Phân lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn có khả năng phân hủy PHENOL

Header Page of 145 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRẦN THỊ THÚY HẰNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY PHENOL LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs Ts NGUYỄN HỮU HIỆP NĂM 2013 Footer Page of 145 Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013 Trường ĐHCT Header Page of 145 TÓM TẮT Trong số hợp chất thơm, phenol biết đến thành phần phổ biến đất chất thải bị ô nhiễm từ nhiều ngành công nghiệp: nhà máy lọc dầu, dược phẩm, dầu khí, dệt may,…Độc tính phenol gây ảnh hưởng tiêu cực đến người, môi trường, động thực vật sinh vật thủy sinh Phân lập, tuyển chọn nhận diện vi khuẩn có khả phân hủy phenol tạo sở hình thành giải pháp làm môi trường theo hướng sinh học Nghiên cứu thực từ 12/2013- 08/2013 Trong nghiên cứu này, dòng vi khuẩn phân lập môi trường MSB (Minerral salts basal) với phenol nguồn carbon Kết 37 dòng vi khuẩn có khả phân hủy phân lập từ địa điểm Trà Vinh, Vĩnh Long, Cần Thơ Sóc Trăng Trong số đó, 35 dòng có dạng hình que, dòng có dạng hình cầu; 34/37 dòng có khả di động, 3/37 dòng không di động; 29/37 dòng Gram âm, 8/37 dòng Gram dương Ba dòng vi khuẩn P3, P10, P36 có khả phân hủy phenol tốt Sau ngày môi trường có 0,5 g/L phenol, dòng vi khuẩn P3, P10 P36 theo thứ tự phân hủy 39,8%, 95,2% 83,2% phenol Kết giải trình tự gene 16S rRNA xác định dòng P3 Paenibacillus sp., dòng P10 P36 Rhodococcus sp Từ khóa: Paenibacillus sp., phân hủy sinh học, Rhodococcus sp., 16S rRNA, vi khuẩn phân hủy phenol Footer Page of 145 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện Nghiên Cứu Phát triển CNSH Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013 Trường ĐHCT Header Page of 145 ABSTRACT Among aromatic compounds, phenol is known as a common constituent of soil and wastes contaminated from many industries including oil refineries, pharmaceutical, petroleum, textiles and coal refining etc The toxicity of phenol causes negative effects to human, environment, fauna and aquatic organisms Isolation, selection and identification bacterial strains capable of degrading phenol to form the basis of an environmental cleaning solution by biological methods The study was carried out from 12/2013 to 08/2013 In this study, the bacterial strains were isolated in MSB medium (Minerral basal salts) with phenol as sole source of carbon Thirty-seven bacterial strains capaple of degrading phenol were isolated from soil and waste water in Tra Vinh, Vinh Long, Can Tho and Soc Trang provinces Among them, 35 strains were rod shape, trains were globular shape; 34/37 strains were motile, 3/37 strains were not motile; 29/37 trains were gram negative, 8/37 trains were gram positive P3, P10 and P36 could degrade phenol the best After seven days in the medium containing 0,5 g/L of phenol, P3, P10 and P36 could degrade phenol at 39,8%, 95,2% and 83,2%, respectively The results of 16S rRNA sequence analysis showed that P3 strain was Peanibacillus sp and P10, P36 were Rhodococcus sp Key words: Biodegradation, Paenibacillus sp., phenol-degrading bacteria, Rhodococcus sp., 16s rRNA Footer Page of 145 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện Nghiên Cứu Phát triển CNSH Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013 Trường ĐHCT Header Page of 145 MỤC LỤC Trang Tóm tắt iii Abstract iv Chương 1: Giới thiệu .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài Chương 2: Lược khảo tài liệu 2.1 Cấu tạo tính chất phenol 2.2 Nguồn gốc phát sinh chất thải chứa phenol 2.2.1 Nguồn tự nhiên 2.2.2 Nguồn nhân tạo .4 2.3 Tác động phenol đến sức khỏe người, động vật hệ sinh thái 2.3.1 Ảnh hưởng đến sức khỏe người .5 2.3.2 Ảnh hưởng đến động vật 2.3.3 Ảnh hưởng đến hệ sinh thái .6 2.4 Sự phân hủy sinh học phenol vi khuẩn 2.4.1 Vi khuẩn phân hủy phenol .7 2.4.2 Cơ chế phân hủy phenol vi khuẩn 2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình phân hủy phenol 11 Chương 3: Phương tiện phương pháp nghiên cứu 13 3.1 Phương tiện nghiên cứu 13 3.1.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 1313 3.1.2 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 1313 3.1.3 Hóa chất 14 3.1.4 Vật liệu 16 3.2 Phương pháp nghiên cứu 16 3.2.1 Chuẩn bị thí nghiệm 16 Footer Page of 145 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện Nghiên Cứu Phát triển CNSH Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013 Trường ĐHCT Header Page of 145 3.2.2 Phân lập vi khuẩn từ đất nước thải nhiễm phenol 16 3.2.3 Khảo sát số đặc tính dòng vi khuẩn phân lập 16 3.2.4 Tuyển chọn dòng vi khuẩn phân lập có khả phân hủy phenol 19 3.2.5 Kiểm tra khả tổng hợp enzyme dòng vi khuẩn tuyển chọn 20 3.2.6 Khảo sát sinh trưởng vi khuẩn tuyển chọn nồng độ phenol khác 21 3.2.7 Thí nghiệm chứng minh khả phân hủy phenol 22 3.2.8 Nhận diện vi khuẩn kĩ thuật sinh học phân tử 23 Chương 4: Kết thảo luận 25 4.1 Kết phân lập vi khuẩn từ đất nước thải nhiễm phenol 25 4.2 Một số đặc tính dòng vi khuẩn phân lập 26 4.3 Kết tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả phân hủy phenol 30 4.4 Kết khảo sát khả tổng hợp enzyme dòng vi khuẩn tuyển chọn 3030 4.4.1 Khảo sát khả tạo enzyme protease 30 4.4.2 Khảo sát khả tạo enzyme lipase 31 4.4.3 Khảo sát khả tạo enzyme amylase 33 4.4.4 Khảo sát khả tạo enzyme cellulase 33 4.5 Kết khảo sát khả sinh trưởng vi khuẩn tuyển chọn nồng độ phenol khác 34 4.6 Thí nghiệm chứng minh khả phân hủy phenol vi khuẩn 38 4.7 Nhận diện vi khuẩn kĩ thuật sinh học phân tử 40 Chương 5: Kết luận đề xuất 44 5.1 Kết luận 44 5.2 Đề xuất 44 Tài liệu tham khảo 45 Phụ lục 54 Footer Page of 145 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện Nghiên Cứu Phát triển CNSH Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013 Trường ĐHCT Header Page of 145 DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1: Giá trị LD50 số loài động vật cạn Bảng 2.2: Giá trị LD50 số loài động vật thủy sinh Bảng 2.3: Vi khuẩn phân hủy phenol Bảng 3.1: Nồng độ phenol nghiệm thức thí nghiệm 21 Bảng 4.1: Nguồn gốc dòng vi khuẩn phân lập 25 Bảng 4.2: Đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập sau 72 27 Bảng 4.3: Một số đặc tính dòng vi khuẩn phân lập 29 Bảng 4.4: Kích thước vùng sáng vi khuẩn tạo tổng hợp protease 31 Bảng 4.5: Mật số dòng vi khuẩn P3 nồng độ phenol khác 35 Bảng 4.6: Mật số dòng vi khuẩn P10 nồng độ phenol khác 36 Bảng 4.7: Mật số dòng vi khuẩn P36 nồng độ phenol khác 37 Footer Page of 145 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học viii Viện Nghiên Cứu Phát triển CNSH Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013 Trường ĐHCT Header Page of 145 DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1: Công thức cấu tạo phenol Hình 2.2: Sơ đồ chuyển hóa phenol theo đường hiếu khí Hình 2.3: Sơ đồ chuyển hóa phenol theo đường kỵ khí 10 Hình 3.1: Các bước thực quy trình nhuộm Gram 19 Hình 3.2: Đường chuẩn phenol 23 Hình 3.3: Nhiệt độ thời gian phản ứng PCR 24 Hình 4.1: Khuẩn lạc dòng vi khuẩn phát triển sau 72 môi trường MSB agar 26 Hình 4.2: Kết nhuộm Gram số dòng vi khuẩn phân lập 28 Hình 4.3: Sự sinh trưởng dòng vi khuẩn nồng độ 0,5 g/L phenol 30 Hình 4.4: Vòng sáng vi khuẩn có khả tạo enzyme protease sau ngày 31 Hình 4.5: Khả tổng hợp lipase dòng vi khuẩn 32 Hình 4.6: Lipid bị thủy phân dòng vi khuẩn 32 Hình 4.7: Hoạt tính enzyme amylase dòng vi khuẩn sau ngày ủ 33 Hình 4.8: Hoạt tính enzyme cellulase dòng vi khuẩn sau ngày ủ 33 Hình 4.9: Sự tăng trưởng dòng P3 môi trường MSB nồng độ phenol khác 35 Hình 4.10: Sự tăng trưởng dòng P10 môi trường MSB nồng độ phenol khác 36 Hình 4.11: Sự tăng trưởng dòng P36 môi trường MSB nồng độ phenol khác 37 Hình 4.12: Đường chuẩn phenol 38 Hình 4.13: Sự sinh trưởng phân hủy phenol dòng P3 nồng độ 0,5 g/ L 39 Hình 4.14: Sự sinh trưởng phân hủy phenol dòng P10 nồng độ 0,5 g/ L 39 Hình 4.15: Sự sinh trưởng phân hủy phenol dòng P36 nồng độ 0,5 g/ L 40 Footer Page of 145 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ix Viện Nghiên Cứu Phát triển CNSH Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013 Trường ĐHCT Header Page of 145 Hình 4.16: Kết điện di sản phẩm PCR dòng vi khuẩn gel agarose 1% 40 Hình 4.17: Kết trình tự gen 16S rRNA dòng P3 41 Hình 4.18: Kết trình tự gen 16S rRNA dòng P10 42 Hình 4.19: Kết trình tự gen 16S rRNA dòng P36 43 Footer Page of 145 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học x Viện Nghiên Cứu Phát triển CNSH Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013 Trường ĐHCT Header Page of 145 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ATSDT Agency for Toxic Substances and Disease Registry CFU Conoly forming unit CMC Carboxymethylcellulose cm Centimeter CV Coefficient of Variantion ĐKTƯ Đa khoa Trung ương EPA Enviromental Protection Agency g Gam KCN Khu công nghiệp kg Kilogram L Litre LB Luria Bertani LD50 Lethal dose 50 mg Miligam ml Milililer MSB Minerral salts basal MSM Minimal salt medium ng Nanogram NT Nghiệm thức P Phenol PBHC Phân bón hóa chất PCR Polymerase chain reaction ppm Parts per million rRNA Ribosomal ribonucleic acid TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TNHH Trách nhiệm hữu hạn VK Vi khuẩn WHO World Health Organization Footer Page of 145 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học xi Viện Nghiên Cứu Phát triển CNSH Luận văn Thạc sĩ khóa 18 – 2013 Trường ĐHCT Header Page 10 of 145 CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Trong bối cảnh phát triển nhanh chóng xã hội ngày nay, nhu cầu nguyên vật liệu người ngày tăng, kéo theo mở rộng ngành công nghiệp điều tất yếu Song, chất thải nhiều sở sản xuất khu công nghiệp không xử lý triệt để hay chưa xử lý hàng ngày thải môi trường Theo thống kê Tổ chức Y tế giới (WHO) công bố, năm Việt Nam có 20.000 người tử vong sử dụng nguồn nước bị ô nhiễm Theo thống kê Bộ Y tế Việt Nam, 80% bệnh truyền nhiễm nước ta liên quan đến nguồn nước Do đó, ô nhiễm môi trường mối đe dọa chính, thử thách mà nhân loại phải đối mặt Nguồn:http://www.aquapure.com.vn/index.php?option=com_knowledge&view=detail&id=9&Itemid =4&lang=vi Tác nhân gây ô nhiễm môi trường phổ biến bao gồm hợp chất hữu cơ: chất dệt nhuộm, chất tẩy rửa, hóa chất, thuốc sát trùng, thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, hợp chất béo, aromatic,…(Bahnemann, 2004; Vidal, 1998); hợp chất vô kim loại nặng, thủy ngân, bạc, niken, chì, loại khí độc hại,…và sinh vật gây bệnh vi khuẩn, nấm virus (Vinu and Madras, 2010) Trong đó, chất gây ô nhiễm mạnh, độc tính cao phần lớn có chứa nhân vòng thơm Một sản phẩm trung gian chuyển hóa chất nhân vòng thơm thường phenol Từ cho thấy diện phenol môi trường số không nhỏ Phenol chất hữu khó phân hủy, gây hại đến sức khỏe người, động vật ảnh hưởng đến cân sinh thái Theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5945-2005, tiêu chuẩn thải cho phép phenol nhỏ, từ 0,5 – mg/L Trong đó, hàm lượng phenol nước thải nhiều khu công nghiệp, khu chế xuất lại vượt mức cho phép Theo Annadurai et al (2000) nồng độ phenol nước thải mức 10 - 300 mg/L Do đó, việc xử lý chất gây ô nhiễm môi trường phenol thật cần thiết Trong khoảng thập kỷ qua, số phương pháp xử lý phenol tiến hành nghiên cứu, chẳng hạn phân hủy nhiệt, oxy hóa học, oxy hóa quang điện, oxy hóa quang hóa Tuy nhiên phương pháp đòi hỏi chi phí lớn gây ô nhiễm thứ cấp Qua thử nghiệm thực tế, xử lý phương pháp sinh học khẳng định tính ưu việt Đó Footer Page 10 of 145 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu Phát triển CNSH Luận văn Thạc sĩ khóa 18 – 2013 Trường ĐHCT Header Page 11 of 145 giá thành thấp, tiến hành thuận lợi điều kiện tự nhiên, độ an toàn cao thân thiện với môi trường Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên, dòng vi khuẩn có khả phân hủy phenol quan tâm nhà khoa học Vì vậy, đề tài: “Phân lập, tuyển chọn nhận diện vi khuẩn có khả phân hủy phenol” nghiên cứu 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập, tuyển chọn nhận diện vi khuẩn có khả phân hủy phenol tạo sở hình thành giải pháp làm phenol môi trường theo hướng sinh học Footer Page 11 of 145 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu Phát triển CNSH ... dòng vi khuẩn có khả phân hủy phenol quan tâm nhà khoa học Vì vậy, đề tài: Phân lập, tuyển chọn nhận diện vi khuẩn có khả phân hủy phenol nghiên cứu 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập, tuyển chọn nhận. .. dòng vi khuẩn phân lập 16 3.2.4 Tuyển chọn dòng vi khuẩn phân lập có khả phân hủy phenol 19 3.2.5 Kiểm tra khả tổng hợp enzyme dòng vi khuẩn tuyển chọn 20 3.2.6 Khảo... 4.1 Kết phân lập vi khuẩn từ đất nước thải nhiễm phenol 25 4.2 Một số đặc tính dòng vi khuẩn phân lập 26 4.3 Kết tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả phân hủy phenol 30 4.4 Kết khảo sát khả tổng