Thiết Kế Baculovirus Tái Tổ Hợp Mang Gen Mã Hóa Protein M1 Của Virus Cúm AH5n1 Để Tạo Chủng Sản Xuất Vaccine Thế Hệ Mới Bằng Công Nghệ Virus-Like Particle

Header Page of 126 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Nguyễn Thị Phương THIẾT KẾ BACULOVIRUS TÁI TỔ HỢP MANG GEN MÃ HÓA PROTEIN M1 CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ĐỂ TẠO CHỦNG SẢN XUẤT VACCINE THẾ HỆ MỚI BẰNG CÔNG NGHỆ VIRUSLIKE PARTICLE LUẬN VĂN THẠC SĨ Hà Nội – 2013 Footer Page of 126 Số hóa Trung tâm Học lieäu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page of 126 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Nguyễn Thị Phương THIẾT KẾ BACULOVIRUS TÁI TỔ HỢP MANG GEN MÃ HÓA PROTEIN M1 CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ĐỂ TẠO CHỦNG SẢN XUẤT VACCINE THẾ HỆ MỚI BẰNG CÔNG NGHỆ VIRUS-LIKE PARTICLE Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số : 06 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỒNG VĂN QUYỀN Hà Nội – 2013 Footer Page of 126 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page of 126 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Đồng Văn Quyền – Trưởng phịng Vi sinh vật học phân tử, Viện Cơng nghệ sinh học dìu dắt, hướng dẫn, bảo tận tình giúp đỡ tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Đồng thời, TS ln tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành cơng việc chun mơn phịng Tơi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Đinh Duy Kháng anh chị, bạn đồng nghiệp phòng Vi sinh vật học phân tử quan tâm, chia sẻ giúp đỡ suốt thời gian qua Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban Giám đốc Phịng thí nghiệm trọng điểm, Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ tạo điều kiện cho sử dụng thiết bị thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy, cô giáo tham gia cơng tác giảng dạy Phịng đào tạo sau đại học, trường Đại học Thái Nguyên – Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật giúp đỡ tơi nhiều q trình học tập Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè giúp đỡ động viên để tơi hồn thành khóa học Hà Nội, ngày 11 tháng 11 năm 2013 Học viên Nguyễn Thị Phương Footer Page of 126 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page of 126 MỤC LỤC MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .1 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Khái quát bệnh cúm gia cầm 1.1.1 Tình hình dịch bệnh giới 1.1.2 Tình hình dịch bệnh Việt Nam 1.1.3 Con đường lây nhiễm triệu chứng bệnh 1.1.4 Chẩn đốn, phịng điều trị bệnh virus H5N1 1.2 Virus cúm A/H5N1 gây bệnh gia cầm 1.2.1 Đặc điểm cấu tạo 1.2.2 Cấu trúc hệ gen .9 1.2.3 Cơ chế gây bệnh virus cúm A tế bào vật chủ 12 1.2.4 Các kháng nguyên quan trọng Virus cúm A/H5N1 14 1.3.1 Nguồn gốc, phát triển vaccine 17 1.3.2 Vaccine VLP 20 1.3.2.1 Khái quát VLP 20 3.2.2 Phương pháp tạo VLP .21 3.2.3 Đặc điểm vaccine VLP 23 3.2.4 Cơ chế tạo đáp ứng miễn dịch VLP 24 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu .27 2.2 Phương pháp 27 2.2.1 Tách chiết RNA tổng số 27 2.2.2 Phương pháp tổng hợp cDNA 28 2.2.3 Thiết kế hộp gen m1 virus cúm A/H5N1 29 2.2.4 Phương pháp gắn đoạn DNA ngoại lai vào vector 30 2.2.5 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli .30 2.2.6 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 31 Footer Page of 126 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page of 126 2.2.7 Phương pháp cắt DNA enzyme giới hạn .32 2.2.8 Tinh plasmid .32 2.2.9 Xác định trình tự gen máy giải trình tự gen tự động .32 2.2.10 Tách chiết DNA tổng số từ baculovirus tái tổ hợp 34 2.2.11 Chuẩn bị tế bào Sf9 cho trình đồng chuyền nạp 34 2.2.12 Phương pháp cấy chuyển tế bào côn trùng 35 2.2.13 Đồng chuyển nạp (co-transfection) .35 2.2.14 Kiểm tra có mặt gen m1 tế bào côn trùng Sf9 PCR .36 2.2.15 Kiểm tra biểu protein M1 Western blot 37 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Kết tách chiết RNA 38 3.2 Khuếch đại gen m1 .38 3.2.2 Tách dòng gen m1 39 3.2.3 Thiết kế vector trung gian baculovirus mang hộp gen m1 .43 3.3 Chuẩn bị tế bào côn trùng Spodoptera frugiperda (Sf9) 47 3.4 Đồng chuyển nạp tạo baculovirus tái tổ hợp mang hộp gen m1 48 3.5 Kiểm tra có mặt gen m1 virus tái tổ hợp phương pháp PCR 52 3.6 Kiểm tra biểu protein M1 tế bào Sf9 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .56 DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO .58 PHỤ LỤC 65 LỜI CAM ĐOAN 68 Footer Page of 126 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page of 126 DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ Nghĩa tiếng Việt Amp Ampicillin Ampixilin DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic APS Amonium persulphate Amonium persunphat ARN Ribonucleic Acid Axit ribonucleic bp Base pair Cặp bazơ nitơ BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết bò CPE Cytopathic effect Các tác động gây bệnh tế bào CBB Comassie Brillant Blue Comassie Brillant Blue dNTP 2’-deoxyribonucleoside 5’triphosphate 2’-deoxyribonucleozid 5’triphosphat ĐC Lane Đường chạy E.coli Escherichia coli Vi khuẩn Escherichia coli EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Acid Axit ethylen diamin tetraaxetic EtBr Ethidium Bromite Ethidium Bromit HA Hemagglutinin Hemagglutinin Kb Kilo base Kilo bazơ KDa, Da Kilo Dalton, Dalton Kilo Dalton, Dalton LB Lauria-betani medium Môi trường LB LBA Lauria broth containing ampicillin Mơi trường LB có bổ sung ampixilin mg Miligram Miligam NA Neuraminidase Neuraminidase ng Nanogram Nanogam Footer Page of 126 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page of 126 OD Optical density Mật độ quang học PBS Phosphate Buffered Saline Đệm PBS PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PVDF Polyvinylidene difluoride Polyvinylidin difluorit RNA Ribonucleic acid Axít ribonucleic RNP Ribonucleoprotein Ribonucleoprotein SDS Sodium dodecyl sulphat Natri dodexin sunphat SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphatPolyacrylamid gel Điện di gel polyacrylamit có chứa SDS electrophoresis TAE Tris - Acetate – EDTA Tris - Acetat – EDTA Taq Thermus aquaticus Vi khuẩn Thermus aquaticus TBS Tris Buffered Saline Đệm Tris TE Tris – EDTA Tris – EDTA Footer Page of 126 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page of 126 Luận văn thạc sĩ ĐẶT VẤN ĐỀ Đại dịch cúm gia cầm mối nguy hiểm đe dọa kinh tế chăn nuôi sức khỏe cộng đồng Sự xuất chủng virus cúm độc lực cao H5N1 Hồng Kông vào năm 1997 biến chủng H5N1 khác năm gần với lây lan nhanh chóng chúng Đông Nam Á, châu Phi, Trung Đông châu Âu cảnh báo mối đe dạo đại dịch cúm toàn cầu [30] Điều đặc biệt nguy hiểm chủng virus cúm gia cầm biến đổi, dẫn đến tăng khả lây nhiễm sang người độc lực virus Để ngăn chặn lan truyền virus cúm thiệt hại virus cúm gây ra, biện pháp hiệu tiêm chủng vaccine [28] [10] Theo thông báo Tổ chúc Y tế giới (WHO), đại dịch cúm xảy ra, số người mắc tồn cầu lên tới tỷ Tuy nhiên, công nghệ sản xuất vaccine nuôi cấy virus trứng gà có phơi tạo khoảng 300 triệu liều/năm, đủ cung cấp cho tồn giới Chính vậy, việc phát triển cơng nghệ để nhanh chóng tạo vaccine an toàn, hiệu cao quan tâm Công nghệ tạo hạt giả virus (virus-like particle, VLP) xem công nghệ hứa hẹn bổ sung/thay công nghệ truyền thống để tạo vaccine hệ với hiệu lực cao hơn, an toàn [2], [13] VLP hay hạt giả virus tạo protein cấu trúc virus Các protein đồng biểu hệ thống tái tổ hợp tế bào nấm men, tế bào động vật, tế bào thực vật tế bào côn trùng…sẽ tự động lắp ghép lại với để hình thành lên hạt có cấu trúc giống với cấu trúc tự nhiên virus Vaccine VLP có độ an tồn cao khơng chứa vật liệu di truyền DNA/RNA nên khơng có khả lây nhiễm, nhiên lại tạo đáp ứng miễn dịch mạnh [5] Một ưu điểm quan trọng vaccine VLP Nguyễn Thị Phương – K15 Footer Page of 126 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page of 126 Luận văn thạc sĩ thời gian sản xuất nhanh so với cơng nghệ sản xuất vaccine truyền thống, đáp ứng kịp thời nhu cầu vaccine có đại dịch [6] Matrix protein M1 protein quan trọng virus cúm A/H5N1 có chức bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP (ribonucleoprotein) tham gia vào trình “nảy chồi” virus [4], [41] Protein M1 với HA (Hemagglutimin) NA kháng nguyên quan trọng định tính sinh miễn dịch virus cấu phần quan trọng để tạo VLP virus cúm A/H5N1 [17] Với mục tiêu nghiên cứu phát triển vaccine VLP cúm A/H5N1 công nghệ VLP, thực đề tài “Thiết kế baculovirus tái tổ hợp mang gen mã hóa protein M1 virus cúm A/H5N1 để tạo chủng sản xuất vaccine hệ công nghệ Virus-like Particle” Đề tài thực với hỗ trợ kinh phí đề tài cấp Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam “Nghiên cứu tạo chủng Baculovirus tái tổ hợp mang gen kháng nguyên virus cúm phục vụ mục tiêu sản xuất chế phẩm miễn dịch hệ mới” Đề tài thực phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam Nguyễn Thị Phương – K15 Footer Page of 126 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page 10 of 126 Luận văn thạc sĩ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát bệnh cúm gia cầm Cúm gia cầm (Avian Influenza, AI) bệnh truyền nhiễm cấp tính gia cầm nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây [25] Họ Orthomyxoviridae phát bao gồm nhóm virus là: nhóm virus cúm A (Influenza A); nhóm virus cúm B (Influenza B); nhóm virus cúm C (Influenza C) nhóm Thogotovirus Các nhóm virus khác kháng nguyên bề mặt capsid, virus cúm A B Hemagglutinin (HA), virus cúm C Hemagglutinin Esterase Fusion (HEF), Thogotovirus Glycoprotein (GP) Nhóm virus cúm A (Influenza A) có biên độ vật chủ rộng chia thành nhiều phân type khác dựa kháng nguyên HA NA có bề mặt capsid hạt virus [7], gồm có 16 phân type HA (từ H1 đến H6) phân type NA (từ N1 đến N9) Sự tái tổ hợp phân type HA NA tạo nhiều phân type khác độc tính khả gây bệnh Chủng virus cúm H5N1 có độc lực cao (HPAI) chủng có khả lây nhiễm tỷ lệ gây tử vong cao 50% số gia cầm bị nhiễm [10] 1.1.1 Tình hình dịch bệnh giới Chủng virus cúm A/H5N1 cổ điển phát lần gây bệnh dịch gà Scotland vào năm 1959 Từ nay, tiểu phần H5 N1 có thay đổi lớn xét cấu trúc thành phần gen kháng nguyên miễn dịch [14] Sau gần 40 năm không phát hiện, cúm A/H5N1 xuất Quảng Đông (1996) Hồng Kông (1997) với biến đổi di truyền khơng gây chết gia cầm mà cịn thích ứng gây chết người Đặc biệt, từ 2003 đến nay, chủng virus H5N1 cấu trúc trước đó, xét độc lực (tính gây bệnh), lồi vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên miễn dịch mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng khác với nhiều Footer Page 10 ofNguyễn 126 Thị Phương – K15 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page 61 of 126 54 kDa 116.2 Luận văn thạc sĩ 66.2 45.0 35.0 28 kDa 25.0 18.4 14.4 Hình 3.11 Kiểm tra biểu protein M1 tế bào côn trùng SDS-PAGE DC1: marker protein (fermentas); DC2: mẫu đối chứng âm (không lây nhiễm virus); DC3: mẫu protein thu sau 24 lây nhiễm; DC4: mẫu protein thu sau 48 lây nhiễm; DC5: mẫu protein thu sau 72 lây nhiễm; DC6: mẫu protein thu sau 96 lây nhiễm Để khẳng định chắn protein biểu protein kháng nguyên M1 virus cúm H5N1 tiến hành làm phản ứng Western blot với kháng thể sử dụng kháng thể kháng protein M1 cung cấp viện thú y kiểm dịch Hàn Quốc Kết Western blot cho thấy băng protein tái tổ hợp thu nhận 72 96 sau lây nhiễm virus p1 phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng protein M1 (hình 3.12) Footer Page 61 ofNguyễn 126 Thị Phương – K15 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page 62 of 126 55 Luận văn thạc sĩ kDa 70 55 40 35 28 kDa 25 15 Hình 3.12 Kiểm tra phản ứng miễn dịch protein tái tổ hợp M1 western blot DC1: marker màu protein (fermentas); DC2: mẫu protein đối chứng âm (không lây nhiễm virus p1); DC3: mẫu protein thu sau 24h lây nhiễm; DC4: mẫu protein thu sau 48h lây nhiễm; DC5: mẫu protein thu sau 72h lây nhiễm; DC6: mẫu protein thu sau 96h lây nhiễm Từ kết biểu thử nghiệm protein M1 tái tổ hợp kết western blot chúng tơi khẳng định chắn protein tái tổ hợp biểu từ chủng baculovirus tái tổ hợp protein M1 virus cúm A/H5N1 hay nói cách khác thiết kế thành công baculovirus tái tổ hợp mang gen m1 virus cúm A/H5N1 Virus tái tổ hợp sử dụng cho nghiên cứu nhằm mục đích tạo vaccine VLP virus cúm A/H5N1 Footer Page 62 ofNguyễn 126 Thị Phương – K15 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page 63 of 126 56 Luận văn thạc sĩ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết thu cơng trình nghiên cứu này, đưa kết luận sau:  Thiết kế thành công hộp gen m1 virus cúm A/H5N1 mang thành phần thiết yếu cho việc biểu gen tế bào trùng Sf9 trình tự Kozak, mã khởi đầu, mã kết thúc  Thiết kế thành công vector trung gian baculovirus mang hộp gen m1 virus cúm A/H5N1  Tạo baculovirus tái tổ hợp mang gen m1 virus cúm A/H5N1  Biểu protein M1 tái tổ hợp tế bào côn trùng Sf9 KIẾN NGHỊ Tiếp tục thực nghiên cứu để tạo vaccine VLP virus cúm A/H5N1 Footer Page 63 ofNguyễn 126 Thị Phương – K15 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page 64 of 126 57 Luận văn thạc sĩ DANH SÁCH CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN Lê Phương Hằng, Nguyễn Thị Phương, Đông Văn Quyền (2012) Thiết kế vector trung gian Baculovirus mang hộp gen Hemagglutinin (HA) để tạo virus-like particle virus cúm A/H5N1 sản xuất Vaccine Tạp chí cơng nghệ sinh học 10 (1), 59-64 Nguyễn Thị Phương, Đặng Thị Thùy Dương, Đồng Văn Quyền (2012) Thiết kế Baculovirus tái tổ hợp mang gen mã hóa protein M1 virus cúm A/H5N1 để tạo chủng sản xuất vaccine hệ công nghệ virus- like particle Tạp chí Khoa học cơng nghệ 50 (3E) 12141220 Footer Page 64 ofNguyễn 126 Thị Phương – K15 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page 65 of 126 58 Luận văn thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO Alexander DJ (2007) An overview of the epidemiology of avian influenza Vaccine 25(30): 5637-44 Arnon R, Ben-Yedidia T (2009) Preclinical efficacy of a virus-like particle-based vaccine against avian influenza H5N1 Future Microbiol 4:503-5 Baigent SJ, McCauley JW (2001) Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture Virus Res 79(1-2): 177-185 Basler CF (2007) Influenza viruses: basic biology and potential drug targets Infect Disord Drug Targets 7(4): 282-93 Bright RA, Carter DM, Daniluk S, Toapanta FR, Atmad A (2007) Influenza virus-like particles elicit broader immuno responses than whole virion inactivated influenza virus or recombinant hemagglutinin Vaccine 25: 3871-3878 Chackerian B (2007) Virus-like particles: flexible platforms for vaccine development Expert Rev Vaccines (3): 381-390 De Wit E, Fouchier RA (2008) Emerging influenza J Clin Virol 41(1): 1-6 Doherty PC, Turner SJ, Webby RG, Thomas PG (2006) Influenza and the challenge for immunology Nat Immunol 7(5): 449-55 FAO ( Food and agriculture Organization of the United Nation) (2011), “ H5N1 HPAI global overviw”, Empres/FAO – GLE 10 Fedson DS (2005) Preparing for pandemic vaccination: an international policy agenda for vaccine development J Public Health Policy 26: 4-29 Footer Page 65 ofNguyễn 126 Thị Phương – K15 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page 66 of 126 59 Luận văn thạc sĩ 11 Galarza JM, Latham T, Cupo A (2005) Virus-like particle (VLP) vaccine conferred complete protection against a lethal influenza virus challenge Viral Immunol 18: 244-251 12 Gambotto A, Barratt-Boyes SM, de Jong MD, Neumann G, Kawaoka Y (2008)Human infection with highly pathogenic H5N1 influenza virus Lancet 371(9622): 1464-1475 13 Grgacic EV, Anderson DA (2006) Virus-like particles: passport to immune recognition Methods 40:60-5 14 Horimoto T, Kawaoka Y (2006) Strategies for developing vaccines against H5N1 influenza A viruses Trends Mol Med 12:506-514 15 Invitrogen (2010), “ Bac-to-Bac baculovirus expression system an efficient site-specific transposition system to generate baculovirus for high- level expression of recombinant protein”, Catalog nos, 10359-016 16 Joel R Haynes , Leslie Dokken , James A Wiley , Andrew G Cawthon , John Bigger , Allen G Harmsen , Charles Richardson (2009) Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge Vaccines 27: 530-541 17 Kang SM, Pushko P, Bright RA, Smith G, Compans RW (2009) Influenza virus-like particles as pandemic vaccines Microbiol Immunol 333:269-89 18 Keawcharoen J, Amonsin A, Oraveerakul K, Wattanodorn S, Papravasit T, Karnda S, Lekakul K, Pattanarangsan R, Noppornpanth S, Fouchier RA, Osterhaus AD, Payungporn S, Theamboonlers A and Poovorawan Y (2005) Characterization of the hemagglutinin and Footer Page 66 ofNguyễn 126 Thị Phương – K15 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page 67 of 126 60 Luận văn thạc sĩ neuraminidase genes of recent influenza virus isolates from different avian species in Thailand Acta Virol 49(4): 277-280 19 Kong Q, Richter L, Yang YF, Arntzen CJ, Mason HS, Thanavala Y Oral immunization with hepatitis B surface antigen expressed in transgenic plants Proc Natl Acad Sci USA 2001;98:11539–11544 20 Korteweg C, Gu J (2008) Pathology, molecular biology, and pathogenesis of avian influenza A (H5N1) infection in humans Am J Pathol 172(5): 1155-1170 21 Kozak M (1987) An analysis of 5’-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs Nucleic Acids Res 15:8125–8148 22 Kratz PA, Böttcher B, Nassal M (1999) Native display of complete foreign protein domains on the surface of hepatitis B virus capsids Proc Natl Acad Sci USA 96: 1915-1920 23 Li Q, Cao C, Chackerian B, Schiller J, Gordon M, Ugen KE, Morgan D (2004) Overcoming antigen masking of anti-amyloidbeta antibodies reveals breaking of B cell tolerance by virus-like particles in amyloidbeta immunized amyloid precursor protein transgenic mice BMC Neurosci 5: 21 24 Maurer P, Jennings GT, Willers J, Rohner F, Lindman Y, Roubicek K, Renner WA, Müller P, Bachmann MF (2005) A therapeutic vaccine for nicotine dependence: preclinical efficacy, and Phase I safety and immunogenicity Eur j Immunol 35: 2031-2040 25 Murphy BR, Webster RG (1996) Orthomyxoviruses Fields Virology, pp 1397–445 26 Nayak D, Hui E, Barman S (2004) Assembly and budding of influenza virus Virus Res 106(2): 147-165 Footer Page 67 ofNguyễn 126 Thị Phương – K15 Soá hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page 68 of 126 61 Luận văn thạc sĩ 27 Neirynck S, Deroo T, Saelens X, Vanlandschoot P, Jou WM, Fiers W (1999) A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein Nat Med (10): 1157-1163 28 New N, He Q, Damrongwatanapolin S, Du Q, Manopo I, Limlamthong Y, Fenner BJ, Spencer L, Kwang J (2006) Expression 29 of hemagglutinin protein from the avian influenza virus H5N1 in a baculovirus/insect cell system significant enhanced by suspension culture BMC Microbiol 24: 6-16 30 Nicholson KG (2009) Influenza and vaccine development: a continued battle Expert Rev Vaccines 8: 373-374 31 Pandey A, Singh N, Sambhara S, Mittal SK (2010) Egg-independent vaccine strategies for highly pathogenic H5N1 influenza viruses Hum Vaccin 24;6(2) 32 Pattenden LK, Middelberg APJ, Niebert M, Lipin DI (2005) Toward the Preparative and Large Scale Precision Manufacture of Virus-Like Particles Trends Biotechnol 23: 523-529 33 Peabody DS (2003) A viral platform for chemical modification and multivalent display J Nanobiotechnology 1: 34 Peabody DS (2003) A viral platform for chemical modification and multivalent display J Nanobiotechnology 1: 35 Pushko P, Tumpey TM, Bu F, Knell J, Robinson R, Smith G (2005) Influenza virus-like particles comprised of the HA, NA, and M1 proteins of H9N2 influenza virus induce protective immune responses in BALB/c mice, Vaccine 23(50):5751-9 36 Rabadan R, Levine AJ, Robins H (2006) Comparison of avian and human influenza A viruses reveals a mutational bias on the viral genomes J Virol 80(23): 11887-11891 Footer Page 68 ofNguyễn 126 Thị Phương – K15 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page 69 of 126 62 Luận văn thạc sĩ 37 Raja KS, Wang Q, Gonzalez MJ, Manchester M, Johnson JE, Finn MG (2003) Hybrid virus-polymer materials Synthesis and properties of PEG-decorated cowpea mosaic virus Biomacromolecules 4: 472-476 38 Röhn TA, Jennings GT, Hernandez M, Grest P, Beck M, Zou Y, Kopf M, Bachmann MF (2006) Vaccination against IL-17 suppresses autoimmune arthritis and encephalomyelitis Eur J Immunol 36(11): 2857-2867 39 Salzberg SL (2007) Genome Analysis Linking Recent European and African Influenza (H5N1) Viruses Emerg Infect Dis 13(5): 713-718 40 Silas L, Johnson N, Rexe K (2007) Safety is not negotiable: the importance of occupational health and safety to pandemic planning Healthc Pap 8(1): 8-16 41 Smith GJ, Naipospos TS, Nguyen TD, de Jong MD, Vijaykrishna D, Usman TB (2006) Evolution and adaptation of H5N1 influenza virus in avian and human hots Indonesia and Vietnam Virology 350: 68258 42 Song JM, Hossain J, Yoo DG, Lipatov AS, Davis CT, Quan FS, Chen LM, Hogan RJ, Donis RO, Compans RW, Kang SM (2010) Protective immunity against H5N1 influenza virus by a single dose vaccination with virus-like particles Virology 405:165-75 43 Suarez DL, Schultz-Cherry S (2000) Immunology of avian influenza virus: a review Dev Comp Immunol 24(2-3): 269-283 44 Tacket CO, Mason HS, Losonsky G, Clements JD, Levine MM, Arntzen CJ (1998) Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial antigen delivered in a transgenic potato Nat Med 4: 607– 609 Footer Page 69 ofNguyễn 126 Thị Phương – K15 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page 70 of 126 63 Luận văn thạc sĩ 45 Vey M, Orlich M, Adler S, Klenk HD, Rott R and Garten W (1992) Hemagglutinin activation of pathogenic avina influenza viruses of serotype H7 requires the protease recognition motif R-X-K/R-R Virology 188: 408-413 46 Wagner R, Matrosovich M, Klenk H (2002) Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections Med Virol 12(3): 159-166 47 Wang Q, Lin T, Johnson JE, Finn MG (2002) Natural supramolecular building blocks Cysteine-added mutants of cowpea mosaic virus Chem Biol 9: 813-819 48 Wasilenko JL, Lee CW, Sarmento L, Spackman E, Kapczynski DR, Suarez DL, Pantin-Jackwood MJ (2008) NP, PB1, and PB2 viral genes contribute to altered replication of H5N1 avian influenza viruses in chickens J Virol 82(9): 4544-4553 49 Weber TP, Stilianakis NI (2007) Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds Emerg Infect Dis 13(8): 11391143 50 Webster RG (1998) Influenza: an emerging disease Emerg Infect Dis 4: 436-441 51 Webster RG, Guan Y, Peiris M, Walker D, Krauss S, Zhou NN, Govorkova EA, Ellis TM, Dyrting KC, Sit T, Perez DR, Shortridge Willis, N J (1997), "Edward Jenner and the eradication of smallpox.", Scottish medical journal 42 (4): 118-21 52 Zhao ZM, Shortridge KF, Garcia M, Guan Y, Wan XF (2008) Genotypic diversity of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses J Gen Virol 89(9): 2182-2193 Footer Page 70 ofNguyễn 126 Thị Phương – K15 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page 71 of 126 64 Luận văn thạc sĩ 53 Zhou JJ, Fu J, Fang DY, Yan HJ, Tian J, Zhou JM, Tao JP, Liang Y, Jiang LF (2007) Molecular characterization of the surface glycoprotein genes of an H5N1 influenza virus isolated from a human in Guangdong, China Arch Virol 152(8): 1515-1521 54 http://www.cucthuy.gov.vn/Pages/news_detail.aspx?NewsId=209 55 http://www.who.int/topics/vaccines/en/ 56 http://virology-online.com/general/vaccines.htm Footer Page 71 ofNguyễn 126 Thị Phương – K15 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page 72 of 126 65 Luận văn thạc sĩ PHỤ LỤC Influenza A virus (A/Hatay/2004/(H5N1)) M1 gene for Matrix protein 1, genomic RNA Sequence ID: emb|AM040045.1|Length: 774Number of Matches: Range 1: to 763GenBankGraphics Next Match Previous Match Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 1391 bits(753) 0.0 755/756(99%) 0/756(0%) Plus/Plus Query ATGGGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTC 60 Sbjct ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTC 67 Query 61 AAAGCCGAGATCGCGCAGAAACTTGAAGATGTCTTTGCAGGAAAGAACACCGATCTCGAG 120 ||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 68 AAAGCCGAGATCGCGCAGAAACTTGAAGATGTCTTTGCAGGAAAGAACACCGATCTCGAG 127 Query 121 GCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAAGGGATTTTG 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 128 GCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAAGGGATTTTG 187 Query 181 GGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTC 240 Sbjct 188 GGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTC 247 Query 241 CAGAACGCCCTAAATGGAAATGGAGATCCAAATAATATGGATAGGGCAGTTAAGCTATAT 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 248 CAGAACGCCCTAAATGGAAATGGAGATCCAAATAATATGGATAGGGCAGTTAAGCTATAT 307 Query 301 AAGAAGCTGAAAAGAGAAATAACATTCCATGGGGCTAAGGAGGTCGCACTCAGCTACTCA 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 308 AAGAAGCTGAAAAGAGAAATAACATTCCATGGGGCTAAGGAGGTCGCACTCAGCTACTCA 367 Query 361 ACCGGTGCACTTGCCAGTTGCATGGGTCTCATATACAACAGGATGGGAACGGTGACTACG 420 Sbjct 368 ACCGGTGCACTTGCCAGTTGCATGGGTCTCATATACAACAGGATGGGAACGGTGACTACG 427 Query 421 GAAGTGGCTTTTGGCCTAGTGTGTGCCACTTGTGAGCAGATTGCAGATTCACAGCATCGG 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 428 GAAGTGGCTTTTGGCCTAGTGTGTGCCACTTGTGAGCAGATTGCAGATTCACAGCATCGG Footer Page 72 ofNguyễn 126 Thị Phương – K15 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 487 Header Page 73 of 126 Query 66 481 Luận văn thạc sĩ TCTCACAGACAGATGGCAACTATCACCAACCCACTAATCAGACATGAGAACAGAATGGTG 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 488 TCTCACAGACAGATGGCAACTATCACCAACCCACTAATCAGACATGAGAACAGAATGGTG 547 Query 541 CTGGCCAGCACTACAGCTAAGGCCATGGAGCAGATGGCGGGATCAAGTGAGCAGGCAGCG 600 Sbjct 548 CTGGCCAGCACTACAGCTAAGGCCATGGAGCAGATGGCGGGATCAAGTGAGCAGGCAGCG 607 Query 601 GAAGCCATGGAGATTGCTAATCAGGCTAGGCAGATGGTGCAGGCAATGAGGACAATTGGG 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 608 GAAGCCATGGAGATTGCTAATCAGGCTAGGCAGATGGTGCAGGCAATGAGGACAATTGGG 667 Query 661 ACTCATCCTAACTCTAGTGCTGGTCTGAGAGATAATCTTCTTGAAAATTTGCAGGCCTAC 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 668 ACTCATCCTAACTCTAGTGCTGGTCTGAGAGATAATCTTCTTGAAAATTTGCAGGCCTAC Query 721 CAGAAACGAATGGGAGTGCAGATGCAGCGATTCAAG Sbjct 728 756 |||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGAAACGAATGGGAGTGCAGATGCAGCGATTCAAG Footer Page 73 ofNguyễn 126 Thị Phương – K15 Số hóa Trung tâm Học liệu 763 http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 727 Header Page 74 of 126 67 Footer Page 74 ofNguyễn 126 Thị Phương – K15 Số hóa Trung tâm Học liệu Luận văn thạc sĩ http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Header Page 75 of 126 68 Luận văn thạc sĩ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với đồng khác Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Tác giả Nguyễn Thị Phương Footer Page 75 ofNguyễn 126 Thị Phương – K15 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ... Phương THIẾT KẾ BACULOVIRUS TÁI TỔ HỢP MANG GEN MÃ HÓA PROTEIN M1 CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ĐỂ TẠO CHỦNG SẢN XUẤT VACCINE THẾ HỆ MỚI BẰNG CÔNG NGHỆ VIRUS- LIKE PARTICLE Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số... acid suy diễn protein M1 3.2.3 Thiết kế vector trung gian baculovirus mang hộp gen m1 Để tạo baculovirus tái tổ hợp biểu protein M1, gen m1 cần thiết kế vào vector trung gian baculovirus Vector... cơng nghệ để nhanh chóng tạo vaccine an toàn, hiệu cao quan tâm Công nghệ tạo hạt giả virus (virus- like particle, VLP) xem công nghệ hứa hẹn bổ sung/thay công nghệ truyền thống để tạo vaccine hệ