra Nhờ có vaccine màhàng trăm triệu ngời trên thế giới đã thoát khỏi bệnh tật và thần chết Vaccine là chếphẩm kháng nguyên chỉ gây phản ứng miễn dịch mà không gây bệnh Vaccine dùng đểkích thích đáp ứng miễn dịch nguyên phát làm tăng tế bào ghi nhớ và khả năng đáp ứngmiễn dịch ghi nhớ khi tiếp xúc với kháng nguyên ấy trong tơng lai Kháng nguyênkhông nhất thiết phải là toàn bộ hạt virus, chúng có thể chỉ là một bộ phận của virus cókhả năng kích thích cơ thể sản xuất kháng thể hoặc xytokin trung hoà virus [2]

Đối với các nớc đang phát triển, vaccine đợc coi là biện pháp phòng và chữabệnh hiệu quả nhất, do tại đây bệnh truyền nhiễm vẫn còn là căn bệnh nguy hiểm, chacó thuốc điều trị đặc hiệu hoặc nếu có thì giá thành lại quá cao so với thu nhập của ngờidân Còn với những nớc phát triển, tình hình mắc bệnh truyền nhiễm và tỷ lệ tử vong dobệnh này đã giảm đáng kể, ở một số nớc, tỷ lệ tử vong chỉ còn chiếm 4 - 8% tổng sốcác trờng hợp tử vong Điều này không có nghĩa là vaccine không còn quan trọng ở cácnớc này nữa Thực tế cho thấy rằng, tỷ lệ bệnh truyền nhiễm giảm đáng kể là nhờ việcsử dụng một cách rộng rãi vaccine cho việc phòng chống bệnh trong nhiều thập kỷ qua.Ví dụ cụ thể đối với bệnh đậu mùa, năm 1967 có tới hơn mời triệu ngời mắc, bệnh nàyđã lan truyền trên 30 nớc, nhng đến nay nhờ việc sử dụng vaccine trong nhiều năm màngời ta đã loại bỏ đợc hoàn toàn căn bệnh này [2] ở Việt Nam, sau một thời gian dàithực hiện việc tiêm chủng liên tục, vào năm 2000 chúng ta đã tuyên bố với cả thế giớivề việc đã thanh toán xong bệnh bại liệt.

Hiệu quả của việc sử dụng vaccine không chỉ giới hạn ở mặt phòng và chữa bệnhmà còn rất có lợi về mặt kinh tế Chi phí cho tiêm chủng rẻ hơn rất nhiều so với để chongời dân mắc bệnh rối mới chữa Các thuốc kháng sinh cũng nh hoá trị liệu thờng rấtđắt tiền, đấy là cha kể tới chi phí về đi lại, giảm năng suất lao động, gây ra tác dụng phụcũng nh gia tăng chi phí về dịch vụ y tế [9].

Bên cạnh đó vaccine còn có vai trò quan trọng trong ngành thú y, đặc biệt đốivới các cơ sở chăn nuôi có mật độ gia súc cao làm cho khả năng lây nhiễm gia tăngnhanh chóng Nhất là trong tình trạng hiện nay, chúng ta đang phải đối phó với nhiềuloại dịch bệnh gây tổn thất nặng nề cho nên kinh tế quốc dân, điển hình là bệnh cúmgia cầm xuất hiện gần đây ở nớc ta [4].

Hiện nay, nhiều loại accine giảm độc lực và vaccine bất hoạt đang đợc sử dụngđể dự phòng nhiều loại bệnh khác nhau Vấn đề đáng lo ngại là các vaccine sống giảmđộc lực gặp phải là sự phục hồi trở lại khả năng gây bệnh của chúng Chẳng hạn nh

vaccine Sabin (vaccine giảm độc lực để phòng bệnh bại liệt), trình tự axit nucleic củachủng vaccine và chủng hoang dại chỉ khác nhau có hai nuclêotit vì vậy theo thời gianchúng có thể đột biến ngợc trở lại thành chủng hoang dại có khả năng gây bệnh Theothống kê gần đây cho thấy, từ năm 1973 đến năm 1984 khi sử dụng vaccine Sabin đểphòng bệnh bại liệt, cứ 520 nghìn trờng hợp sử dụng thì có một trờng hợp mắc bệnh bạiliệt do virus đột biến ngợc trở lại Còn có một điều nguy hiểm nữa là vaccine giảm độclực là các virus sống, chúng có thể nhân lên hoặc tồn tại dới dạng tiểm ẩn trong cơ thểvà có thể gây hậu quả nghiêm trọng trong tơng lai Một nguy cơ nữa là, tác nhân giảmđộc lực dùng trong sản xuất vaccine tuy không có khả năng gây bệnh đối với cơ thể ng-ời khoẻ mạnh nhng lại vẫn có khả năng gây bệnh đối với ngời bị suy giảm miễn dịch.Do đó, đối với một số nớc đang phát triển, vẫn đề sẽ là rất đáng lo ngại nếu có nhiều trẻem bị suy giảm miễn dịch do suy dinh dỡng đợc dùng loại vaccine này [6].

Công nghệ ADN tái tổ hợp và phơng pháp tổng hợp bằng phơng pháp hoá học cóvai trò rất lớn trong việc khắc phục những vấn đề trên, cho phép chúng ta sản xuất đ ợccác vaccine phòng bệnh mà đối với phơng pháp cổ điển không thể tạo ra đợc.

1.1.2 Vaccine tái tổ hợp

Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, có rất nhiều loại vaccine mới đợctạo thành Những loại vaccine này đã khắc phục đợc những bất lợi của các loại vaccinecổ điển và có hiệu lực cao hơn, chúng đợc gọi là vaccine tái tổ hợp

Vaccine tái tổ hợp không đợc sản xuất theo cách thông thờng, chúng đợc sảnxuất ra từ một loại cơ thể sống có thể đợc xem là hoàn toàn vô hại Để tạo ra đợc mộtloại vaccine tái tổ hợp trớc hết ngời nghiên cứu phải xác định đợc phân tử nào tạo rađáp ứng miễn dịch đặc hiệu, những phân tử này có thể là các protein, glycoprotein hoặcthậm chí là một đoạn phân tử ADN (DNA vaccine) Phơng pháp ADN tái tổ hợp có thể

đợc sử dụng để tạo ra hàng loạt phân tử này trong những vi sinh vật vô hại nh E coli,

nấm men hoặc tế bào động vật với các vectơ là các virus không gây bệnh nhBaculovirus, Vaccinia virus, Adenovirus [4] Bằng phơng pháp này, ngời ta có thể tạo rađợc vaccine ngay cả khi các tác nhân gây bệnh không thể nuôi cấy đợc hoặc các tácnhân có thể nuôi cấy đợc nhng trong điều kiện rất khó khăn đòi hỏi chi phí tốn kém.Không những thế, vaccine tái tổ hợp có khả năng gây đáp ứng miễn dịch định hớng vớitừng thành phần của virus, ổn định, có thể không cần bảo quản lạnh và rất an toàn vìgen độc đã đợc loại trừ [27] Các vaccine thế hệ mới bao gồm: Vaccine dới đơn vị(subunit vaccines) chỉ chứa một số phân tử nhất định của tác nhân gây bệnh, ví dụ nhvaccine viêm gan B đợc sản xuất bằng công nghệ ADN tái tổ hợp đang đợc sử dụngrộng rãi trên thế giới, hoặc vaccine ADN là những phân tử ADN có khả năng gây phảnứng miễn dịch Mặc dù, công nghệ ADN tái tổ hợp và phơng pháp tổng hợp hoá học đãcó vai trò rất lớn trong việc khắc phục những bất lợi của các loại vaccine cổ điển, nh ngcho đến nay số vaccine tái tổ hợp đợc sản xuất và đa ra thị trờng không nhiều Đối vớimột số loại vaccine do cấu trúc của phân tử kháng nguyên nên việc biểu hiện chúng ởđối tợng vi sinh vật gặp rất nhiều khó khăn nh vaccine dại, vaccine viêm não Nhật Bản.

Vấn đề đặt ra ở đây là phải tìm ra đợc một hệ thống biểu hiện đầy đủ phân tử khángnguyên của virus Trên thế giới, nhiều nhà khoa học đang tập trung nguyên cứu sảnxuất vaccine trên các đối tợng cây trồng nh: cây thuốc lá, cây lạc, khoai lang, cà chua,chuối… h ớng nghiên cứu này tỏ ra rất có triển vọng Bởi vì, vaccine đợc sản xuất theo hcách này không những đã khắc phục đợc những nhợc điểm của các vaccine cổ điển màcòn làm giảm đáng kể giá thành sản phẩm so với vaccine đợc sản xuất trên tế bào độngvật, vaccine thực vật có thể đợc sản xuất một lợng lớn với kỹ thuật đơn giản phù hợp vớitrình độ của các nớc nghèo Bên cạnh đó vaccine thực vật còn có giá trị sử dụng và bảoquản, vì nó là loại vaccine ăn đợc hoặc uống đợc (edible vaccine, oral vaccine) [26].1.2 Bệnh dại ( Rabies disease)

Virus dại thuộc họ Rhabdoviridae, chi Lysavirrus là loại virus hớng thần kinh

gây bệnh rất nặng cho các loài động vật máu nóng vì tế bào thần kinh không thể táisinh đợc, hơn nữa khi virus nhân lên sẽ làm mất tính gây độc của tế bào [10] Virus cóhình viên đạn, trọng lợng phân tử 3,5 - 4,6 x 106mol wt với chiều dài khoảng 180nm, đ-ờng kính 75nm, chứa genome là ARN sợi đơn âm (-) Virus nhân lên trong tế bào chấtvà nảy chồi từ màng sinh chất [16]

Bệnh dại đợc truyền cho ngời thông qua các vết cắn của các loài vật trung gian.Các loài thú ăn thịt hoang dã và súc vật nuôi trong nhà (chó, cáo, chó sói, chồn, mèo,dơi… h) đều có thể là ổ chứa virus dại ở trung Mỹ và Nam Mỹ có những đàn dơi hútmáu, dơi ăn quả và dơi ăn côn trùng cũng bị nhiễm virus dại Còn đối với nớc ta, nguồntruyền virus dại cho ngời chủ yếu là chó, mèo nuôi trong nhà (khoảng gần 97%) [11].Bệnh dại xảy ra hầu hết các nớc trên thế giới loại trừ một số hòn đảo vùng Caribê, nớcAnh, Ireland, Nhật Bản, Đài Loan, Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha ở vùng Tây Âu,Canađa, US, và một vài nớc châu Mỹ Latin bệnh dại đã đợc phòng trừ đối với các vậtnuôi trong nhà, tuy nhiên virus dại vẫn còn tồn tại ở trong những loài động vật hoang dã[32].

Khi ngời bị con vật nhiễm dại cắn, virus từ nớc bọt của con vật sẽ xâm nhập trựctiếp vào hệ thống thần kinh ngoại biên và tấn công vào hệ thống thần kinh trung ơnghoặc chúng cũng có thể nhân lên trong tế bào cơ Thời gian ủ bệnh trong 2 - 8 tuần lễ(có thể chỉ khoảng 10 ngày nhng cũng có thể kéo dài một năm, thậm chí lâu hơn) Thờigian ủ bệnh tuỳ thuộc vào vị trí vết cắn và số lợng virus xâm nhập vào cơ thể qua vết

Hình 1 ảnh chụp virus dại d ới kính hiển vi điện tử

cắn Nếu vết cắn gần đầu và cổ thì thời gian ủ bệnh sẽ rất ngắn Cơn dại bắt đầu vớicảm giác sợ hãi, đau đầu, sốt, khó chịu và cảm giác dị thờng liên quan đến vết thơng dosúc vật cắn Mỗi khi nhìn thấy nớc hoặc uống nớc, cơ nuốt co thắt làm cho bệnh nhânsợ hãi Sau đó bệnh tiến triển đến liệt, co cơn điên cuồng hoặc co giật Bệnh thờng kéodài từ 2 đến 6 ngày, đôi khi lâu hơn Nạn nhân chết do liệt cơ hô hấp Tất cả nhữngbệnh nhân khi đã lên cơn dại đều dẫn đến tử vong [6].

Việt Nam, trớc 1999, mỗi năm có hàng triệu ngời bị chó dại cắn phải tiêm phòngdại, 400 - 500 ngời chết do bệnh này: trong đó 30% là các cháu nhỏ dới 14 tuổi ớc tínhmỗi năm, Việt Nam phải tốn tới vài chục tỷ đồng để mua vaccine cho ngời và chó mèo.Hiện nay, số lợng tử vong do bệnh dại đã giảm 65% Tuy nhiên, hàng năm vẫn có 50 -60 trờng hợp tử vong do bệnh dại và hơn 650.000 ngời bị súc vật cắn phải đi tiêmphòng Bệnh dại xảy ra vào tất cả các mùa trong năm, nhất là vào mùa hè, tình hìnhdịch bệnh càng tăng cao Hầu hết các địa phơng trên cả nớc đều có ngời và súc vật mắcbệnh dại, trong đó đồng bằng sông Hồng và trung du Bắc Bộ phổ biến hơn cả [11]

Gần đây, nguy cơ này càng tăng cao khi bệnh dại diễn ra phức tạp ở nhiều nớcláng giềng Từ năm 2001 đến nay số ngời tử vong do bệnh dại tại Trung Quốc liên tụctăng từ 850 ngời lên tới 1.300 ngời nguyên nhân là số chó cảnh và số chó hoang dại giatăng, tỷ lệ đợc tiêm phòng thấp Hàn Quốc đã đợc công nhận là thanh toán đợc hoàntoàn bệnh dại nhng trong năm 2003 lại có 2 ngời chết vì bệnh dại Việt Nam có quan hệmua bán súc vật với các nớc kể trên lại có khí hậu nóng ẩm nên rất rễ phát triển bệnhdại [11].

1.2.1 Gen mã hoá cho kháng nguyên glycoprotein của virus dại

Virus dại thuộc họ Rhabdoviridae, chúng là những virus ARN, sợi đơn âm (-).

Chính vì thế, dạng ARN anti-sense của nó mang thông tin cần thiết để mã hoá chonhững protein virus Điều này có nghĩa rằng, sợi ARN của hạt virus không trực tiếptham gia vào quá trình tổng hợp protein mà chúng đợc sao thành sợi dơng có vai trò làARN thông tin Để làm đợc điều này, khi xâm nhập vào tế bào vật chủ, virus phải mangtheo một enzym ARN polymerase phụ thuộc ARN (enzym tổng hợp sợi ARN bổ sungtừ sợi khuôn ARN) [30].

Giống nh tên gọi của chúng, những virus này có dạng hình que, có một đầutròn thờng đợc ví với hình viên đạn Lớp màng ngoài có nguồn gốc từ màng tế bàochất của tế bào vật chủ do chúng nhân lên trong tế bào chất và xuất bào bằng cáchnảy chồi ra từ màng sinh chất [10] Một hạt virus bao gồm một lõi nucleocapsid làribonucleoprotein có vai trò quyết định đến tính lây nhiễm của virus Đó là một cấutrúc chuỗi xoắn nằm bên trong lớp màng của virus Chuỗi ARN của virus dài 12 Kb,mã hoá cho 5 loại protein đó là [33].

- Protein G (Glycoprotein): là những glycoprotein có trọng lợng phân tử 67kDa tồn tạidới dạng trime đợc mã hoá bởi đoạn gen dài 1675bp Glycoprotein tạo thành chồi gai

bề mặt dài khoảng 5 - 10nm, mang tính kháng nguyên kích thích cơ thể sản xuất rakháng thể trung hoà hạt virus.

- Protein M (matrix): đây là một protein màng ngoại vi có trọng lợng phân tử26kDa Về chức năng của chúng vẫn đang còn là vấn đề gây tranh cãi, cũng có thể nóhoạt động với vai trò là cầu nối giữa nucleocapsid với màng tế bào hoặc lớp gaiglycoprotein bề mặt.

- Protein N (nucleoprotein) là cấu trúc bao quanh ARN genome virus có trọng ợng là 55kDa Tác dụng của protein này là bảo vệ genome tránh đợc sự phân cắt củanucleases và giữ cho nó có hình dạng thích ứng trong quá trình dịch mã.

l Protein L (lagre) và NS (một loại protein phi cấu trúc, nó cũng đợc biết đến nhphosphoprotein có khối lợng phân tử 38 kDa) hai protein này cùng nhau tạo nên dạngARN polymerase phụ thuộc ARN Protein L có khối lợng phân tử 110kDa và đoạn genmã hoá cho nó chiếm khoảng 60% (6475bp) chiều dài của hệ gen [33].

Nhờ ứng dụng những tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền, đặc biệt là kỹthuật ADN tái tổ hợp, chúng tôi đang tiến hành thiết kế vectơ tái tổ hợp mang genmã hoá cho phân tử glycoprotein của virus dại để chuyển vào thực vật và thực vậtcải biến di truyền này sẽ sản xuất ra vaccine dại.

1.2.2 Phân tử glycoprotein của virus dại và cơ chế gây miễn dịch

Phân tử glycoprotein của virus dại tạo thành một lớp gai bề mặt cắm sâu vàomàng của virus, có khối lợng là 65kDa, thờng tồn tại ở dạng cấu trúc trime, là mộtprotein vận chuyển màng (transmembrane) Một hạt virus có khoảng 1200 protein Gtạo thành 400 trime, giữ vai trò nh một kháng nguyên khi liên kết với tế bào đích đồngthời có tác dụng dung hợp virus với màng tế bào vật chủ khi xảy ra quá trình nhập bào[34] Quá trình xâm nhập của virus xảy ra theo con đờng nhập bào bởi vì phân tử dạng

Hình 3 Hệ gen của virus dạiHình 2 Cấu trúc virus dại

trime có thể chịu đợc pH 6,1 ở pH này cấu trúc trime của phân tử rất bền vững và cóthể cho phép một vùng kị nớc trên phân tử đợc bộc lộ và gắn vào màng của tế bào vậtchủ khi xâm nhập [18]

Virus dại cũng nh các loại khác thuộc chi lysavirus là một loại virus hớng thầnkinh gây ra bệnh viêm thần kinh cấp tính ở nhiều loài động vật có vú Virus bền vững ởtừ pH 3 đến pH 11, và có thể sống nhiều năm ở -70oC hoặc đợc đông khô và giữ ở 0 -4oC Nhng nó cũng bị bất hoạt nhanh chóng khi bị sấy khô, dới tác dụng của tia UV, tiaX, ánh sáng mặt trời, trypsin, -proplolactone, hoặc các chất tẩy rửa khác [10] Phân tửglycoprotein liên kết với thụ thể đặc hiệu sẽ gây đáp ứng miễn dịch qua trung gian tếbào có sự tham gia của những tế bào T và T- bổ trợ Khi đợc kích thích, tế bào T sẽ tiếtra lymphokin hoạt hoá các đại thực bào, những đại thực bào này sẽ tới và diệt virus.Còn tế bào T- bổ trợ, chúng sẽ kích thích tế bào B sản xuất ra kháng thể trung hoà virus[9].

Liên kết đặc hiệu của phân tử glycoprotein với các phân tử trên bề mặt tế bàothần kinh là một minh chứng, khẳng định sự tồn tại của thụ thể tế bào thần kinh đặchiệu cho phân tử glycoprotein Trong một nghiên cứu gần đây, ngời ta sử dụngglycoprotein dạng hoà tan để kiểm tra trên ngân hàng tế bào thần kinh phôi, và đã chỉ rađợc sự tồn tại của thụ thể nuerotrophin p75 murine với vai trò là một thụ thể củaglycoprotein Thụ thể p75 nuerotrophin tồn tại bền vững trong động vật có xơng sốngvà việc biểu hiện của nó tuỳ thuộc vào sự phát triển của bệnh Trong quá trình phát sinhphôi, p75 tồn tại ở cả tế bào nơron thần kinh và tế bào khác, nh ng đến tuổi trởng thànhnó chỉ đợc biểu hiện ở tế bào thần kinh ngoại vi và tế bào thần kinh trung ơng p75 cóchứa 4 miền giàu sistein (CRD) ở đầu N, đây là đặc điểm đặc trng của liên họ thụ thểTNF Nhng khác với cấu trúc trime của họ TNF, họ NGF của ligand neurotrophin lại cócấu trúc dime ái lực liên kết với p75 dao động trong khoảng vài nanogram, vị trí liênkết đã đợc xác định là một vùng bao gồm cả CRD2 và CRD3 Vai trò sinh lý học củaliên kết này trong các nơron thần kinh ngày nay vẫn còn đang là một vấn đề tranh cãi Mộtvài hớng nghiên cứu mới đây khám phá ra rằng, tiền neurotrophin cũng có ái lực cao vớip75 [25]

1.3 Vi khuẩn agrobacterium timefaciens và hiện tợng biến nạp gen vào thực vật.

Trong tự nhiên chúng ta thờng gặp ở vùng cổ rễ các loài thực vật hai lá mầm mộtloại khối u gồm các loại tế bào không phân hoá và phát triển không có tổ chức Nhữngkhối u này mất khả năng phân cực và phân chia liên tục giống nh tế bào ung th ác tính ởđộng vật Theo cơ chế hình thành ngời ta phân biệt hai loại khối u chính Đó là khối udi truyền và khối u cảm ứng Khối u di truyền thờng xuất hiện ở một vài cặp lai có tínhchất hoà hợp không cao ở một nhiễm sắc thể riêng rẽ nào đó, đặc biệt khi lai các loài

khác chi của thuốc là Nicotiana hoặc chi rau cải Brasica Loại khối u cảm ứng đợc biếtđến nhiều nhất là khối u crown gall do loại vi khuẩn đất a tumefaciens gây nên Cơ chế

chính hình thành khối u cảm ứng này đợc Braun và Schiperoort nghiên cứu kỹ năm

1960 và đa lại những thành tựu quan trọng cho việc phát triển kỹ thuật di truyền tế bàothực vật [4]

Về bản chất phân tử của quá trình cảm ứng phát sinh khối u ở thực vật, trớc hết

là quá trình nhiễm vi khuẩn a tumefaciens ở các vùng tế bào bị thơng của cây Bởi vì,

các tế bào bị thơng ở cây tiết ra những hợp chất polyphenol là acetosingone (AS) có

chức năng dẫn dụ tế bào vi khuẩn a tumefaciens Các tế bào vi khuẩn không xâm nhập

vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển nạp cho chúng một loại plasmid gây nên tính trạngphát sinh khối u đợc gọi là Ti-plasmid (Tumor inducing) Cho đến nay trình tự nuclêotitcủa Ti-plasmid đã đợc xác định Ti plasmid là một phân tử ADN vòng tơng đối lớn gồm150.000 - 200.000 cặp nuclêotit Tuy nhiên, chỉ có một đoạn gồm 2000 - 3000 cặpnuclêotit có khả năng gắn vào hẹ gen của tế bào chủ đợc gọi là T-ADN Những enzymcó trách nhiệm chuyển nạp đoạn T-ADN từ plasmid vào hệ gen của tế bào chủ đ ợc màhoá bởi các đoạn gen vir [17] Bên cạnh những gen chức năng vừa kể trên Ti-plasmidcó mang gen tổng hợp indolyl acetic axit, một loại auxin tự nhiên, vì thế mà khi nuôi

cấy in vitro những tế bào thực vật cảm biến có thể sống trong môi trờng thiếu auxin và

cytokinin Ngoài ra, Ti-plasmid còn mang gen tổng hợp những axit amin hiếm, ví dụ:một loại u tạo octopin và loại khác tạo nopalin vì vậy ngời ta phân biệt 2 loại plasmid là

loại nopalin và octopin có trong các chủng a tumefaciens khác nhau Về trình tự

nuclêotit chúng chỉ khác nhau ở đoạn gen mã hoá cho các enzym tham gia vào quátrình sinh tổng hợp nopalin và octopin [1].

Hiện nay, ngời ta đã thành công trong việc cải biến Ti-plasmid bằng cách cắt bỏhầu hết các đoạn gen gây phát triển khối u chỉ để lại đoạn gen vir và phần T-ADN tốithiểu mang điểm ghép gen Loại vectơ này đợc sử dụng rất có hiệu quả cho việc đaADN lạ vào tế bào thực vật không những đối với loại cây hai là mầm mà cả ở lúa là đạidiện của loại cây một lá mầm.

1.4 Giới thiệu chung về vectơ sử dụng trong chuyển gen

Để có thể chuyển gen vào thực vật thông qua a tumefaciens ngời ta phải sử

dụng một hệ thống vectơ chuyển gen Có hai loại vectơ chuyển gen đó là vectơ liên hợpvà vectơ nhị thể.

1.4.1 Vectơ nhị thể (binary vector)

Vectơ nhị thể ra đời đã khắc phục đợc tình trạng khó nhân bản trong a.tumefaciens của vectơ liên hợp Một vectơ nhị thể bao gồm những thành phần sau: 1)Vị trí ghép nối đa điểm; 2) Đoạn khởi đầu tái bản hoạt động cả trong E coli và a.tumefaciens, ví dụ RK2; 3) gen chọn lọc hoạt động cả ở vi khuẩn và thực vật nh gen

kháng kháng sinh, gen - glucuronidase… h; 4) có khả năng vận chuyển nh oriV, oriT,

trfA, chỉ cần khi chuyển thông qua a tumefaciens, không cần khi chuyển gen trực tiếp;

5) Đoạn T-ADN ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại biên bắt buộc phải có.Ngoài ra còn có một số thành phần phụ trợ khác nh gen kích thích vận chuyển T-ADN(T-DNA transfer stimulator sequence = TSS) Hệ vectơ nhị thể đợc thiết kế bao gồm hai

plasmid tự tái bản Loại vectơ vận tải mang GOI giữa đoạn biên của T-ADN và mộtplasmid bổ trợ có gen vir đảm nhận chức năng vận chuyển gen ngoại lai vào tế bào thựcvật Plasmid bổ trợ đợc cải biến từ Ti-plasmid tự nhiên bằng cách loại bỏ gen kích thíchtế bào thực vật phát triển thành khối u, nhng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bàothực vật [1].

Hệ thống vectơ nhị thể luôn đợc cải tiến để có thể nâng cao hiệu suất chuyển gen

thông qua A tumefaciens Một trong những hớng cải biến là đa vào vectơ một chuỗi

COS để phân lập các đoạn gắn lớn hoặc th viên gen thực vật, trong đó điển hình là vectơpBI121

1.4.2 Vectơ pBI121

Các vectơ chỉ thực hiện đợc chức năng của mình khi chúng có một số đặc tínhnh: có khả năng tự sao chép độc lập và tích cực trong tế bào vật chủ; có kích th ớc nhỏ,dễ nhận gen quan tâm, dễ xâm nhập và đợc sao chép; mang một số dấu hiệu chọn lọcgiúp phân biệt các tế bào mang plasmid tái tổ hợp với các tế bào không có plasmid táitổ hợp; tồn tại bền vững trong tế bào vật chủ Các đặc tính này là cơ sở quyết định cácthành phần chính của plasmid với: Gen quan tâm đợc gắn thêm đoạn khởi động và đoạnkết thúc; gen chỉ thị chọn lọc; các thành phần khác nh vùng khởi đầu sao chép và vùngtrình tự nhân dòng đa điểm cắt (MCS) [5] Vectơ pBI121 có kích thớc khoảng 13Kb vớicác thành phần chính nh sau:

* Đoạn khởi động gen (promoter)

Các gen ngoại lai có thể đợc biểu hiện thành protein cần phải có mặt các tín hiệuđiều khiển thích hợp ở những vị trí thích hợp Những tín hiệu không thể thiếu trong quátrình điều khiển biểu hiện gen bao gồm đoạn khởi động gen và đoạn kết thúc gen Đoạnkhởi động bao gồm trình tự nuclêotit phía đầu 5’ của các gen cấu trúc Nó đóng vai tròđiều khiển quá trình phiên mã nhờ khả năng đảm bảo các vị trí nhận biết cho enzymARN polymeraza, cho các yếu tố hoạt hoá và khởi động Cho đến nay một số promoterđợc sử dụng trong chuyển gen nh: Chuỗi khởi động xây dựng, chuỗi khởi động cảmứng, chuỗi khởi động trong các mô đặc thù Promoter 35S là một dạng chuỗi khởi độngxây dựng đợc tách từ virus khảm súp lơ (Cauliflower Mosaic virus 35S promoterCaMV35S-P), loại promoter nos [7] Trong các nghiên cứu chuyển gen thực vật,CaMV35S-P đợc sử dụng rộng rãi nhờ khả năng hoạt động mạnh ở nhiều loại mô củacây hai lá mầm, tuy nhiên nó lại ít hoạt động ở cây một là mầm Để khắc phục nh ợcđiểm này, CaMV35S-P đợc sử dụng kết hợp với các thành phần khởi động khác, chẳnghạn vectơ pEmu chứa nhiều bản sao của các tiểu phần phản ứng kị khí của gen Adh1 từ

ngô và các tiểu phần của gen tổng hợp octopin từ A tumefaciens đã làm gia tăng sự

biểu hiện của gen trong cây một là mầm lên hàng chục lần [12].Promoter 35S dài 350bp, gồm 3 thành phần:

- Hộp TATA ( ở vị trí từ- 46 đến + 8)

- Vùng tăng cờng A (enhancer) từ vị trí - 90 đến - 46, làm tăng biểu hiện genngoại lai ở rễ.

-Vùng tăng cờng B (enhancer) từ vị trí -343 đến -90, làm tăng biểu hiện genchuyển ở lá Trong vùng B gồm 5 phần nhỏ từ B1 - B5 phân chia theo mức độ phản ứngcủa mỗi vùng đối với các yếu tố dịch mã khác nhau [17].

Nếu xảy ra sự thay đổi trong vùng tăng cờng từ vị trí -207 đến -56 có thể dẫnđến mất khả năng gây nhiễm của virus Lợi dụng tính chất này, có thể gắn gen ngoại lạivào vùng enhancer sẽ làm mất khả năng gây nhiễm của virus khảm súp lơ [17].

*Đoạn kết thúc.

Các đoạn kết thúc thờng chứa đuôi polyA nh AATTAA, hoặc AACCAA giúpbảo vệ các phân tử ARN thông tin đợc bền vững hơn và tránh đợc sự phân huỷ Haiđoạn kết thúc đợc sử dụng nhiều trong công nghệ gen thực vật là đoạn kết thúc củaCaMV35S (có mặt trong 7 sản phẩm chuyển gen hiện nay) và đoạn kết thúc NOS cómặt trong ít nhất 16 - 28 sản phẩm) [7].

*Gen chỉ thị

Các chỉ thị chọn lọc di truyền sử dụng trong biến nạp thực vật thờng có nguồngốc từ vi khuẩn hoặc thực vật, gồm 2 loại chính:

- Chỉ thị chọn lọc (selectable marker): kết cấu gen mang đoạn khởi động NOS

(nopaline synthase promoter-terminater) điều khiển sự biểu hiện gen kháng npt2(neomycin phospho transferase gene), chỉ có những thể biến nạp sống đợc trên môi tr-ờng có kháng sinh kanamycin Việc sử dụng gen chỉ thị cần đạt một số yêu cầu sau:chất chọn lọc ức chế sinh trởng các tế bào không đợc biến nạp, sự thể hiện của genchọn lọc không làm ảnh hởng tới trao đổi chất của các tế bào chuyển nạp, sự biểu hiệncủa gen chọn lọc bảo vệ tế bào khỏi tác dụng của chất chọn lọc, không ảnh hởng tới câychuyển gen [4].

- Chỉ thị sàng lọc (screenable marker) không chỉ giúp nhận biết các thể biến nạp

mà còn dự đoán đợc mức độ biểu hiện gen quan tâm trong mô thực vật đợc chuyển gen.Chẳng hạn, chỉ thị -glucuronidaza (GUS) cho phép sàng lọc hoạt tính của enzym dễdàng trên cơ sở kĩ thuật nhuộm hoá tế bào Gen chỉ thị sàng lọc cần có một số đặc điểmsau: sản phẩm của nó là độc nhất và không độc đối với tế bào thực vật, các enzym chỉthị phải có khả năng dịch mã ổn định cao, phơng pháp phân tích thuận tiện, rẻ tiền, độnhạy cao và có khả năng phản ứng với các polypeptit ngoài mà không ảnh hởng hoạttính enzym [7]

* Vùng khởi động sao chép và MCS

- Vùng pUC ori: vùng khởi động sao chép trong E coli, có nguồn gốc từ vectơ

pUC9

- RK 2 ori V: vùng khởi động sao chép trong A tumefaciens, có nguồn gốc từ

Trong tơng lai, việc tối u hoá hệ thống chủ/vectơ và cải tiến các vectơ trên cơ sởnghiên cứu tỉ mỉ các yếu tố tham gia vào quá trình chuyển nạp ổn định, các yếu tố đagen chuyển nạp vào vị trí nhất định trong genome thực vật và các điều kiện nuôi cấy táisinh cây chuyển gen vẫn là những vấn đề cần thiết trong nghiên cứu chuyển gen ở thựcvật.

1.4.3 Tình hình nghiên cứu vaccine thực vật trên thế giới

Cho dù hiện nay phần lớn thuốc chữa bệnh đợc tổng hợp bằng phơng pháp hoáhọc, tuy nhiên 1/3 tổng số thuốc trên thị trờng đều có nguồn gốc từ thực vật Cùng vớisự phát triển của công nghệ gen, thực vật lại đợc biết đến với một vai trò là một nguồnnguyên liệu mới trong việc sản xuất thuốc phòng bệnh Thực vật chuyển gen sản xuấtkháng nguyên phòng bệnh dịch tả, bệnh viêm gan B và bệnh dại đang đợc phát triển ởrất nhiều phòng thí nghiệm trên toàn thế giới (Boyce Thompson Plant Researchinstitute, Thomas Jeferson institute, North Carolina State University… h) [27].

Vaccine ăn đợc (edible vaccine) sản xuất ở trong thực vật ( Dr Charles Arntzen,Boyce Thompson institute for Plant Research, USA) đã xoá bỏ những rào cản trong việcsản xuất vaccine bằng phơng pháp nuôi cấy tế bào Đặc biệt đối với các nớc đang pháttriển, những rào cản này trở nên khó khăn hơn rất nhiều, chúng bao gồm: những yếu tố

Hình 4 Sơ đồ cấu trúc vectơ pBI121

cần thiết cho công nghệ lên men, quy trình tinh sạch nghiêm ngặt, đòi hỏi bảo quản ởnhiệt độ thấp trong suốt quả trình vận chuyển, giá thành cao… h Việc sản xuất vaccinebằng thực vật cải biến di truyền có thể cung cấp sản phẩm với giá rẻ hiện đang đợc thựchiện với các bệnh dại, bệnh dịch tả, bệnh viêm gan B, bệnh sốt rét, bệnh AIDS… h và chỉđơn thuần, khi ăn các loại thực vật này, cơ thể của chúng ta sẽ sinh kháng thể chống lạibệnh tật [27].

Dr arntzen cùng các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra cây thuốc lá sảnxuất vaccine phòng bệnh viêm gan B và chứng minh đợc rằng vaccine đợc sản xuấttrong thực vật có cấu trúc và chức năng tơng tự nh những vaccine đợc sản xuất từ huyếtthanh ngời hoặc từ tế bào nấm men Chúng cũng gây đáp ứng miễn dịch rất mạnh khi đ-ợc tiêm vào chuột Khandelwal và cộng sự cũng công bố đã thành công trong việcchuyển gen mã hoá cho protein ngng kết tố hồng cầu của virus dịch hạch ở bò vào câylạc, cây thuốc lá [23, 24].

Một loại vaccine khác cũng đợc tạo thành theo cách này, đó là vaccine phòngbệnh tiêu chảy Dr arntzen cùng các cộng sự cũng đã tạo ra đợc cây thuốc lá và câykhoai tây chuyển gencó chứa một lợng lớn các chất kháng nguyên hoạt động là các độc

tố trong ruột không bền với nhiệt của E coli (E coli heat labile enterotoxin = LT-B).

Độc tố này có cấu trúc tơng tự nh độc tố của virus tả Những con chuột đợc ăn các loạithực vật này đã bộc lộ phản ứng miễn dịch rất mạnh Các cuộc thử nghiệm biểu hiệnlâm sàng trên những ngời tình nguyện bằng việc sử dụng khoai tây tơi chứa vaccinephòng bệnh tiêu chảy sẽ sớm kiểm chứng hiệu quả của vaccine có nguồn gốc từ thựcvật [27].

Những nhà nghiên cứu ở trờng đại học Thomas Jefferson bang Philadelphia,USA đã tạo ra cây cà chua có biểu hiện kháng nguyên của virus dại Dr Karaser và cáccộng sự tại phòng thí nghiệm Biotechnology Foundation của Thomas JeffersonUniversity cũng đã biểu hiện đợc vaccine dại trong cây rau bina (spinach) Dr Karaserthông báo rằng, đề tài nghiên cứu này đã đợc kiểm chứng bằng một cuộc thử nghiệmgồm 16 ngời chia thành hai nhóm: một nhóm đối chứng và một nhóm thí nghiệm.Nhóm thí nghiệm đợc ăn khoảng 150g lá rau bina Kết quả khi kiểm tra thì những ngờinày có số lợng kháng thể tăng hơn so với nhóm còn lại Vaccine dại từ thực vật sẽ đợcphát triển một cách đầy đủ trong vòng từ 2 - 4 năm tiếp theo [13].

Xuất phát từ nhu cầu về vaccine ở nớc ta hiện nay, đồng thời để nhanh chóngnắm bắt và tiếp cận với công nghệ mới trong việc sản xuất vaccine và các dợc chất chữabệnh cho ngời, động vật trên đối tợng cây trồng Phòng công nghệ tế bào thực vật thuộcViện Công nghệ Sinh học đang thực hiện một số đề án chuyển gen mã hoá cho khángnguyên của một số virus nh virus dại và virus viêm não Nhật Bản vào cây trồng

Chơng 2 Vật liệu v à phơng pháp

2.1.Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Các chủng vi sinh vật và cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

- Vi khuẩn A tumefaciens chủng Cv58C1, pGV2206 và pGV3101 và vi khuẩnE.coli chủng DH5 của hãng Gibco BRL, life Technologies, Mỹ

- Chủng E Coli Top 10 mang vectơ pBI121.

- Cặp mồi đặc hiệu RabG-start-BamHI, RabG-stop-SacI hãng invitrogen tổng hợp

- Plasmid (vectơ pCR

2.1+ gen GlyP) mang toàn bộ gen mã hóa cho phân tửglycoprotein của virus dại chủng Vnucovo-32.

Các vật liệu trên đợc Viện Công nghệ sinh học cung cấp.

2.1.2 Hoá chất, thiết bị * Hóa chất

Hoá chất dùng trong nghiên cứu là của hãng: Invitrogen, Amersham Parmacia Biotech, New England Biolabs… h Bao gồm một số hoá chất sau:

- Bộ hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR của hãng Applied Biosystem (Mỹ)- Bộ kít thôi gel của hãng QIAGEN ( QIAquick Gel Extraction Kit)

- Bộ kit tinh sạch ADN của hãng QIAGEN (QIAquick DNA Purification Kit)

- Thang ADN 1Kb của hãng MBI Fermantas, hai enzym BamHIvà SacI, dung

dịch đệm, BSA

- Dung dịch đệm 10X, rATP, T4 ligase- Pepton 10g/l, trypton 10g/l, Yeast extract- NaCl, MgSO4.7H2O, 1mM HEPES

- Agarose, sucrose, 50mM glucose

- Glycerol , 0,1 M CaCl2, 5M acetat potassium, acetic acid, NaOH, SDS 1% - C¸c lo¹i kh¸ng sinh kanamycin, ampecilin vµ rifamycin

- Cån 70%, dung dÞch chloroform : isopropanol (24 : 1), níc khö ion, RNase- 25mM Tris HCl pH 8, 10mM EDTA pH 8 (Ethylene Diamine tetraacetic)

* ThiÕt bÞ

- M¸y PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mü), m¸y ®iÖn di Powerpac300(Bio-Rad, Mü), m¸y soi ADN (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mü), m¸y chôp ¶nh(Amersham Pharmacia Biotech, Thuþ §iÓn), m¸y Vortex (Mimishaker, IKA, §øc),m¸y hót ch©n kh«ng Speed-Vac 110A (Savant, Mü), m¸y ly t©m, m¸y xung ®iÖn GenePlulser, cïng víi c¸c trang thiÕt bÞ kh¸c cña Phßng C«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt, ViÖnC«ng nghÖ sinh häc.

gus NOST 35S

pBI121 … pBI121

pBI121 … pBI121

2.2.1 PCR nhân gen đặc hiệu

PCR viết tắt từ chữ Polymerase Chain Reaction là phơng pháp nhân nhanh mộtđoạn ADN mong muốn trong ống nghiệm Theo lý thuyết sẽ có 3 đoạn ADN đó là:đoạn ADN khuôn cần nhân bản, mồi xuôi và mồi ngợc Thêm vào đó là các thành phần:Taq polymerase, dNTPs (ATP, TTP, CTP và GTP) và một dung dịch muối MgCl2 Mộtphản ứng PCR đợc thực hiện nh sau:

Bổ sung lần lợt những chất sau đây vào ống PCR 0,5 ml Bảng 1 Thành phần của phản ứng PCR

- Bớc 4 kéo dài chuỗi: 720C, 1phút 30 giây- Bớc 5 hoàn thiện việc kéo dài: 720C, 10 phút- Bớc 6: 40C, lu giữ

Từ bớc 2 đến bớc 4 lặp lại 32 chu kỳ.

2.2.2 Phơng pháp điện di

Điện di trên gel agarose 0,8% dùng để phân tách axít nucleic có kích thớc lớn(từ 0,2 - 70Kb) Khi nằm trong điện trờng ADN sẽ đi từ cực âm sang cực dơng, trọng l-ợng phân tử ADN nào nhẹ nhất sẽ đi xuống trớc, nặng di chuyển chậm sẽ đi xuống sau

Hình 5 Sơ đồ thiết kế Ti-plasmid tái tổ hợp pBI121 mang gen GlyP

tạo thành một dãy ADN có kích thớc khác nhau Trong nghiên cứu này chúng tôi sửdụng gel agarose 0,8% để tách những axít nucleic có khối lợng từ 0,4 - 20Kb.

1 Chuẩn bị gel agarose 0,8%

Cân 0,8g agarose cho vào 100ml dung dịch đệm TAE 1X (Tris-base, glacialacetic acid, EDTA), đun cho agarose tan hoàn toàn, để nguội xuống khoảng 50 - 60oC,đổ dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn răng lợc Sau 30 - 60 phút, khi gel đãđông cứng, đặt vào bể điện di, đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel 1 - 2mm, gỡ lợc ra.

2 Chuẩn bị mẫu

Mẫu ADN đợc trộn với 3l đệm tra mẫu (loading buffer - 0,1ml bromophenolblue 10%; 0,3ml glycerol 100% và dẫn bằng nớc đến 1ml) và đợc tra vào các giếng nhỏtrên gel, giếng đầu tiên thờng dùng để tra thang ADN chuẩn, chạy điện di với hiệu điệnthế 100V trong thời gian 30 phút.

3 Nhuộm mẫu và soi gel

Để quan sát đợc ADN dới ánh sáng tử ngoại ngời ta phải tiến hành nhuộm mẫutrong dung dịch ethidium bromide nồng độ 0,5g/ml trong 30 - 40 phút, lắc nhẹ, sau đórửa bằng nớc cất và đem soi dới tia tử ngoại 234nm trên máy soi ADN và chụp ảnh.

2.2.3 Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR

2.2.3.1 Phơng pháp thôi gel

Sau khi nhân bản bằng kỹ thuật PCR hoặc cắt enzym giới hạn muốn có đợc đợcđoạn gen có kích thớc mong muốn, tinh sạch thì phải tiến hành thôi gel theo quy trìnhsau:

- Điện di sản phẩm PCR hoặc sản phẩm cắt enzym, mỗi một mẫu thì điện dithành hai giếng, một giếng đối chứng điện di với 5l mẫu, sau khi điện di xong chỉ cắt,nhuộm và soi gel ở giếng đối chứng, sau đó đánh dấu vào kích thớc cần tìm, ghép haimẫu gel lại và cắt lấy đoạn gel mang gen cần quan tâm ở giếng còn lại.

- Cân gel theo quy ớc 1mg gel tơng đơng 1l

- Bổ sung dung dịch QG theo tỉ lệ: V mẫu : VQG = 1 : 3 (l)

- ủ ở 50oC trong 15 phút, 3 phút trộn nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút cho gel tan hoàn toàn

- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel, ly tâm cực đại trong 1 phút- Loại bỏ dịch chảy qua cột

- Bổ sung 500l QG, ly tâm 1 phút

- Thêm 750l đệm PE vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

- Ly tâm cực đại 13000 vòng/phút, đổ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại bỏ hết đệm PE

- Chuyển sang ống eppendorf 1,5ml mới

- Hoà tan ADN trong 30 - 50l nớc cất khử trùng hoặc dung dịch EB, đã đợc làmấm đến 500C, để ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 phút, sau đó ly tâm cực đại 13000 vòng/phút trong 1 phút.

- Cho hỗn hợp dung dịch vào cột tinh sạch, ly tâm 13000 vòng/phút, , trong 1 phút

- Bổ sung 0,75ml dung dịch NW vào cột tinh sạch, ly tâm 13000 vòng/phút, trong 1phút.

- Loại bỏ dịch nổi chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút, để loại sạch NW.- Cho cột tinh sạch vào ống eppendorf 1,5ml.

- Bổ sung thể tích EB tơng đơng thể tích mẫu, để ở nhiệt độ phòng 1 - 2 phút Ly tâm13000 vòng/phút, trong 1 phút.

2.2.5 Phản ứng ghép nối

Sản phẩm PCR và vectơ pBI121 sau khi đợc xử lý bằng enzym giới hạn sẽ tạo ranhững đầu dính ở hai đầu phân tử ADN Khi ta trộn lẫn chúng với nhau dới sự xúc táccủa enzym T4 ligase, các đầu dính này sẽ ghép cặp bổ sung với nhau Vì vậy, sản phẩmPCR đã qua xử lý enzym sẽ đợc gắn vào vectơ pBI121.

* Phơng pháp tiến hành

1 Đổ đĩa thạch, mỗi một đĩa khoảng 25ml LB đặc

2 Chủng vi khuẩn E coli DH5 đợc cấy trải trên môi trờng LB đặc và nuôi qua