PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE (FRUCTOFURANOSIDASE) NHẰM TĂNG TRỮ LƢỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - LƢU THỊ CƢ LƢU THỊ CƢ PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE (-FRUCTOFURANOSIDASE) MÃ HÓA ENZYME INVERTASE (-FRUCTOFURANOSIDASE) NHẰM TĂNG TRỮ LƢỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA NHẰM TĂNG TRỮ LƢỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ QUỲNH LIÊN Thái Nguyên – 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Thái Nguyên – 2009 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa có công bố công trình khác Lời xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quỳnh Liên, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, ngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn, bảo, dìu dắt giúp đỡ suốt thời gian thực hoàn thành Tác giả luận văn Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Lê Trần Bình, TS Chu Hoàng Hà, KS Đỗ Tiến Phát Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Lưu Thị Cư Công nghệ Sinh học, ngƣời tận tình bảo, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu giúp đỡ suốt thời gian thực tập hoàn thành luận văn Trong thời gian thực tập nghiên cứu nhận đƣợc hỗ trợ nhiệt tình ý kiến đóng góp bổ ích cô chú, anh chị, bạn Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo khoa SinhKTNN khoa Sau đại học, trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức cho suốt trình học tập nghiên cứu Tôi vô cảm ơn tình cảm tốt đẹp ngƣời thân gia đình, đồng nghiệp bạn bè dành cho tôi, động viên tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập, nghiên cứu Thái Nguyên, ngày 25 tháng 09 năm 2009 Học viên Lưu Thị Cư Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 2.2.6 Tái sinh mía thông qua mô sẹo 21 MỤC LỤC Trang 2.2.7 Thử nghiệm chuyển gen gus-intron vào mía 22 MỞ ĐẦU NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 1.1 VAI TRÒ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY MÍA 3.1 THIẾT KẾ MỒI 24 1.1.1 Sơ lƣợc mía 3.2 TÁCH RNA TỔNG SỐ 25 1.1.2 Tình hình sản xuất mía Việt Nam 3.3 NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE 27 1.2 SINH TỔNG HỢP SUCROSE 3.4 TÁCH DÒNG GEN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN 28 1.3 VẬN CHUYỂN SUCROSE TRONG TẾ BÀO 3.4.1 Tạo plasmid tái tổ hợp INV-pENTR 28 1.5 ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP RNAi (RNA 3.4.2 Biến nạp plasmid tái tổ hợp INV_pENTR vào tế bào khả biến INTERFERENCE) 10 E.coli TOP 10 28 1.5.1 Nguồn gốc RNAi 10 3.4.3 Chọn lọc plasmide tái tổ hợp INV_pENTR PCR 29 1.5.2 Cơ chế gây bất hoạt gen 10 3.4.4 Kết xác định trình tự nucleotit 31 ® 1.6 KỸ THUẬT GATEWAY 12 3.5 THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP INV-RNAi 31 1.7 NGHIÊN CỨU VỀ TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN Ở CÂY MÍA 14 3.5.1 Tạo vector tái tổ hợp INV_RNAi kỹ thuật Gateway 31 Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.5.2 Biến nạp vector INV_RNAi vào tế bào khả biến E.coli 32 2.1 NGUYÊN LIỆU 16 3.6 BIẾN NẠP VECTOR CHUYỂN GEN INV_RNAi VÀO CHỦNG 2.1.1 Nguyên liệu thực vật 16 VI KHUẨN A.TUMEFACIENS CV58C1 34 2.1.2 Các chủng plasmid enzyme 16 3.7 TÁI SINH VÀ BƢỚC ĐẦU BIỂU HIỆN GEN GUS Ở MÍA 35 2.1.3 Hóa chất khác 16 3.7.1 Quy trình tái sinh mía thông qua mô sẹo 35 2.1.3 Các thiết bị máy móc 17 3.7.3 Chọn lọc mô sẹo tái sinh chuyển gen 37 2.2 PHƢƠNG PHÁP 17 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 2.2.1 Thiết kế mồi 17 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 2.2.2 Tách RNA tổng số 18 2.2.3 RT-PCR 18 2.2.4 Tách dòng xác định trình tự gen 19 2.2.5 Thiết kế vector tái tổ hợp INV-RNAi 20 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG AS Acetosyringone A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzyl Amino Purine (Benzyladeninpurin) Bảng 2.1 Các plasmid sử dụng thí nghiệm 16 bp Cặp base Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR bƣớc 18 cDNA Complementary DNA = DNA bổ sung đƣợc tổng hợp Bảng 2.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 19 khuôn mRNA Bảng 2.4 Các môi trƣờng tái sinh mía 21 cs Cộng Bảng 3.1 Trình tự thông số cần thiết cặp mồi 3’INV DEPC Diethyl pyrocarbonat DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP deoxynucleosit triphotphat (deoxynucleoside triphosphate) EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtBr đEtBrEthiium bromide E.coli Escherichia coli gus β-glucuronidase IBA Indole-3-Butyric Acid kb kilo base LB Luria and Bertani MS Môi trƣờng nuôi cấy theo Murashige Skoog NAA Naphthalene Acetic Acid OD Giá trị mật độ quang (optical density) PCR Polymerase Chaine Reaction = Phản ứng chuỗi Polymerase RNA Ribonucleic Acid RNase Ribonuclease RT-PCR Reverse Transcriptase-PCR SDS Sodium dodecylsulfat TAE Tris-acetate-EDTA Taq Thermus aquaticus DNA (polymerase) 2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Tên bảng Trang 5’INV 25 Bảng 3.2 Mã số trình tự đoạn gen Invertase mía ngân hàng gen NCBI 25 Bảng 3.3 Khả tạo mô sẹo tái sinh giống mía ROC10 in vitro môi trƣờng thử nghiệm M1 - M4 36 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU Trang Tên hình Hình 1.1: Chu trình sinh tổng hợp sucrose với tham gia Đƣờng nhu cầu cần thiết đời sống ngƣời Theo thống kê, nhu cầu tiêu thụ đƣờng giới trung bình tính theo đầu ngƣời 35 enzyme kg/1 ngƣời/1 năm Tại Việt Nam, năm 1994 kg/1 ngƣời/1 năm, Hình 1.2 Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi 11 15 kg/1 ngƣời/1 năm dự kiến nhu cầu đƣờng tiếp tục tăng Hình 1.3 Sơ đồ mô tả kỹ thuật Gateway 13 Tại nƣớc nhiệt đới cận nhiệt đới nhƣ Việt Nam, 75% sản lƣợng Hình 3.1 Kết điện di RNA tổng số tách từ bẹ thân non đƣờng đƣợc sản xuất từ mía Mía số loài thực vật tích trữ giống mía ROC1 ROC10 gel agarose 1% 26 chủ yếu đƣờng sucrose (α-D-glucopyranosyl-1, 2-D-fructofuranose), nguồn Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm RT-PCR gel agarose 0,8% 27 nguyên liệu ban đầu để sản xuất đƣờng Do đó, Việt Nam mía trở thành Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR plasmid với cặp mồi M13 công nghiệp trọng yếu xóa đói giảm nghèo phủ (For/Rev) nhằm kiểm tra có mặt đoạn Invertase Tuy nhiên, giống mía Việt Nam có suất đƣờng đạt mức vector pENTR/D 30 trung bình giới Việc nhập giống mía cao sản giới kết Hình 3.4 Kết so sánh trình tự đoạn gen Invertase phân lập đƣợc hợp với phƣơng pháp lai tạo truyền thống chƣa thực có hiệu với trình tự Invertase ngân hàng gen có mã số việc tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao lại phù hợp với điều kiện thổ AY302083 31 nhƣỡng khí hậu nƣớc ta Chọn tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao Hình 3.5 Mô hình cấu trúc chuyển gen INV_RNAi 32 công nghệ sinh học có tiềm giảm giá thành đƣờng mà không cần Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid INV_RNAi tổ hợp với tăng diện tích trồng mía thúc đẩy phát triển công nghiệp mía HindIII XbaI 34 Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR plasmid INV-RNAi A.tumefaciens với cặp mồi đặc hiệu 5’INV 3’INV 35 Hình 3.8 Quy trình tái sinh mía ROC10 in vitro từ mô sẹo 37 Hình 3.9 Biến nạp gen gus-intron vào mía ROC10 in vitro thông qua trung gian A.tumefaciens 39 đƣờng Việt Nam Sinh tổng hợp sucrose trình phức hợp, enzyme Invertase đƣợc xem nhƣ chìa khóa điều chỉnh tích lũy lƣợng sucrose mía Nó có vai trò phân hủy sucrose tế bào Vì vậy, muốn tăng trữ lƣợng sucrose mía phải ức chế đƣợc biểu gen mã hóa Invertase Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi (RNA-interference) trở thành biện pháp công nghệ hữu hiệu ức chế hoàn toàn biểu gen động vật, thực vật vi sinh vật [31] Ở thực vật, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn http://www.Lrc-tnu.edu.vn RNAi đƣợc thực cách chuyển gen có cấu trúc biểu Chƣơng phiên mã cao RNA sense, anti-sense RNA kẹp tóc bổ sung mà TỔNG QUAN TÀI LIỆU chứa trình tự tƣơng đồng với gen đích Với mục tiêu nghiên cứu chọn tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao, chọn đề tài “Phân lập thiết kế vector ức chế biểu gen mã hóa enzyme Invertase (β-fructofuranosidase) nhằm tăng trữ lượng sucrose 1.1 VAI TRÕ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY MÍA 1.1.1 Sơ lƣợc mía Mía (Saccharum L.) thuộc chi mía (Saccharum), họ hòa thảo mía” (Poaceae), lúa (Poales), lớp mầm (Monocotyledoneae) Chúng MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU: có thân to, mập, chia đốt cao từ - m Các loại thực vật chi Ức chế biểu Invertase dạng hòa tan nhằm tăng trữ lƣợng đa số loại cỏ sống lâu năm bao gồm khoảng - 37 loài tùy theo hệ sucrose mía thống phân loại, sống chủ yếu khu vực nhiệt đới ôn đới giới [2] NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: Cây mía chứa hàm lƣợng đƣờng cao chiếm khoảng 46% khối lƣợng khô, Phân lập đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase mía in vitro sucrose chiếm tới 80% Chính thế, mía trở thành công nghiệp quan trọng ngành công nghiệp sản xuất đƣờng Ngoài ra, ROC1 Thiết kế đƣợc vector ức chế biểu gen mã hóa Invertase (βfructofuranosidase) mía mía chứa chất đạm (protein), chất bột (carbohydrate), chất béo (lipid), chất khoáng vitamin… mía có tác dụng nhiệt, giải khát, trợ giúp tiêu hóa, cung cấp lƣợng chất dinh Nghiên cứu hệ thống tái sinh mía phục vụ cho mục đích chuyển gen dƣỡng cần thiết cho thể Theo Đông y, mía "vị thuốc" dùng để chữa số bệnh nhƣ ho khan, đại tiện táo, tiểu tiện bất lợi, đau dày, an thai… Mía loại có tác dụng bảo vệ đất tốt, đặc biệt chống xói mòn đất cho vùng đồi trung du Hơn nữa, mía rễ chùm phát triển mạnh tầng đất từ - 60 cm (1 mía tốt cho 13 - 15 rễ sau thu hoạch), nguồn chất hữu quý làm tăng độ phì đất Phần bã mía chứa nhiều cellulose dùng làm nguyên liệu đốt lò, làm bột giấy, bìa tông, ép thành ván dùng kiến trúc Sản phẩm cặn bã lại sau chế biến đƣờng (bùn lọc) sử dụng để sản xuất nhựa, xêrin, làm sơn, xi đánh giầy phế phẩm lại dùng làm phân bón tốt Trong tƣơng lai bã mía nguồn nguyên liệu làm bột giấy, làm sợi thay Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn loại rừng bị giảm Khi mà nguồn nhiên liệu lỏng ngày cạn kiệt TTg Phó thủ tƣớng Nguyễn Sinh Hùng “Quy hoạch phát triển mía đƣờng nhƣ nay, số nƣớc phát triển giới nhƣ Mỹ, Brazil, Ấn Độ… đến năm 2010 định hƣớng đến năm 2020” đƣợc phê duyệt đƣa quan bắt đầu sử dụng nhiên liệu sinh học từ mía để bổ sung thay Nhƣ điểm rõ ràng là: đồng thời với việc nhập giống mía có suất, trữ vậy, mía có vai trò quan trọng đời sống kinh tế ngƣời đƣờng cao đƣợc đánh giá tốt phù hợp với Việt Nam phải xây dựng hệ 1.1.2 Tình hình sản xuất mía Việt Nam thống viện nghiên cứu trung tâm giống mía đủ điều kiện trang thiết bị Hiện có khoảng 200 quốc gia vùng lãnh thổ giới trồng sản xuất mía đƣờng, sản lƣợng trung bình đạt khoảng 13.246 triệu (gấp lần so với củ cải đƣờng) Ở Việt Nam, mía trồng chủ đạo ngành lực cán để chủ động sản xuất giống tốt, có suất, trữ lƣợng đƣờng cao Việt Nam, đáp ứng yêu cầu sản xuất [1] 1.2 SINH TỔNG HỢP SUCROSE công nghiệp đƣờng nƣớc Dự kiến niên vụ 2009-2010 diện tích mía Trong lục lạp mía có enzyme photphoenolpyruvat-cacboxilase hoạt nguyên liệu nƣớc vào khoảng 290.000 ha, tăng 19.400 so với vụ động mạnh Sản phẩm quang hợp mía axit trƣớc, diện tích vùng mía nguyên liệu tập trung nhà máy oxaloaxetic, malic, aspartic gồm có bốn nguyên tử cacbon phân tử, 221.816 với suất mía bình quân đạt 55 tấn/ha sản lƣợng đạt 16 mía đƣợc gọi thực vật C4 [5] Chu trình C4 (hay chế Hatch-Slack) triệu Cây mía góp phần xóa đói giảm nghèo vùng trung du, miền núi chế có chuyên hoá việc thực chức quang hợp nhiều tỉnh nƣớc ta nhƣ: Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Phú Yên, Bình Định, Quảng Ngãi [3] Nhà nƣớc hỗ trợ phần đầu tƣ phát triển sở hạ tầng giao thông, thủy lợi cho vùng trồng mía tập trung, nghiên cứu chuyển giao khoa học kỹ thuật công nghệ nhằm nâng cao suất, chất lƣợng, hiệu sản xuất mía đƣờng [1] Quá trình đô thị hóa, công nghiệp hóa ngày gia tăng với biến đổi môi trƣờng khí hậu nên diện tích đất trồng trọt có xu hƣớng ngày thu hẹp Hơn nữa, nƣớc ta có tới 60% giống mía giống cũ nhƣ: ROC1, ROC10, F156, F127… dạng lai ghép nội chi phức tạp Các giống có đặc điểm dễ canh tác, thích nghi rộng với nhiều vùng sinh thái Việt Nam, nhƣng trữ lƣợng đƣờng thấp Còn lại giống mía nhập nội có trữ lƣợng đƣờng cao song không phù hợp với khí hậu Việt Nam nên suất thấp Chính thế, Quyết định số 26/2007/QĐ- C4: loại lục lạp chuyên trách cố định CO 2, loại lục lạp chuyên khử CO2 thành chất hữu cho Vì mà hoạt động quang hợp C4 có hiệu nhóm thực vật khác thƣờng cho suất sinh học cao Sucrose disaccharide glucose (α-D-glucopyranoside) fructose (β-D-fructofuranosyl), có công thức phân tử C12H22O11 Đây sản phẩm trình quang hợp, có vai trò bổ sung lƣợng cho trình sinh trƣởng phát triển thực vật nhƣ sinh vật sống khác Trong thể động vật, sucrose nguyên liệu tổng hợp glucogen, thừa chuyển sang dạng mỡ dự trữ Sucrose tích lũy phần lớn mô thực vật, giúp cho thực vật có khả thích nghi tốt với điều kiện bất lợi môi trƣờng nhƣ: hạn, lạnh, mặn cƣờng độ ánh sáng mạnh [7, 12, 17, 23, 26, 30] Nó đƣợc tích trữ chủ yếu mía, củ cải đƣờng có Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn nhiều loại khác nhƣ dứa, chuối, mơ, mận, dƣa hấu, táo, cà rốt… Thay đổi hoạt tính enzyme thƣờng dẫn tới biến đổi lớn nguồn nguyên liệu tự nhiên, dễ trồng với số lƣợng lớn giá rẻ lƣợng sucrose tích lũy tế bào thực vật [6, 10, 11, 15, 31, 35] Các Sucrose dễ hòa tan nƣớc, bị thủy phân tạo thành glucose enzyme liên quan tới chu trình sinh tổng hợp sucrose thực vật đƣợc fructose nghiên cứu nhiều đối tƣợng gồm thực vật hai mầm mầm Sinh tổng hợp sucrose chu trình phức tạp diễn cytosol (tế [10, 15, 31] Trong đó, SPS (sucrose 6-phosphatephosphatase) đƣợc coi bào chất) trồng với tham gia nhiều enzyme khác nhau, enzyme chu trình sinh tổng hợp sucrose thực vật, xúc tác số enzyme (key enzyme) có ảnh hƣởng lớn tới lƣợng trình hình thành sucrose 6-phosphate, chất cho phản ứng tổng hợp sucrose đƣợc tổng hợp Các enzyme xúc tác cho dạng phản ứng: phân tử sucrose [7, 16] SPS enzyme có hoạt tính tỉ lệ thuận với sucrose (1) Tổng hợp sucrose nhƣ sucrose 6-phosphatephosphatase (SPS) sucrosesynthase (SS) (2) Thủy phân sucrose nhƣ β-fructofuranosidase (Invertase) (3) Vận chuyển hexose tới tế bào chất chuyển hóa lại thành sucrose nhƣ pyrophosphate fructose 6-phosphat phosphostransferase (PFP) [6] SUCROSE 6’-P SPS Invertase chuyển gen tăng cƣờng biểu SPS lƣợng sucrose tăng lƣợng tinh bột giảm trình quang hợp [33] Tƣơng tự, mang gen SPS rau bi-na (spinacia oleracea) có tốc độ tổng hợp sucrose cao so với đối chứng [13] Ngƣợc lại, làm bất hoạt SPS, dòng khoai tây phân lập từ nhiều loài thực vật khác ngân hàng gen NCBI UDP UDP có thông tin vài trăm trình tự SPS loài thực vật hai mầm nhƣ SS FRUCTOSE UDP-GLUCOSE PPi GLUCOSE ATP UTP PFP tỉ lệ thuận với tốc độ tổng hợp vận chuyển sucrose [16] Cây cà chua chuyển gen giảm trữ lƣợng sucrose [10] Gen mã hóa cho SPS đƣợc SUCROSE Pi mô dự trữ khoai tây, ngô, cải bó xôi [30] Ở ngô, hoạt tính SPS ADP GLUCOSE 6-P GLUCOSE 1-P Pi ADP khoai tây, thuốc lá, rau bi-na, củ cải đƣờng; mầm nhƣ lúa, ngô, mía tảo lam [9, 10, 13, 14, 21, 27, 31, 33] Liên quan chặt chẽ với SPS chu trình sinh tổng hợp sucrose enzyme thủy phân sucrose - Invertase (βfructofuranosidase) Khi hoạt tính Invertase cao lƣợng đƣờng tích lũy mô tế bào giảm ngƣợc lại Hoạt tính enzyme pyrophosphate ATP FRUCTOSE 1.6-P2 fructose 6-phosphotransferase (PFP) tỉ lệ nghịch với lƣợng sucrose Pi tế bào thực vật [11] PFP xúc tác chuyển hóa fructose 6-phosphate thành FRUCTOSE 6-P Hình 1.1: Chu trình sinh tổng hợp sucrose với tham gia cho phản ứng tổng hợp sucrose tăng, dẫn tới lƣợng sucrose tăng tƣơng ứng Ảnh hƣởng đƣợc chứng minh dòng mía có mang enzyme Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên fructose 1,6-biphosphate Do vậy, hoạt tính PFP giảm, lƣợng chất http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn cấu trúc antisense làm bất hoạt PFP Lƣợng sucrose mía chuyển Tags) enzyme Invertase phân lập từ số giống mía [35] Invertase gen non tăng khoảng 50% Tuy nhiên, phân tích trƣởng trung tính (có tế bào chất) đƣợc tinh từ thân mía trƣởng thành thành, tổng lƣợng sucrose tăng, nhƣng chƣa đáng kể so với đối chứng [11] Tuy nhiên trình tự gen mã hóa cho dạng enzyme chƣa đƣợc công bố Những nghiên cứu chứng tỏ đƣợc vai trò quan trọng enzyme GenBank SPS, PFP, Invetase việc tổng hợp tích lũy sucrose thực vật 1.3 VẬN CHUYỂN SUCROSE TRONG TẾ BÀO Invertase có mặt hầu hết mô thực vật tích trữ đƣờng tồn nhiều dạng khác nhau: dạng hoà tan (soluble acid Invertase) có nhiều Theo thuyết vận chuyển đƣờng (hay thuyết Turgeon), đƣờng sucrose không bào (dịch tế bào); dạng liên kết với màng (cell wall Invertase) có đƣợc tổng hợp tế bào chất tế bào thịt quang hợp đƣợc thành tế bào; dạng độc lập (neutral Invertase) có chủ yếu hạt Nó vận chuyển không bào, sau nhờ hệ thống cấu trúc liên kết tế enzyme xúc tác trình thủy phân sucrose không bào thành hai đƣờng bào (sợi liên bào cầu sinh chất hay plasmodesmata) đƣợc chuyển từ đơn glucose (Aldohexose) fructose (Ketohexose) [6] tế bào sang tế bào khác nhờ ống dẫn phloem mà sucrose tới khắp quan thực vật đƣờng khuyếch tán Các phân tử nhỏ sucrose ống dẫn phloem đƣợc polyme hóa thành phân tử đƣờng lớn phức tạp hơn, lúc phân tử đƣờng đƣợc đẩy xa khỏi đến phần khác cây, nơi mà đƣợc sử dụng hay tích trữ lại, kích thƣớc lớn nên chuyển ngƣợc trở Chính Vì thế, mức độ biểu có nhiều ảnh hƣởng lên sinh trƣởng phát triển thực vật [6] Cụ thể, Invertase có hoạt tính cao làm giảm lƣợng sucrose đáng kể thân mía Nghiên cứu cho thấy dòng mía có sản lƣợng đƣờng cao thƣờng dòng có hoạt tính Invertase thấp ngƣợc lại [35] Tƣơng tự, số dòng cà chua có tích chế khuếch tán tạo nên vận chuyển liên tục sucrose từ quan lũy nhiều đƣờng hoạt tính Invertase thấp Invertase có hoạt tính cao quang hợp (source tissue) tới quan dự trữ (sink tissue) Bên cạnh đó, không bào tế bào thuốc đậu tƣơng làm giảm lƣợng sucrose đƣợc vận chuyển tích trữ không bào làm nguyên liệu cho sucrose quan [6] Bất hoạt Invertase làm tăng tỉ lệ tích trữ chu trình sinh tổng hợp tinh bột Ngoài lƣợng sucrose đƣợc vận chuyển liên sucrose cà chua chuyển gen quả, đồng thời làm thay tục, phần sucrose đƣợc phân hủy nhằm cung cấp lƣợng cho đổi tỉ lệ đƣờng đơn (hexose) dòng [18, 24] Lá dòng trình sinh trƣởng phát triển, đồng thời tái tạo chất khác 1.4 ENZYME INVERTASE (β-FRUCTOFURANOSIDASE) khoai tây biểu gen mã hóa Invertase phân lập từ nấm men tích trữ chủ yếu glucose fructose sucrose Hơn nữa, dòng hình thành Invertase (β-fructofuranosidase) đƣợc mã hóa - 10 đồng phân tùy củ nhỏ dòng đối chứng, nhƣng chứa nhiều đƣờng tinh thuộc loài thực vật khác Cây mô hình Arabidopsis thaliana có bột Điều chứng tỏ Invertase có liên quan chặt chẽ tới hàm lƣợng đồng phân Invertase, cà chua phân lập đƣợc đồng vận chuyển sucrose thực vật phân Hiện nay, ngân hàng gen có trình tự EST (Expressed Sequenced Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 10 11 Nhƣ vậy, Invertase đƣợc xem nhƣ chìa khoá điều chỉnh tích lũy sucrose dự trữ thực vật Do đó, ức chế biểu Invertase tăng tích lũy sucrose mía 1.5 ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP RNAi (RNA INTERFERENCE) 1.5.1 Nguồn gốc RNAi RNAi chế để kiểm soát chuỗi thông tin di truyền hay cách vô hiệu hoá hoạt động gen xác định hai nhà khoa học Andrew Z Fire Craig C Mello khám phá công bố tạp chí Nature vào ngày 19/12/1998 [4] Andrew Fire Craig Mello nghiên cứu chế điều khiển biểu gen giun tròn (Caenorhabditis elegans) cho mRNA “chiều dịch mã” “chiều đối mã” gặp chúng kết hợp lại thành mRNA sợi kép Hai ông kiểm chứng lại giả thuyết cách tiêm phân tử mRNA sợi kép chứa mật mã di truyền quy định nhiều protein khác giun tròn Kết thu đƣợc protein đƣợc mã hóa gen không đƣợc tổng hợp Qua Fire Mello rút đƣợc kết luận RNA dạng chuỗi kép làm gen bị bất hoạt Công trình đƣợc công bố đƣợc trao giải Nobel Y học năm 2006 1.5.2 Cơ chế gây bất hoạt gen Hình 1.2 Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi Hình 1.2 cho thấy, Cơ chế RNAi đƣợc bắt đầu việc phân cắt phân tử RNA chuỗi kép (dsRNA) enzyme Dicer - enzyme thuộc họ RNase III, tạo thành phân tử RNA ức chế nhỏ (siRNA) có kích thƣớc khoảng 21 - 26 nucleotide [4] Các siRNA đƣợc giải xoắn mạch RNAi (RNA interference) đƣợc coi nhƣ phƣơng thức miễn dịch tự gắn kết với phức hợp protein cách chọn lọc gọi phức hợp cảm ứng nhiên giúp sinh vật chống lại xâm nhập virus RNA cách phân bất hoạt RNA (RISC – RNA Induced Silencing Complex) Argonaute huỷ trình tự nucleotide tƣơng đồng chúng [8] Nó làm trung gian (protein Argonaute) RISC có chứa RNase-H hoạt động nhƣ kháng lại acid nucleic ngoại bào nội bào, nhƣ điều khiển biểu endonuclease tách siRNA thành chuỗi RNA đơn, có gen mã hóa protein Nó đƣợc thực có xuất phân tử chuỗi đơn RNA có đầu 5’ có lực bắt cặp base (base pairing) nhỏ đƣợc RNA mạch kép thể sinh vật gây nên ức chế biểu gen chọn để tiếp tục vào phức hệ RISC Sau đó, RISC thu nhận phân tử loại trình tự đặc hiệu phiên mã mRNA nội sinh tế bào có trình tự tƣơng đồng với trình tự chuỗi siRNA có mặt phức hệ cách bắt cặp với base theo Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 18 19 bromide (EtBr) Sản phẩm PCR đƣợc tinh QIAquick Gel 2.2.2 Tách RNA tổng số Sử dụng hóa chất Trizol Regents (Invitrogen, Mỹ) để tách chiết RNA tổng số từ mẫu bẹ thân non giống mía in vitro ROC1 Extraction Kit 2.2.4 Tách dòng xác định trình tự gen ROC10 theo hƣớng dẫn kèm theo Sản phẩm PCR tinh đƣợc gắn vào vector tách dòng pENTR/D hãng Invitrogen (Mỹ) để tạo vector tổ hợp có mang đoạn gen mã hóa 2.2.3 RT-PCR Phân lập gen mã hóa enzyme Invertase mía kỹ thuật RT-PCR dẫn nhà sản xuất Sau đó, vector tái tổ hợp INV_pENTR đƣợc biến nạp bƣớc (RT-PCR one step) theo chu kỳ sau: vào tế bào khả biến E.coli Top 10 nhân nuôi lƣợng lớn môi trƣờng Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR bƣớc Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (oC) Invertase mong muốn (INV_pENTR) Phản ứng đƣợc thực theo hƣớng LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc 50 mg/l kanamycin Plasmid tái tổ hợp Thời gian Chu kỳ đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp Sambroock đƣợc cất giữ -20oC INV_pENTR đƣợc kiểm tra phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu Tổng hợp cDNA 50 30 phút Biến tính 95 phút Biến tính 94 20 giây 35 Gắn mồi 52 phút 35 Kéo dài chuỗi 72 phút 35 Hoàn tất chuỗi 72 10 phút Kết thúc phản ứng 24 M13for/rev Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu M13for/rev với tổng thể tích 25 μl bao gồm: 1X dung dịch đệm PCR, 50 ng plasmid, 50 mM MgCl2, mM dNTPs, 10 ng M13for, 10 ng M13rev, 0,5 g Taq polymerase Chu kỳ phản ứng nhƣ sau: Bảng 2.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ Biến tính 95 phút Biến tính 94 20 giây 35 (Bioneer) gồm có: 2X dung dịch đệm RT-PCR; µg RNA tổng số; 0,4 - 0,6 Gắn mồi 52 phút 35 mM 3’INV; 0,4 - 0,6 mM 5’INV; 0,5 g enzyme RT Mix mẫu nhẹ nhàng Kéo dài chuỗi 72 phút 35 thực phản ứng RT-PCR theo chu kỳ nhiệt nhƣ bảng 2.2 Hoàn tất chuỗi 72 10 phút Kết thúc phản ứng ∞ Thành phần phản ứng với tổng thể tích 25 l đƣợc bổ sung vào ống effendorf 0,5 ml đƣợc xử lý DEPC theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm đƣợc kiểm tra phƣơng pháp điện di gel agarose 0,8 - 1,5% dung dịch đệm TAE 1X nhuộm gel ethidium Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 20 21 Mẫu plasmid tái tổ hợp INV_pENTR sau kiểm tra đƣợc loại RNA thực xác định trình tự nucleotide máy ABI PRIMS 3100 2.2.6 Tái sinh mía thông qua mô sẹo Chúng tiến hành tái sinh mía theo phƣơng pháp hai nhóm Avant Genetic Analyzer Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen nghiên cứu Santosa cs (2004); Zhangsun cs (2007) có cải biến nhƣ sau: 2.2.5 Thiết kế vector tái tổ hợp INV-RNAi cắt đoạn thân mía non có chứa đỉnh sinh trƣởng mía in vitro INV_pENTR đƣợc gắn vào vector pK7GWIWG2(II) theo kỹ thuật dài khoảng 0,5 cm sau đặt lên môi trƣờng môi trƣờng tạo mô sẹo (M1 - Gateway để tạo plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa Invertase M4) Các mẫu cấy đƣợc nhân nuôi buồng tối 25 oC vòng 15 - (INV_RNAi) Trong kỹ thuật này, vector pENTR/D mang vị trí tái tổ hợp attL vector nhận attR Các vị trí giúp phản ứng tái tổ hợp lambda (Lambda reconstruction: LR) xảy có mặt đồng thời plasmid INV_pENTR với vector nhận pK7GWIWG(II) gắn đoạn gen Invertase theo chiều xuôi-ngƣợc vào vector nhận, tạo nên cấu trúc INV_RNAi mong muốn Các dòng plasmid tái tổ hợp sau đƣợc nhân lên tế bào 20 ngày thu đƣợc mô sẹo lên tốt Các mô sẹo nhân lên môi trƣờng tạo mô sẹo (M1) lỏng có bổ sung mg/l 2,4D tối, 27oC, lắc 90 vòng/phút, tuần để đạt kích thƣớc lớn phục vụ cho việc biến nạp Sau đó, mô sẹo đƣợc loại bỏ phần thân xanh đặt lên môi trƣờng cảm ứng tạo chồi Mc Khi chồi có kích thƣớc khoảng 1- cm (25 - 30 ngày) chuyển sang môi trƣờng tạo rễ Mr Bảng 2.4 Các môi trƣờng tái sinh mía E.coli đĩa môi trƣờng thạch LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc 100 mg/l spectinomycin, 40 mg/l streptomycin 50 mg/l chloramphenicol Môi trƣờng o 37 C qua đêm Sau tiến hành tách plasmid theo kit QIAprep Spin Nhân mía Miniprep (QIAGEN) Tạo mô sẹo enzyme HindIII XbaI sau đƣợc kiểm tra phƣơng pháp điện di tổ hợp đƣợc nhân nuôi môi trƣờng có bổ sung 100 mg/l streptomycin, 100 mg/l spectinomycin 50 mg/l rifamycin 28oC qua đêm Tách plasmid theo Sambroock kiểm tra phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu 5’INV 3’INV Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên + g/l agar 5,8 M2: MS + mg/l 2,4D + 30 g/l sucrose + g/l agar M3: MS + mg/l 2,4D + 30 g/l sucrose + g/l agar 5,8 Nhân mô nuôi M1 lỏng: MS + mg/l 2,4D + 30 g/l sucrose 5,8 lỏng lắc Tạo chồi Tạo rễ http://www.Lrc-tnu.edu.vn M0: MS + 0,8 mg/l BAP + 0,4 mg/l IBA + 30 g/l sucrose M4: MS + mg/l 2,4D + 30 g/l sucrose + g/l agar gel agarose 0,8% Dòng tế bào mang vector INV_RNAi đƣợc biến nạp vào A.tumefaciens CV58C1 xung điện 400 Ω / 2,5 KV / 25 μF Plasmid tái pH M1: MS + mg/l 2,4D + 30 g/l sucrose + g/l agar Plasmid tái tổ hợp INV_RNAi thu đƣợc đƣợc phân lập kiểm tra có mặt đoạn gen Invertase phƣơng pháp cắt giới hạn với hai Thành phần Mc: MS +1,5 mg/l kinetin + mg/l BAP + 30 g/l sucrose +9 g/l agar Mr: MS + mg/l NAA + 30 g/l sucrose +9 g/l agar Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5,8 http://www.Lrc-tnu.edu.vn 22 23 KHÁI QUÁT SƠ ĐỒ THÍ NGHIỆM 2.2.7 Thử nghiệm chuyển gen gus-intron vào mía 2.2.7.1 Tạo huyền phù vi khuẩn Cây mía in vitro Lấy khuẩn lạc từ đĩa nuôi đặc nuôi môi trƣờng LB có bổ sung 100 mg/l spectinomycin + 50 mg/l chloramphenicol + 50 mg/l kanamycine (hoặc 100 mg/l spectinomycin + 50 mg/l rifamycin) 28oC, lắc Cắt đoạn thân sát gốc (5 cm) Thiết kế mồi 200 vòng/phút qua đêm Lấy ml khuẩn nuôi phục hồi 30 ml môi trƣờng LB lỏng mới, lắc tiếp khoảng - điều kiện Sau ly tâm khuẩn 5000 vòng/phút 10 phút thu sinh khối tế bào hòa Mô sẹo Tách RNA tổng số tan khuẩn vào ½ MS không đƣờng, (pH = 5,8) có bổ sung AS 100 mM 2.2.7.2 Đồng nuôi cấy với huyền phù A.tumefaciens tái sinh Đồng nuôi cấy Mô sẹo sau đƣợc nhân sinh khối từ môi trƣờng lỏng đƣợc lấy RT_PCR tách thành mảnh nhỏ Quá trình lây nhiễm khuẩn đƣợc tiến hành theo hai hƣớng thổi khô mô sẹo chuyển lên môi trƣờng cảm ứng tạo chồi với Diệt khuẩn ngƣỡng thời gian khác Sau mô sẹo đƣợc lấy ngâm huyền phù vi khuẩn thời gian từ 10 - 30 phút Sau thấm khô cấy lên môi Tách dòng xác định trình tự gen Chọn lọc mô sẹo trƣờng đồng nuôi cấy M1 (thổi khô) Mc (cảm ứng tạo chồi) Sau ngày, mô sẹo đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng diệt khuẩn M1 có bổ sung 500 mg/l cefotaxim tuần Các mô sẹo sống sót đƣợc chuyển lên môi trƣờng Tái sinh Thiết kế vector tái tổ hợp INV_RNAi tái sinh Mc + 500 mg/l cefotaxim Mc + 500 mg/l cefotaxim + mg/l ppt Các chồi tái sinh đƣợc chuyển sang môi trƣờng chọn lọc Mr có bổ sung 500 mg/l cefotaxim mg/l ppt để tạo hoàn chỉnh Chúng kiểm tra biểu gen gus cách nhuộm mô sẹo sau đồng nuôi cấy với dung dịch X-gluc, ủ 37oC tối khoảng từ 12 16 giờ, sau rửa với cồn 70% soi kính hiển vi Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 24 25 Chƣơng Bảng 3.1 Trình tự thông số cần thiết cặp mồi 3’INV 5’INV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 THIẾT KẾ MỒI Để nhân đƣợc đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase kỹ thuật Mồi Trình tự mồi (5’INV) 5’-CATCTGGGGCAACAAGATC-3’ ’ ’ (3 INV) ’ -CACCAAGTGCACGAAGTCCTTG-3 Tm(oC) %GC 52,3 52,6 59,1 54,5 RT-PCR điều quan trọng phải có đƣợc cặp mồi đặc hiệu cho trình tự Bảng 3.2 Mã số trình tự đoạn gen Invertase mía đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase Chúng sử dụng từ khóa ngân hàng gen NCBI “Invertase Sugarcane” để tìm kiếm ngân hàng liệu gen NCBI STT Mã số Chiều dài Dạng Tên trình tự gen Invertase đƣợc công bố (www.ncbi.nlm.nih.gov) Kết AY302083 2274 bp mRNA Invertase hòa tan AF062734 1808 bp mRNA AF083856 1402 bp AF083855 494 bp AF062735 1808 bp AY302084 1889 bp thu đƣợc sáu trình tự gen mã hóa cho enzyme Invertase mía, có trình tự mã hóa cho enzyme Invertase hòa tan (soluble acid Invertase) với mã số AF062734, AF 062735, AF083855, AF083856, AY302083; trình tự mã hóa cho enzyme Invertase liên kết màng (cell wall Invertase) có mã số AY302084 (Bảng 3.2) Sử dụng chƣơng trình MegAlign (DNAstar) so sánh độ tƣơng đồng trình tự với cho thấy năm trình tự Invertase hoà tan tƣơng đồng cao đƣợc phân lập từ giống mía Invertase hòa tan Invertase hòa mRNA tan Invertase hòa mRNA tan Invertase hòa mRNA tan khác có độ tƣơng đồng 46% với đoạn trình tự mã hoá cho Invertase liên kết màng Trình tự đầy đủ gen với mã số AY302083 có độ dài mRNA 1923 bp Trong nghiên cứu đoạn gen dài 435 nucleotide (từ nucleotide vị trí 384 tới vị trí 818 bp - vùng có trình tự bảo thủ cao nhất) nằm Invertase liên kết màng Tác giả Peters,K.F., Grof,C.P.L and Botella,J.R Albert,H.H., Zhu,Y.J and Moore,P.H Albert,H.H., Zhu,Y.J and Moore,P.H Albert,H.H., Zhu,Y.J and Moore,P.H Albert,H.H., Zhu,Y.J and Moore,P.H Peters,K.F., Grof,C.P.L., Albertson,P.L and Botella,J.R 3.2 TÁCH RNA TỔNG SỐ gen mã hoá enzyme Invertase hòa tan (AY302083) đƣợc lựa chọn để tách Do đặc tính RNA loại phân tử không bền, dễ bị phân hủy dòng Sau với mục đích giúp sản phẩm PCR gắn đƣợc vào vector tách dòng enzyme ribonuclease (RNase) RNase có mặt khắp nơi tế bào pENTR/D gắn thêm đồng thời vào mồi đầu đoạn trình tự có hoạt tính mạnh có hoạt tính mạnh nhiệt độ cao (100oC CACC để tạo vị trí bám cho enzyme TOPO-Isomerasse (GTGG) gắn khoảng giờ) Do đó, việc tách chiết RNA đòi hỏi phải cẩn thận để ’ vector nhân dòng PENTR/D-TOPO Cặp mồi đƣợc đặt tổng hợp hãng BIONEER, Hàn Quốc Trình tự cặp mồi đặc hiệu thu đƣợc bảng 3.1 nhƣ sau: Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn tránh tạp nhiễm chứa RNase từ môi trƣờng tất dụng cụ thí nghiệm để tách RNA phải đƣợc xử lý dung dịch DEPC 0,1% để loại trừ RNase Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 26 27 Để tách RNA tổng số từ thân non mía tiến hành thu mẫu bẹ non hai giống ROC1 ROC10 Các mẫu đƣợc nghiền nhanh N2 lỏng thành bột mịn với cối chày sứ đƣợc khử trùng để phá vỡ tế bào Sau phải bổ sung dung dịch Trizol vào không RNase nội bào đƣợc giải phóng phân cắt RNA Các thành phần dung dịch Trizol nhƣ: phenol, guanidine isothiocyanate nhanh chóng làm kết tủa protein bất hoạt RNase nội bào Bổ sung chloroform:isoamyl 3.3 NHÂN DÕNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE RNA tổng số sau đƣợc tinh sử dụng làm khuôn cho phản ứng RT-PCR để nhân đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase với cặp mồi 5’INV 3’INV thiết kế Nếu phản ứng xảy đặc hiệu theo lý thuyết có băng có kích thƣớc dài tƣơng ứng với tính toán lí thuyết 435 bp đoạn Invertase cần phân lập đƣợc nhân lên (24:1) để làm protein sót lại Tiếp theo việc bổ sung isopropanol INV vào làm kết tủa RNA Cuối sản phẩm RNA tổng số đƣợc hòa tan M 20 μl nƣớc cất có DEPC 0,01% RNA tổng số đƣợc kiểm tra chất lƣợng phƣơng pháp điện di gel agarose 1% Hình 3.1 cho thấy mẫu RNA từ thân có hàm lƣợng lớn có băng RNA riboxom rõ nét nên khẳng định RNA tổng số chƣa bị phân hủy tối ƣu để tiến hành thí 450 bp nghiệm Nhƣ vậy, tách chiết thành công RNA tổng số từ thân non mía ROC1 ROC10 in vitro ROC Lá 10 Thân 10 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm RT-PCR gel agarose 0,8% (M): Marker 1kb; (INV): sản phẩm gel Phản ứng RT-PCR bị giảm hiệu số nguyên nhân nhƣ chất lƣợng hàm lƣợng RNA tổng số gen mã hóa enzyme Invertase, nhiệt độ bắt cặp với mồi chƣa phù hợp Vì tiến hành phản ứng điều chỉnh lƣợng mẫu, nồng độ mồi, Mg2+, nhiệt độ bắt cặp với mồi để đảm bảo cho phản ứng RT-PCR xảy đặc hiệu Thành phần hỗn hợp Hình 3.1 Kết điện di RNA tổng số tách từ bẹ thân non giống mía ROC1 ROC10 gel agarose 1% RNA tổng số đƣợc loại DNA DNase sử dụng cho phản ứng RT-PCR Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn phản ứng chu kỳ nhiệt phản ứng đƣợc tối ƣu hóa trình bày mục 2.2.1.3 Sản phẩm phản ứng RT-PCR bƣớc với khuôn RNA tổng số thu đƣợc từ bẹ mía non (giống ROC1) đƣợc kiểm tra phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 3.2) Kết cho thấy Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 28 29 nhân đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 450 bp (khi so sánh với khả biến Ở đây, toàn vector tái tổ hợp INV_pENTR đƣợc biến nạp với thang DNA chuẩn kb), kích thƣớc phù hợp với kích thƣớc đoạn DNA tế bào khả biến đƣợc cấy trải khuẩn môi trƣờng có bổ sung kháng sinh dự đoán thiết kế cặp mồi đặc hiệu chọn lọc kanamycine 50 mg/l ủ 37oC, qua đêm Kết thu đƣợc 3.4 TÁCH DÒNG GEN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN khuẩn lạc màu trắng đĩa môi trƣờng Song tất khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp INV_pENTR thân plasmid có gen 3.4.1 Tạo plasmid tái tổ hợp INV-pENTR kháng kháng sinh tế bào khả biến E.coli lại không kháng kháng Để khẳng định chắn đoạn DNA thu đƣợc từ phản ứng RT-PCR xác đoạn gen mã hóa enzyme Invertase, tiến hành việc tách dòng xác định trình tự gen Để việc tách dòng đạt đƣợc hiệu tiến hành tinh sản phẩm RT-PCR theo kit Qiagen hãng QIAquick Gel Extraction Quá trình tách dòng đƣợc thực cách gắn sản phẩm RT-PCR vào vector tách dòng pENTR/D hãng Invitrogen (Mỹ) để tạo “entry clone” INV_pENTR Vector pENTR/D có kích thƣớc 2580 bp, vector có hai vị trí gắn attL1 attL2, đoạn gen cần chuyển Invertase đƣợc gắn vào hai vị trí Vector có gen kháng kháng sinh kanamycin có vị trí gắn mồi M13 phục vụ cho việc chọn sinh Vì vậy, có lƣợng nhỏ tế bào chứa plasmid pENTR/D nhƣng lại không gắn gen Invertase, enzyme TOPO hai đầu vector bị plasmid tự đóng vòng Vậy số khuẩn lạc thu đƣợc, khuẩn lạc mang vector chứa đoạn gen mã hóa Invertase khuẩn lạc không có? Để xác định rõ plasmid tái tổ hợp dòng INV_pENTR mong muốn, tiến hành tách chiết plasmid theo Sambrock từ khuẩn lạc sống sót môi trƣờng có bổ sung kháng sinh chọn lọc thực phản ứng PCR plasmid thu đƣợc với cặp mồi đặc hiệu M13for/rev dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp INV_pENTR Ngoài ra, enzyme 3.4.3 Chọn lọc plasmide tái tổ hợp INV_pENTR PCR với cặp mồi Topoisomerase giúp cho việc gắn gen vào vector diễn khoảng M13 (F/R) thời gian ngắn (khoảng phút) đạt hiệu cao tới 90% Thành Quá trình biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli phần chu trình phản ứng đƣợc trình bày mục 2.2.4.1 Kết sốc nhiệt có hiệu tới 95% Song có gen không phản ứng thu đƣợc vector tái tổ hợp INV_pENTR đƣợc gắn vào chúng tồn bên xung quanh khuẩn lạc 3.4.2 Biến nạp plasmid tái tổ hợp INV_pENTR vào tế bào khả biến mọc đĩa môi trƣờng chọn lọc Do đó, PCR plasmid với cặp gen đặc hiệu E.coli TOP 10 3’INV, 5’INV thu đƣợc băng có kích thƣớc khoảng 435 bp Vector tái tổ hợp INV_pENTR thu đƣợc sau phản ứng lai đƣợc biến nhƣng đoạn gen Invertase đƣợc gắn vào vector Vì vậy, nạp vào tế bào khả biến E.coli TOP 10 phƣơng pháp sốc nhiệt nhằm tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi M13for/rev đặc hiệu vector tách dòng nhân nhanh plasmid tái tổ hợp với số lƣợng lớn Hiệu pENTR/D với plasmid dòng khuẩn số 1, 2, để có kiểm tra phản ứng phụ thuộc vào chất lƣợng sản phẩm vector tái tổ hợp tế bào xác xem đoạn gen Invertase gắn đƣợc vào vector tách dòng hay chƣa Theo Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn http://www.Lrc-tnu.edu.vn 30 31 lý thuyết vị trí gắn mồi M13for/rev vector pENTR/D đƣợc thiết kế 3.4.4 Kết xác định trình tự nucleotit đặc hiệu cho phép nhân đoạn DNA từ nucleotide vị trí 537 tới vị trí Đoạn gen mã hóa Invertase đƣợc gửi xác định trình tự nuclotide 861 vector pENTR/D Nhƣ vậy, PCR với cặp mồi thu đƣợc máy xác định trình tự tự động ABI PRIMS 3100 Avant Genetic Analyzer Sau sản phẩm có chiều dài khoảng 750 bp 324 bp từ dòng plasmid đó, sử dụng phần mềm DNAstar BioEdit để tiến hành so sánh INV_pENTR dƣơng âm tính tƣơng ứng kiểm tra phƣơng pháp trình tự nucleotide đoạn gen mã hóa enzyme Invertase với trình tự điện di gel agarose 0,8% Invertase có mã số AY302083 đƣợc sử dụng để thiết kế cặp mồi Kết nhƣ sau: - AY302083 amplified 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | AGGAACTGGATGAACGACCCCAATGGCCCGGTGTACTACAAGGGCTGGTACCACCTGTTCTACCAATACAACCCGGACGGCGCCATCTGGGGCAACAAGA -CATCTGGGGCAACAAGA AY302083 amplified 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | TCGCGTGGGGCCACGCCGTCTCCCGCGACCTCATCCACTGGCGCCACCTCCCGCTGGCCATGCTGCCCGACCAGTGGTACGACACCAACGGCGTCTGGAC TCGCGTGGGGCCACGCCGTCTCCCGCGACCTCATCCACTGGCGCCACCTCCCGCTGGCCATGGTGCCCGACCAGTGGTACGACACCAACGGCGTGTGGAC AY302083 amplified 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | GGGCTCCGCCACCACGCTCCCCGACGGCCGCCTCGCCATGCTCTACACCGGCTCCACCAACGCCTCCGTGCAGGTGCAGTGCCTCGCCGTGCCCGCCGAC GGGCTCCGCCACCACGCTCCCCGACGGCCGCCTCGCCATGCTCTACACGGGCTCCACCAACGCCTCCGTGCAGGTGCAGTGCCTCGCCGTGCCCGCCGAC AY302083 amplified 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | GACGCCGACCCGCTGCTCACCAACTGGACCAAGTACGAGGGCAACCCGGTGCTGTACCCGCCGCCGGGCATCGGGCCCAAGGACTTCCGCGACCCCACCA GACGCCGACCCGCTGCTCACCAACTGGACCAAGTACGAGGGCAACCCGGTGCTGTACCCGCCGCCGGGGATCGGGCCCAAGGACTTCCGCGACCCCACCA AY302083 amplified 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | CGGCGTGGTTCGACCCGTCGGACAACACCTGGCGCATCGTCATCGGCTCCAAGGACGACGCCGAGGGCGACCACGCCGGCATCGCCGTGGTGTACCGCAC CGGCGTGGTTCGACCA M 750 bp Hình 3.4 Kết so sánh trình tự đoạn gen Invertase phân lập đƣợc với Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR plasmid với cặp mồi trình tự Invertase ngân hàng gen có mã số AY302083 M13(For/Rev) nhằm kiểm tra có mặt đoạn Invertase Trên hình 3.4 cho thấy, trình tự gen Invertase phân lập đƣợc mía vector pENTR/D (M): Marker 1kb; (1), (2),( 3): sản phẩm PCR từ plasmid INV_ pENTR/D; ROC1 in vitro có độ tƣơng đồng cao với trình tự gen AY302083 đƣợc (-): đối chứng âm sử dụng để thiết kế cặp mồi đặc hiệu (90,1%) Điều chứng tỏ Với kết thu đƣợc hình 3.3 cho thấy dòng plasmid tái tổ hợp phân lập xác đoạn gen mã hóa Invertase mong muốn mía ROC1 tách từ dòng khuẩn số cho băng có kích thƣớc khoảng 750 bp in vitro với kích thƣớc tính toán lý thuyết dòng plasmid INV_pENTR 3.5 THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP INV-RNAi dƣơng tính Nhƣ vậy, kết luận đoạn gen Invertase đƣợc gắn 3.5.1 Tạo vector tái tổ hợp INV_RNAi kỹ thuật Gateway tạo “entry clone” INV_pENTR dòng khuẩn số Dòng plasmid Kỹ thuật Gateway Cloning kỹ thuật nhân dòng phổ biến hiệu INV_pENTR tái tổ hợp đƣợc gửi để xác định trình tự đoạn gen Invertase cho việc gắn trình tự DNA vào hệ thống nhiều vector Trong thí Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn http://www.Lrc-tnu.edu.vn 32 33 nghiệm thực phản ứng LR với thành phần trình bày có kháng sinh 100 mg/l spectinomycin, 40 mg/l streptomycin 50 mg/l mục 2.2.2.1 để gắn vector INV_pENTR với vector pK7GWIWG2(II) nhằm chloramphenicol Kết thu đƣợc lƣợng lớn khuẩn lạc màu trắng thu đƣợc vector chuyển gen INV_RNAi gen mã hóa Invertase Phản ứng mọc môi trƣờng chọn lọc đƣợc tiến hành với xúc tác enzyme LR-clonase Proteinase K Vector pK7GWIWG2(II) vector có cấu trúc mang gen kháng nhiệt độ phòng pK7GWIWG2(II) vector chuyển gen đƣợc cấu trúc hai vùng gắn đặc biệt là: attR1-ccdB-attR2 có chiều ngƣợc đƣợc nối với nhờ đoạn intron Do đó, thực phản ứng lai LR tạo sản phẩm plasmid INV_RNAi có hai vị trí gắn mang đoạn gen Invertase có chiều ngƣợc nhau: sense-intron-antisense (Invertase-intron-antiInvertase) Đoạn intron vector pK7 có vai trò quan trọng việc tạo đoạn thắt nút (vòng) để RNA sợi đôi dễ đƣợc hình thành (Invertase-intronantiInvertase) hoạt động cách ổn định genome vật chủ đƣợc chuyển vào Đây cấu trúc RNAi cần thiết kế để chuyển gen vào mía nhằm tăng trữ lƣợng đƣờng mía cao cách ổn định kháng sinh spectinomycin, streptomycin, chloramphenicol gen ccdB mã hóa cho plasmid F gây ức chế sinh trƣởng tế bào E.coli, vector INV_RNAi gen ccdB gen Invertase chèn vào thay Vì vậy, khuẩn lạc mọc đĩa môi trƣờng chọn lọc khuẩn lạc có mang plasmid pK7GWIWG2(II) nhƣng vị trí chứa đoạn gen ccdB bị đột biến khuẩn lạc có mang plasmid INV_RNAi Chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc đƣợc đánh số từ đến nuôi môi trƣờng lỏng có kháng sinh chọn lọc tƣơng tự tiến hành tách plasmid từ dòng khuẩn Để kiểm tra plasmid thu đƣợc có xác INV_RNAi pK7GWIWG2(II) nhƣng vị trí chứa đoạn gen ccdB bị đột biến Chúng thực phản ứng cắt enzyme giới hạn đặc hiệu XbaI HindIII plasmid từ khuẩn lạc số 1, Theo tính toán lý thuyết sản phẩm phản ứng cắt enzyme cho đoạn có kích thƣớc là: Đoạn dài 978 bp mang đoạn Invertase chiều xuôi, đoạn dài 2825 bp mang đoạn Invertase chiều ngƣợc cuối phần lại vector nhận pK7GWIWG(II) dài 8114 bp Hình Hình 3.5 Mô hình cấu trúc chuyển gen INV_RNAi 3.6 cho thấy sản phẩm phản ứng cắt enzyme thu đƣợc phân đoạn có 3.5.2 Biến nạp vector INV_RNAi vào tế bào khả biến E.coli kích thƣớc tƣơng ứng với dự tính plasmid 1, và có khác Vector tái tổ hợp INV_RNAi đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli TOP 10 phƣơng pháp sốc nhiệt 42 oC với khoảng thời gian phút 30 biệt rõ rệt so với đối chứng vector không biến nạp pK7GWIWG(II), chứng tỏ cấu trúc INV_RNAi đƣợc thiết kế o giây Sau đó, khuẩn đƣợc nuôi phục hồi với 250 μl LB lỏng 37 C tủ lắc khoảng 60 phút Tiếp theo khuẩn đƣợc nuôi cấy môi trƣờng chọn lọc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 34 35 Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR plasmid INV-RNAi A.tumefaciens với cặp mồi đặc hiệu 5’INV 3’INV Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid INV_RNAi tổ hợp với HindIII XbaI (M): Marker 1kb; (1), (2), (3): dòng plasmid tái tổ hợp; (-): đối chứng vector pK7GWIWG(II) (M): Marker 1kb; (1), (2): dòng plasmid tái tổ hợp; (-): đối chứng âm Tách plasmid theo Sambroock kiểm tra có mặt INV_RNAi A.tumefaciens CV58C1 phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu 5’INV 3’INV Kết kiểm tra hình 3.7 cho thấy dòng khuẩn lạc 3.6 BIẾN NẠP VECTOR CHUYỂN GEN INV_RNAi VÀO CHỦNG VI cho kết dƣơng tính kích thƣớc khoảng 450 bp mong muốn Nhƣ vậy, KHUẨN A.TUMEFACIENS CV58C1 chứng tỏ tạo đƣợc vector chuyển gen INV_RNAi chủng vi Để kiểm tra hoạt động cấu trúc INV_RNAi vector tái tổ hợp khuẩn A.tumefaciens CV58C1 Đây nguồn nguyên liệu phục vụ cho thí trồng nhƣ tạo nguyên liệu cho trình chuyển gen ức chế nghiệm chuyển gen nhằm tạo dòng mía bất hoạt gen mã hoá biểu gen mã hóa Invertase mía, cấu trúc INV_RNAi phải đƣợc Invertase, tăng lƣợng sucrose tích trữ biến nạp vào vi khuẩn A.tumefaciens CV58C1 phƣơng pháp xung điện 3.7 TÁI SINH VÀ BƢỚC ĐẦU BIỂU HIỆN GEN GUS Ở MÍA Đây phƣơng pháp biến nạp có hiệu cao thời gian ngắn Plasmid tái tổ hợp INV_RNAi số đƣợc biến nạp vào A.tumefaciens 3.7.1 Quy trình tái sinh mía thông qua mô sẹo xung điện với thành phần bƣớc tiến hành biến nạp đƣợc trình bày Từ nghiên cứu tái sinh chuyển gen thành công mía cho mục 2.2.2.3 Kết cho thấy đĩa môi trƣờng có bổ sung kháng sinh thấy tỉ lệ tái sinh thu đƣợc cao hiệu thông qua nguyên liệu ban chọn lọc 100 mg/l streptomycin, 100 mg/l spectinomycin 50 mg/l đầu mô sẹo Trong thí nghiệm này, tiến hành thử nghiệm tạo mô rifamycin thu đƣợc khuẩn lạc màu trắng Sau chọn ngẫu nhiên sẹo với giống mía ROC10 in vitro môi trƣờng MS đối chứng dòng khuẩn lạc nhân nuôi môi trƣờng lỏng có bổ sung kháng sinh 2,4D môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo M1-M4 (Bảng 2.4) Kết thu chọn lọc 100 mg/l streptomycin, 100 mg/l spectinomycin 50 mg/l đƣợc cho thấy môi trƣờng đối chứng MS (không có 2,4D) hoàn toàn không rifamycin để tách plasmid Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 36 37 tạo đƣợc mô sẹo Còn mẫu môi trƣờng cảm ứng có bổ sung hàm lƣợng chất kích thích sinh trƣởng 2,4D tạo đƣợc mô sẹo cho hiệu tái sinh mía đƣợc thể thông qua bảng sau: Bảng 3.3 Khả tạo mô sẹo tái sinh giống mía ROC10 in vitro môi trƣờng thử nghiệm M1 - M4 Môi 2,4-D Tổng mẫu trƣờng (mg/l) cấy Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) Cây mía ROC10 in vitro Đoạn thân sát gốc dài 0,5 cm môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo Mô sẹo Tạo hoàn chỉnh Mô sẹo lên mầm xanh Mô sẹo nhú mầm Tỉ lệ mẫu tạo Số chồi / chồi khối mô sẹo (%) M1 3x130 83,07 ± 0,44 67,95 ± 1,36 42,66 ± 1,45 M2 3x130 86,15 ± 3,11 46,41 ± 3,33 20,66 ± 2,96 M3 3x130 71,79 ± 0,68 63,08 ± 1,33 32,33 ± 1,45 M4 3x130 83,33 ± 2,89 37,95 ± 1,12 17,66 ± 4,33 Bảng 3.3 cho thấy, mẫu môi trƣờng M1 có bổ sung mg/l 2,4D cho tỉ lệ tạo mô sẹo hiệu suất tái sinh cao hẳn so với môi trƣờng Hình 3.8 Quy trình tái sinh mía ROC10 in vitro từ mô sẹo 3.7.3 Chọn lọc mô sẹo tái sinh chuyển gen M2 - M4 có bổ sung 4, 5, mg/l 2,4D; tỉ lệ tạo chồi đạt 67,95% Quy trình chuyển gen có hiệu yếu tố quan trọng việc số chồi khối mô sẹo đạt khoảng 42,66 Nhƣ vậy, môi trƣờng M1 có chuyển gen vào thực vật Sau thử nghiệm đƣợc môi trƣờng tái sinh bổ sung mg/l 2,4D cho kết tạo mô sẹo tái sinh mía ROC10 in mía thông qua mô sẹo, tiến hành thử nghiệm việc chuyển gen vào vitro tốt thí nghiệm Do đó, chọn môi trƣờng M1 có bổ sung mg/l 2,4D làm môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo cho việc tái sinh chuyển gen mía thí nghiệm Quá trình tái sinh từ mô sẹo đến hoàn chỉnh đƣợc minh họa hình 3.8 mía thông qua việc sử dụng gen thị gus-intron Trong nghiên cứu này, thử nghiệm hai chủng vi khuẩn A.tumefaciens khác EHA1300 CV58C1 mang vector chuyển gen pPTN289, ngƣỡng thời gian nhiễm khuẩn 10 30 phút Chúng thử nghiệm lây nhiễm khuẩn với mô sẹo theo phƣơng Mặt khác, tiếp tục nhân nuôi mô sẹo môi trƣờng lỏng pháp thổi khô sau nhân nuôi môi trƣờng lỏng lắc M1 Song lắc M1 có bổ sung mg/l 2,4D vòng tuần, 27oC, lắc 90 vòng/phút, không thu đƣợc kết chuyển gen mong muốn kiểm tra biểu gen điều kiện tối để phục vụ cho việc biến nạp thử nghiệm gen gus-intron thị gus-intron với dung dịch X-gluc Do đó, tiến hành hƣớng nghiên cứu thứ hai chuyển mô sẹo sau nhân nuôi sang môi trƣờng cảm ứng tạo chồi Mc sau tiến hành lây nhiễm khuẩn Ở thời gian biến nạp 10 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 38 39 phút mô sẹo hai chủng vi khuẩn không thu đƣợc mẫu có biểu gen gus Trong thời gian nhiễm khuẩn 30 phút, mẫu có biểu gen gus xuất hai công thức với hai chủng khuẩn nghiên cứu Tỉ lệ biểu gen gus mô sẹo đạt 31,67% với chủng CV58C1 11,67% sử dụng chủng EHA1300 Khi sử dụng hai chủng vi khuẩn với ngƣỡng thời gian nhiễm khuẩn 30 phút, thu đƣợc chồi mía sống sót môi trƣờng chọn lọc (với CV58C1 18,57% EHA1300 7,14%) Mô sẹo biến nạp môi trƣờng đồng nuôi cấy Mc Mô sẹo biểu gus nhuộm với dung dịch X-gluc Bảng 3.4 Kết biến nạp gen gus-intron vào mía Thời gian Tỉ lệ biểu Chủng vi khuẩn biến nạp gen gus A.tumefaciens (phút) (%) Tỉ lệ mẫu tái sinh (%) Tỉ lệ mẫu sống sót môi trƣờng có bổ sung mg/l ppt (%) CV58C1 30 31,67 ± 0,65 81,43 ± 1,56 18,57 ± 1,28 EHA1300 30 11,67 ± 0,89 92,85 ± 0,31 7,14 ± 0,69 Nhƣ vậy, bƣớc đầu thu đƣợc kết tiến hành chuyển gen gus vào mía thông qua mô sẹo theo phƣơng pháp cảm ứng tạo chồi Tuy nhiên thời gian có hạn, yếu tố ảnh hƣởng đến kết chuyển gen Chồi môi trƣờng chọn lọc Mr có bổ sung 500 mg/l cefotaxime mg/l ppt Mô sẹo tạo chồi Mc có bổ sung 500 mg/l cefotaxime chƣa hoàn toàn đƣợc tối ƣu Mặc dù vậy, việc thu đƣợc mô sẹo tái Hình 3.9 Biến nạp gen gus-intron vào mía ROC10 in vitro sinh có biểu gen thị gus cho thấy việc sử dụng công nghệ thông qua trung gian A.tumefaciens RNAi để tạo mía chuyển gen làm tăng khả tích trữ đƣờng mía hƣớng triển vọng tƣơng lai Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ BÀI BÁO CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ĐÃ ĐƢỢC CÔNG BỐ KẾT LUẬN: Phân lập đƣợc đoạn gen mã hoá Invertase có kích thƣớc khoảng 435 bp từ giống mía ROC1 in vitro xúc tác trình phân huỷ sucrose Thiết kế đƣợc vector chuyển gen INV-RNAi ức chế biểu Invertase biến nạp thành công chủng vi khuẩn A.tumefaciens Lƣu Thị Cƣ, Đỗ Tiến Phát, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình, Lê Quỳnh Liên (2009) Phân lập thiết kế vector ức chế biểu gen mã hoá Invertase (-fructofuranosidase) mía Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc_Thái Nguyên, tháng 11 năm 2009 CV58C1 Chọn lọc số môi trƣờng thích hợp tái sinh mía thông qua mô sẹo (môi trƣờng tạo mô sẹo M1, môi trƣờng tạo chồi Mc, môi trƣờng tạo rễ Mr) bƣớc đầu chuyển gen thị gus-intron vào mía ĐỀ NGHỊ: Tiến hành chuyển vector ức chế biểu mã hóa Invertase (INVRNAi) mía nhằm tăng trữ lƣợng đƣờng giống mía Việt Nam Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO 11 Groenewald J, Botha FC (2007) Down-regulation of pyrophosphate: fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase (PFP) activity in Sugarcane TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT enhances sucrose accumulation in immature internoods Transgenic Res Quyết định số 26/2007/QĐ-TTg, việc phê duyệt “Quy hoạch phát triển mía đường đến năm 2010 định hướng đến năm 2020” Hoàng Thị Sản (2003) Phân loại học thực vật Nxb Giáo dục Trần Văn Sỏi (2003) Cây mía Nhà xuất Nghệ An 12 Guy CL (1990) Cold acclimation and freezing stress tolerance: role of protein metabolism Annu Rev Plant physiol Plant Mol Biol 41: 187223 13 Haigler CH, Singh B, Zhang D, Hwang S, Wu C, Cai WX, Hozain M, Kang Đỗ Năng Vịnh (2007) Công nghệ can thiệp RNA (RNAi) gây bất hoạt gen tiềm ứng dụng to lớn Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(3): 265-275 W, Kiedaisch B, Strauss RE, Hequet EF, Wyatt BG, Jwiden GM, Holaday AS (2007) Transgenic cotton over-producing spinach sucrose phosphate Vũ Văn Vụ (1999) Sinh lí thực vật ứng dụng Nxb Giáo dục synthase showed enhanced leaf sucrose synthesis and improved fiber TÀI LIỆU TIẾNG ANH quality under controlled environmental conditions Plant Mol Biol 63 (6): Avigad G and Dey PM (1997) Carbohydrate metabolism: storage 815-32 carbohydrates Plant biochemistry Acedemic Press Ltd, pp: 143-204 Balibrea ME, Rus-Alvarez AM, Bolarin MC, Perez-Alfocea F (1997) Fast changes in soluble carbohydrates and proline content in tomato seedlings in response to ionic and nonionic iso-osmostic stress, J Plant physiol 14 Hesse H, Sonnewald U, Willmitzer L (1995) Cloning and expression analysis of sucrose phosphate synthase from sugar beet (Beta vulgaris L.) Mol Gen Genet 247 (4): 515-20 15 Huber SC and Huber JL (1992) Role of sucrose-phosphate Synthase in Sucrose Metabolism in leaves Plant physiol 99: 1275-1278 (151): 222-226 Baulcomble D (2004) RNA silencing in plants Nature 431 (7006): 356-63 Chen S, Hajirezaei M, Bornke F (2008) Differential expression of sucrose phosphate synthase isoenzymes in tobaco reflects their functional specialization during dark governed starch mobilization in source leaves Plant Cell Environ 31(1): 165-76 elegans Nature 391: 806-811 10 Geigenberger P, Reimholz R, Deiting U, Sonnewald U and Stitt M (1999) Decreased expression of sucrose phosphate Synthase Strongly inhibits the water stress-induced synthesis of sucrose in growing potato tubers The 16 Huber SC, and Huber JL(1996) Role and regulation of Sucrose phosphate synthase in higher plants Annu Rew Plant physiol Plant Mol.Biol 47: 431-444 17 Ingram J, Chadler JW, Gallagher L, Salamini F, Bartels D (1997) Analysis of cDNA clones encoding sucrose-phosphate synthase in relation to sugar interconversions associated with dehydration in the resurrection plant, Craterostigma plantagineum Hochst Plant Physiol 115:113-121 18 Klann EM, Hall B, Bennett AB (1996) Antisense acid invertase (TIV1) gene alters soluble sugar composition and size in transgenic tomato fruit Plant plant Journal 19: 119-129 Physiol 112 (3): 1321-30 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 19 Le QL, Mahler V, Lorenz Y, Scheurer S, Biemelt S, Vieths S, Sonnewald U 29 Snyman SJ, Meyer GM., Richards JM, Haricharan N, Ramgareeb S, (2006b) Reduced allergenicity of tomato fruits harvested from Lyc e Huckett BI (2006) Refining the application of direct embryogenesis in silenced transgenic tomato plants J Aller Clin Immunol 118(5):1176-83 sugarcane: effect of the developmental phase of leaf disc explants and the 20 Liu Q, Singh SP, Green AG (2002) High-stearic and High-oleic cottonseed oils produced by hairpin RNA-mediated post-transcriptional gene silencing Plant Physiol 129(4): 1732-43 timing of DNA transfer on transformation efficiency Plant Cell Rep 25: 1016–1023 30 Stitt M (1989) Product inhibition of potato tuber pyrophosphate, Fructose 21 Lunn JE, Gillespie VJ, Furbank RT (2003) Expression of a cyanobacterial sucrose-phosphate synthase from Synechocystis sp PCC 6803 in transgenic plants J Exp Bot 54 (381): 223-37 6-phosphate phosphotransferase by phosphate and pyrophosphate Plant physiol 89: 628-633 31 Sugihartor B, Sakakibara H, Sumadi and Sugiyama T (1997) Differential 22 Manickavasagam M, Ganapathi A, Anbazhagan VR, Sudhakar B, Selvaraj N, Expression of Two Genes for Sucrose-phosphate-Synthase in Sugarcane: Vasudevan A, Kasthurirengan S (2004) Agrobacterium-mediated genetic Molecular Cloning of the cDNAs and Comparative Analysis of Gene transformation Expression Plant cell physiol 38: 961-965 and development of herbicide-resistant sugarcane (Saccharum species bybrids) using axillary buds Plant Cell Rep 23: 134-143 32 Wesley SV, Helliwell CA, Smith NA, Wang MB, Rouse DT, Liu Q, 23 Morgan JM (1984) Osmoregulation and water stress in higher plant, Ann Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave Rev Plant physiol 35: 299-319 AP, Green AG, Waterhouse PM (2001) Construct design for efficient, 24 Nguyen-Quoc B, Foyer CH (2001) A role for ‘futile cycles’ involving invertase and sucrose synthase in sucrose metabolism of tomato fruit J Exp Bot 52 (358): 881-9 eddective and high-throughput gene silencing in plants Plant J 27(6): 581-90 33 Worrell AC, Bruneau JM, Summerfelt K, Boersig M, Voelker TA (1991) 25 Ogita S, Uefuji H, Yamaguchi Y, Koizumi N, Sano H (2003) Producing decaffeinated coffee plants Nature 423(6942): 823 Expression of a maize sucrose phosphate synthase in tomato alters leaf carbohydrate partitioning Plant Cell 3(10): 1121-30 26 Quick P, Siegl G, Neuhaus E, Feil R, Stitt M (1989) Sort term water stress 34 Zhangsun D, Luo S, Chen R, Tang K (2007) Improved Agrobacterium- leads to stimulation of sucrose synthesis by activating sucrose-phosphate mediated genetic transformation of GNA transgenic sugarcane Section synthase Planta 177: 535–546 Cellular and Molecular Biology 62 (4): 386-393 27 Salerno GL, Pagnussat GC, Pontis HG (1998) Studies on sucrose phosphate synthase from rice leaves Cell Mol Biol 44(3): 407-16 28 Santosa DA, Hendroko R, Farouk A Greiner R (2004) A rapid and highly efficient method for transformation of sugarcane callus Molecular 35 Zhu YJ, Komor E, and Moore PH (1997) Sucrose Accumulation in the Sugarcane Stem 1s Regulated by the Difference between the Activities of Soluble Acid Invertase and Sucrose Phosphate Synthase Plant Physiol 115(2): 609-616 Biotechnology 28: 113-119 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn PHỤ LỤC Môi trƣờng MS bản: - MS I: KNO3:1900 mg/l; NH4NO3:1650 mg/l; MgSO4.7H2O:370 mg/l; KH2PO4:170 mg/l - MS II: CaCl2.2H2O mg/l - MS III: H3BO3:6,2 mg/l; MnSO4: 22,3 mg/l; ZnSO4: 8,6 mg/l; KI: 0,83 mg/l; Na2MoO4: 0,25 mg/l; CuSO4: 0,025 mg/l; CoCl2: 0,025 mg/l - MS IV:Na2EDTA: 37,3 mg/l; FeSO4.7H2O: 27,8 mg/l - MS V: Glycin: mg/l; Nicotinic: 0,5 mg/l; B1: 0,5 mg/l; B6: 0,5 mg/l Môi trƣờng LB: - LB lỏng: Môi trƣờng LB lỏng: 0,5% (5 g/l) dịch chiết nấm men (Yeast extract), 1% (10 g/l) bacto-Tryptone, 1% (10 g/l) NaCl Hoặc dùng 25g LB bột LB pha sẵn cho 1l LB lỏng - LB đặc: LB lỏng bổ sung 1,5% (15g/l) Bactor-aga Dung dịch đệm tách plasmid: - Sol I: 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM ETDA pH8 - Sol II: 0.2 NaOH, SDS 1% - Sol III: 60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml H20 Các môi trƣờng đƣợc khử áp suất atmotphe 117oC 15 phút Đệm điện di gel agarose: - TAE 50 X (100 ml) : Tris -base 24.2 g, axit axetic 5.71g , EDTA 0.1M pH8 50ml thêm nƣớc đến 100 ml - Đệm tra mẫu (loading buffer): 0,1 ml bromophenol blue 10%; 0,3 ml glycerol 100%, thêm nƣớc cất cho đủ ml Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn