Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính tăng trưởng, cố định đạm của vi khuẩn Azotobacter – thử nghiệm trên cây trồng

Header Page of 166 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC **** ĐỖ HOÀNH QUÂN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH TĂNG TRƯỞNG, CỐ ĐỊNH ĐẠM CỦA VI KHUẨN AZOTOBACTER – THỬ NGHIỆM TRÊN CÂY TRỒNG LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH MÃ NGÀNH: 60.42.30 HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS PHẠM THỊ ÁNH HỒNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2011 Footer Page of 166 Header Page of 166 Lời cảm ơn Trong khoảng thời gian năm làm luận văn tốt nghiệp, nỗ lực thân, nhận nhiều giúp đỡ từ phía thầy cô Khoa Sinh học, thầy cô môn Sinh hóa quý công ty TNHH Gia Tường, hoàn thành luận văn tốt nghiệp với nhiều cảm xúc khác Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến: Quý thầy cô Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh hóa nhiệt tình giảng dậy, truyền đạt cho em kiến thức, kinh nghiệm nghiên cứu khoa học, chìa khóa giúp em việc hoàn thành đề tài nghiên cứu tốt nghiệp PGS TS Phạm Thị Ánh Hồng, người tận tình hướng dẫn, bảo định hướng cho em suốt thời gian em thực đề tài tốt nghiêp ThS Nguyễn Như Nhứt, Trưởng chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường – Bình Dương, người giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành luận văn tốt nghiệp Cảm ơn anh chị bạn Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường bên cạnh động viên giúp đỡ sớm hoàn thành luận văn tốt nghiệp Con xin tỏ lòng thành kính, biết ơn sâu sắc đến cha, mẹ gia đình tạo điều kiện tốt để học hành điểm tựa vững cho vượt qua khó khăn sống Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng năm 2011 Đỗ Hoành Quân Footer Page of 166 i Header Page of 166 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A Azotobacter IAA Indol acetic acid ATP Adenosin triphosphate ADP Adenosin diphosphate rH2 Lưu lượng khí hydrogen pO2 Áp suất khí oxygen PCR Polymerase chain reaction OD Optical density CFU Colony froming units TB Giá trị trung bình SD Độ lệch chuẩn thực nghiệm Footer Page of 166 ii Header Page of 166 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Các đường cung cấp đạm cho đất chu trình chuyển hóa nitơ Bảng 1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa số loài thuộc chi Azotobacter 11 Bảng 3.3 Giá trị pH mẫu đất 44 Bảng 3.4 Đặc điểm hình dạng khuẩn lạc chủng phân lập 45 Bảng 3.5 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa 20 chủng phân lập 51 Bảng 3.6 Hàm lượng nitơ cố định (mg/l) 20 chủng Azotobacter phân lập môi trường Ashby 52 Bảng 3.7 Mật độ tế bào (CFU/ml) hai chủng Az 03 Az 07 môi trường nuôi cấy khác 59 Bảng 3.8 Hàm lượng nitơ cố định (mg/l) hai chủng Az 03 Az 07 cố định môi trường nuôi cấy khác 61 Bảng 3.9 Mật độ tế bào (CFU/ml) hai chủng Az 03 Az 07 nuôi cấy giá trị pH khác 62 Bảng 3.10 Hàm lượng nitơ cố định (mg/l) hai chủng Az 03 Az 07 cố định nuôi cấy giá trị pH khác 63 Bảng 3.11 Mật độ tế bào (CFU/ml) hai chủng Az 03 Az 07 nuôi cấy loại đường với nồng độ khác 65 Bảng 3.12 Hàm lượng nitơ cố định (mg/l) hai chủng Az 03 Az 07 nuôi cấy loại đường với nồng độ khác 68 Bảng 3.13 Mật độ tế bào (CFU/ml) hai chủng Az 03 Az 07 nuôi cấy môi trường cố bổ sung ion Mn2+ ion Cu2+ nồng độ khác 70 Bảng 3.14 Hàm lượng nitơ cố định (mg/l) hai chủng Az 03 Az 07 nuôi cấy môi trường cố bổ sung ion Mn2+ ion Cu2+ nồng độ khác 71 Bảng 3.15 Mật độ tế bào (CFU/ml) hai chủng Az 03 Az 07 nuôi cấy tốc độ lắc khác 74 Bảng 3.16 Hàm lượng nitơ cố định (mg/l) hai chủng Az 03 Az 07 nuôi cấy tốc độ lắc khác 75 Footer Page of 166 iii Header Page of 166 Bảng 3.17 Mật độ tế bào (CFU/ml) hai chủng Az 03 Az 07 nuôi cấy môi trường có nguồn đạm khác 77 Bảng 3.18 Hàm lượng nitơ cố định (CFU/ml) hai chủng Az 03 Az 07 nuôi cấy môi trường có nguồn đạm khác 79 Bảng 3.19 Mật độ tế bào (CFU/ml) hai chủng Az 03 Az 07 thời điểm nuôi cấy khác 81 Bảng 3.20 Hàm lượng nitơ tổng cố định (mg/l) hai chủng Az 03 Az 07 thời điểm nuôi cấy khác 82 Bảng 3.21 Hàm lượng nitơ cố định tồn chủng Azotobacter đất sau 45 ngày 84 Bảng 3.22 Ảnh hưởng hỗn hợp hai chủng Az 03 Az 07 lên phát triển cải xanh 85 Footer Page of 166 iv Header Page of 166 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ Biểu đồ 3.1 Hàm lượng nitơ tổng 20 chủng Azotobacter cố định môi trường Ashby 53 Biểu đồ 3.2 Khả tăng trưởng chủng Az 03 Az 07 môi trường nuôi cấy khác 60 Biểu đồ 3.3 Khả cố định nitơ chủng Az 03 Az 07 môi trường nuôi cấy khác 61 Đồ thị 3.1 Ảnh hưởng pH lên khả tăng trưởng hai chủng Az 03 Az 07 63 Đồ thị 3.2 Ảnh hưởng pH lên khả cố định nitơ hai chủng Az 03 Az 07 64 Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng loại đường nồng độ đường lên khả tăng trưởng chủng Az 03 66 Đồ thị 3.4 Ảnh hưởng loại đường nồng độ đường lên khả tăng trưởng chủng Az 07 66 Đồ thị 3.5 Ảnh hưởng loại đường nồng độ đường lên khả cố định nitơ chủng Az 03 68 Đồ thị 3.6 Ảnh hưởng loại đường nồng độ đường lên khả cố định nitơ chủng Az 07 69 Đồ thị 3.7 Ảnh hưởng ion Mn2+ ion Cu2+ nồng độ khác lên khả tăng trưởng chủng Az 03 70 Đồ thị 3.8 Ảnh hưởng ion Mn2+ ion Cu2+ nồng độ khác lên khả tăng trưởng chủng Az 07 71 Đồ thị 3.9 Ảnh hưởng ion Mn2+ ion Cu2+ nồng độ khác lên khả cố định nitơ chủng Az 03 72 Đồ thị 3.10 Ảnh hưởng ion Mn2+ ion Cu2+ nồng độ khác lên khả cố định nitơ chủng Az 07 72 Footer Page of 166 v Header Page of 166 Đồ thị 3.11 Ảnh hưởng tốc độ lắc lên khả tăng trưởng chủng Az 03 Az 07 74 Đồ thị 3.12 Ảnh hưởng tốc độ lắc lên khả cố định nitơ chủng Az 03 Az 07 75 Đồ thị 3.13 Ảnh hưởng nồng độ loại đạm lên khả tăng trưởng chủng Az 03 77 Đồ thị 3.14 Ảnh hưởng nồng độ loại đạm lên khả tăng trưởng chủng Az 07 78 Đồ thị 3.15 Ảnh hưởng nồng độ loại đạm lên khả cố định nitơ chủng Az 03 79 Đồ thị 3.16 Ảnh hưởng nồng độ loại đạm lên khả cố định nitơ chủng Az 07 80 Đồ thị 3.17 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả tăng trưởng chủng Az 03 Az 07 81 Đồ thị 3.18 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả cố định nitơ chủng Az 03 Az 07 83 Footer Page of 166 vi Header Page of 166 Mở đầu MỞ ĐẦU  Đặt vấn đề Trong khí quyển, nitơ chiếm gần 80% thể tích, nhiên chúng tồn dạng khí N2 với liên kết cộng hóa trị bền vững (N≡N), thực vật sử dụng trực tiếp Để sử dụng nguồn đạm dồi cần phải phá vỡ liên kết bền vững phân tử N2, tạo loại đạm mà trồng hấp thu Trong công nghiệp sản xuất phân bón hóa học, để phá vỡ liên kết người ta thực phản ứng hóa học điều kiện nhiệt độ, áp suất cao có tham gia nhiều chất xúc tác, dó, việc sản xuất phân bón phương pháp gây tốn kém, gây ô nhiễm môi trường tác động xấu đến sức khỏe người Ngày với phát triển công nghệ sinh học nông nghiệp, việc nghiên cứu tìm cách chuyển hóa để biến nguồn đạm dồi từ khí vào đất mà không tác động đến môi trường sức khỏe người nghiên cứu Một hướng quan trọng hiệu việc sử dụng vi sinh vật có khả cố định đạm nhờ hệ enzyme nitrogenase Azotobacter giống vi sinh vật cố định đạm tự có khả làm giàu nguồn đạm đất - nguồn đạm trồng sử dụng Chúng có khả nhờ trình cố định nitơ sinh học, trình khử N2 không khí thành NH3 tác dụng enzyme nitrogenase Ngoài chúng kích thích hấp thu chất dinh dưỡng khoáng thực vật (NO3-, PO43-, K+, Fe2+), sản sinh chất có khả điều hòa sinh trưởng thực vật (indole 3-acetic acid, indole- lactic acid…) Loài vi sinh vật phân bố rộng rãi đất nước phân bố không đồng số lượng diện không đem lại hiệu cao Do đó, việc phân lập, tuyển chọn chủng giống có hoạt tính cố định đạm cao để bổ sung vào đất trồng trọt khâu quan trọng nhằm nâng cao suất trồng Với lý trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu đặc tính tăng trưởng, cố định đạm vi khuẩn Azoterbacter – Thử nghiệm trồng” Footer Page of 166 -1- Header Page of 166 Mở đầu  Mục tiêu nghiên cứu: Tuyển chọn chủng Azotobacter có hoạt tính cố định đạm cao từ chủng phân lập, nghiên cứu đặc tính tăng trưởng cố định đạm chủng chọn lọc, từ ứng dụng lĩnh vực trồng trọt  Nội dung thực hiện: - Phân lập chủng Azotobacter từ mẫu đất Hà Nội, Lâm Đồng, Đông Nai, Long An, Tiền Giang, Bến Tre - Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa chủng phân lập - Tuyển chọn chủng có hoạt tính cố định đạm cao - Định danh đến loài chủng chọn lọc phương pháp giải trình tự 16S rRNA - Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng lên khả tăng trưởng cố định nitơ chủng chọn lọc - Thử nghiệm hiệu chủng chọn lọc cải xanh (Brassica Juncea) Footer Page of 166 -2- Header Page 10 of 166 PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU Footer Page 10 of 166 Header Page 89 of 166 Kết - Biện luận Bảng 3.18 Hàm lượng nitơ cố định (CFU/ml) hai chủng Az 03 Az 07 nuôi cấy môi trường có nguồn đạm khác Nitơ tổng (mg/l) Nồng độ Chủng Az 03 Az 07 (%) Urea NH4Cl Cao nấm men 0.000 233.21 ±0.31 233.21 ±0.31 233.21 ±0.31 0.001 147.24 ±0.31 133.19 ±0.29 181.97 ±0.28 0.005 124.03 ±0.26 98.73 ±0.13 163.26 ±0.30 0.010 84.67 ±0.39 73.52 ±0.10 137.27 ±0.23 0.015 51.91 ±0.16 48.53 ±0.35 97.77 ±0.19 0.020 22.69 ±0.19 22.39 ±0.20 61.31 ±0.33 0.000 266.45 ±0.50 266.45 ±0.50 266.45 ±0.50 0.001 166.41 ±0.14 193.91 ±0.22 156.24 ±0.50 0.005 157.84 ±0.79 125.19 ±0.58 113.46 ±0.29 0.010 128.92 ±0.08 118.69 ±0.09 84.23 ±0.27 0.015 61.22 ±0.31 91.80 ±0.12 64.45 ±0.20 0.020 55.77 ±0.22 69.70 ±0.18 42.67 ±0.36 250 Nitơ tổng (mg/l) 200 Urea 150 NH4Cl Cao nấm men 100 50 0.000 0.001 0.005 0.010 0.015 0.020 Nồng độ đạm (%) Đồ thị 3.15 Ảnh hưởng nồng độ loại đạm lên khả cố định nitơ chủng Az 03 Footer Page 89 of 166 - 79 - Header Page 90 of 166 Kết - Biện luận 300 Nitơ tổng (mg/l) 250 200 Urea 150 NH4Cl Cao nấm men 100 50 0.000 0.001 0.005 0.010 0.015 0.020 Nồng độ đạm (%) Đồ thị 3.16 Ảnh hưởng nồng độ loại đạm lên khả cố định nitơ chủng Az 07 Khi bổ sung nguồn đạm khác nhau, nồng độ thích hợp khích thích tăng trưởng hai chủng Az 03 Az 07, diện nguồn đạm dù lượng nhỏ (0.01%) làm hoạt tính cố định nitơ hai chủng Az 03 Az 07 giảm Hàm lượng nitơ cố định tỷ lệ nghịch với lượng đạm bổ sung vào môi trường nuôi cấy, điều thể rõ qua bảng số liệu 3.18 đồ thị 3.15, 3.16 Khi không bổ sung hàm lượng nitơ cố định chủng Az 03 233.21 mg/l, chủng Az 07 266.45 mg/l bổ sung nguồn đạm vào môi trường urea 0.01% hàm lượng đạm cố định hai chủng 147.24 mg/l (Az 03) 166.41 mg/l (Az 07); tăng nồng độ urea lên 0.2% hàm lượng đạm cố định 22.69 mg/l (Az 03) 55.77 mg/l (Az 07) Đối với nguồn đạm NH4Cl cao men cho kết tương tự Như vậy, bổ sung nguồn đạm vào môi trường nuôi cấy Az 03 Az 07 làm ức chế khả cố định đạm chúng 3.5.7 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Nuôi cấy chủng Az 03 Az 07 môi trường MT2 với nguồn đường sucrose 2.5% (Az 03), 3% (AZ 07), pH 7.5 bổ sung 0., thời gian nuôi cấy khác nhau, tiến hành xác định mật độ tế bào hàm lượng nitơ cố định dịch nuôi cấy Các kết thu trình bày bảng 3.19 3.20 Footer Page 90 of 166 - 80 - Header Page 91 of 166 Kết - Biện luận Bảng 3.19 Mật độ tế bào (CFU/ml) hai chủng Az 03 Az 07 thời điểm nuôi cấy khác Thời gian Mật độ tế bào x108 (CFU/ml) (giờ) Az 03 Az 07 12 14.28 ±0.03 14.16 ±0.01 24 18.95 ±0.04 14.57 ±0.02 36 21.93 ±0.03 18.30 ±0.03 48 29.39 ±0.09 23.17 ±0.12 60 37.10 ±0.07 29.66 ±0.04 72 40.76 ±0.10 37.84 ±0.57 84 45.11 ±0.51 42.29 ±0.32 96 48.66 ±0.65 48.32 ±0.19 108 50.42 ±0.96 53.71 ±0.12 120 49.89 ±0.47 56.23 ±0.05 132 48.96 ±0.25 63.45 ±0.16 144 42.35 ±0.16 62.50 ±0.40 156 38.82 ±0.02 64.72 ±0.14 168 37.85 ±0.21 58.16 ±0.09 180 35.48 ±0.29 48.46 ±0.30 70 Mật độ tế bào x10 (CFU/ml) 60 50 40 Az 03 Az 07 30 20 10 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180 Thời gian nuôi cấy (giờ) Đồ thị 3.17 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả tăng trưởng chủng Az 03 Az 07 Footer Page 91 of 166 - 81 - Header Page 92 of 166 Kết - Biện luận Qua bảng 3.19 đồ thị 3.17, kết cho thấy thời gian nuôi cấy tăng tạo thành sinh khối hai chủng Az 03 Az 07 tăng, sau giảm dần Đối với chủng Az 03, sinh khôi tăng nhanh khoảng thời gian nuôi cấy từ 12 đến 96 (đây cho pha log), sau mật độ Az 03 thay đổi khoảng thời gian từ 108 -132 (pha ổn định), mật độ tế bào đạt giá trị cao 50.42 x 108 CFU/ml thời điểm 108 Sau thời gian 132 mật độ bắt đầu giảm nhanh chóng (pha suy tan) Tương tự, chủng Az 07, pha log kéo dài hơn, từ 24 đến 132 giờ, pha ổn định từ 132 đến 156 giờ, sinh khối đạt cực đại thời điểm 132 Pha suy tan sau 156 giờ, sau thời gian nuôi cấy này, tế bào bắt đầu chết mật độ tế bào giảm dần Như vậy, thời gian nuôi cấy thích hợp chủng Az 03 108 chủng Az 07 132 Bảng 3.20 Hàm lượng nitơ tổng cố định (mg/l) hai chủng Az 03 Az 07 thời điểm nuôi cấy khác Thời gian Footer Page 92 of 166 Nitơ tổng (mg/l) (giờ) Az 03 Az 07 12 27.20 ±0.17 33.62 ±0.83 24 32.12 ±0.16 50.33 ±0.52 36 54.71 ±0.75 72.36 ±0.18 48 76.06 ±0.57 89.55 ±0.85 60 96.76 ±0.65 102.82 ±0.33 72 120.42 ±0.52 134.21 ±0.81 84 182.04 ±0.64 179.68 ±0.66 96 210.82 ±0.31 223.21 ±0.51 108 246.24 ±0.99 267.57 ±0.63 120 255.93 ±0.51 282.66 ±0.65 132 251.37 ±0.70 292.55 ±0.42 144 253.32 ±0.37 323.52 ±0.68 156 252.47 ±1.23 321.51 ±0.84 168 255.22 ±0.91 324.23 ±0.50 180 252.45 ±0.38 323.75 ±0.50 - 82 - Header Page 93 of 166 Kết - Biện luận 400 Nitơ tổng (mg/l) 300 Az 03 Az 07 200 100 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180 Thời gian nuôi cấy (giờ) Đồ thị 3.18 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả cố định nitơ chủng Az 03 Az 07 Cùng với tăng sinh khối theo thời gian, tích lũy nitơ dịch nuôi cấy nhờ trình cố định đạm hai chủng Az 03 Az 07 (bảng 3.20 đồ thị 3.14) Nitơ tổng dịch nuôi cấy hai chủng tăng dần theo thời gian nuôi cấy, đạt giá trị cao sau 120 nuôi cấy chủng Az 03 (255.93 mg/l) 144 nuôi cấy chủng Az 07 (323.52 mg/l) Sau thời gian nuôi cấy hàm lượng nitơ không tăng mà vào ổn định Điều giải thích sau: với trình tăng sinh khối tích lũy hàm lượng nitơ theo thời gian, chủng vào giai đoạn suy tan, sinh khối không tăng, lượng đạm tích lũy dịch nuôi cấy không bị đi, điều thể rõ đồ thị 3.14, sau 120 nuôi cấy chủng Az 03 144 nuôi cấy chủng Az 07 hàm lượng nitơ đo không thay đổi 3.6 Thử nghiệm khả cố định nitơ hai chủng Az 03 Az 07 đất Tiến hành nuôi cấy hai chủng Az 03 Az 07 môi trường nuôi cấy MT2 với điều kiện thích hợp cho chủng xác định trên, cho đạt mật độ khoảng 109 tế bào/ml Cấy ml dịch tăng sinh vi khuẩn vào đất có độ ẩm 50% hấp khử trùng Footer Page 93 of 166 - 83 - Header Page 94 of 166 Kết - Biện luận trì độ ẩm 50% suốt thời gian thử nghiệm, song song làm mẫu đối chứng thay ml dịch vi khuẩn ml nước cất vô trùng Sau 45 ngày, tiến hành xác định hàm lượng nitơ tổng số mẫu đất kiểm tra mật độ tế bào vi khuẩn cố định đạm có mẫu Kết trình bày bảng sau: Bảng 3.21 Hàm lượng nitơ cố định tồn chủng Azotobacter đất sau 45 ngày Nitơ tổng Mật độ tế bào (mg/kg) x 105 (CFU/g đất) Đối chứng 105.57 ±0.80 0.00 ±0.00 Az 03 119.51 ±0.89 13.33 ±0.62 Az 07 121.34 ±0.68 1.47 ±0.10 Mẫu Qua bảng 3.21, nhận thấy sau 45 ngày hai chủng Az 03 Az 07 có khả tồn cố định nitơ chúng đất chủng Az 07 mật độ tế bào giảm nhiều so với chủng Az 03 (1.47 x 105 CFU/g so với 13.33 x 105 CFU/g), nhiên chủng Az 07 lại cố định lượng nitơ 45 ngày nhiều so với chủng Az 03 (15.77 mg/kg so với 13.94 mg/kg) Như vậy, bổ sung hai chủng vào đất chúng có khả làm giàu nitơ cho đất, sở cho thấy tiềm hai chủng Az 03 Az 07 việc cải tạo đất theo hướng bền vững 3.7 Thử nghiệm ảnh hưởng hỗn hợp hai chủng lên phát triển cải xanh Để biết ảnh hưởng hai chủng lên phát triển cải xanh, tiến hành thử nghiệm ảnh hưởng hỗn hợp hai chủng Az 03 Az 07 (theo tỉ lệ 1: 1) lên phát triển cải xanh, thí nghiệm chia làm lô sau: L0: Bón P2O5, K2O không bón urea L1: Bón P2O5, K2O 50% lượng urea L2: Bón P2O5, K2O 100% lượng urea L3: Bón P2O5, K2O, không bón urea bổ sung Azotobacter (108 CFU/ chậu) L4: Bón P2O5, K2O, 50% lượng urea bổ sung Azotobacter (108 CFU/ chậu) L5: Bón P2O5, K2O, 100% lượng urea bổ sung Azotobacter (108 CFU/ chậu) Footer Page 94 of 166 - 84 - Header Page 95 of 166 Kết - Biện luận Sau 45 ngày trồng, tiến hành xác định tiêu đánh giá: số lá/chậu, khối lượng tươi thân lá, chiều cao cây, chiều dài trọng lượng rễ Kết trình bày bảng 3.20 Bảng 3.22 Ảnh hưởng hỗn hợp hai chủng Az 03 Az 07 lên phát triển cải xanh Lô thí nghiệm Chiều cao thân (cm/cây) Khối lượng Số Chiều dài Khối lượng thân (g/cây) (lá/cây) rễ (cm/cây) rễ (g/cây) Lo 20.20 ±0.23 12.50 ±0.45 6.80 ±0.19 10.10 ±0.28 1.16 ±0.10 L1 23.36 ±0.37 24.24 ±0.57 7.80±0.55 11.98 ±0.12 1.84 ±0.09 L2 25.54 ±0.21 31.62 ±0.58 9.40 ±0.20 15.76 ±0.26 2.70 ±0.05 L3 24.18 ±0.39 25.36 ±0.68 8.40 ±0.12 13.26 ±0.22 2.86 ±0.12 L4 28.58 ±0.28 35.54 ±0.40 9.00 ±0.16 17.00 ±0.26 3.62 ±0.07 L5 31.04 ±0.34 47.64 ±0.30 9.80 ±0.19 16.02 ±0.36 4.58 ±0.06 Các kết thu (bảng 3.20) cho thấy, lượng phân đạm (urea) kết hợp bón phân urea với chủng Azotobacter (Az 03 Az 07) ảnh hưởng tới phát triển cải xanh Nếu so sánh cặp thí nghiệm (lô L0 với L3, lô L1 với L4 lô L2 với L5), nhân thấy, lượng phân đạm (urea) lô thí nghiệm có bổ sung thêm dịch nuôi cấy chủng Azotobacter (L3, L4, L4), kết kích thướcvà trọng lượng thân, chiều dài trọng lượng rễ, số cao đáng kể so với lô không bổ sung Azotobacter (L0, L1, L2) Khi so sánh lô L1 (N50PK) với L3 (N0PK + Azotobacter) thấy, trọng lượng thân hai nghiệm thức gần (L1: 24.24 g/cây, L3: 25.36 g/cây), lô L2 (N100PK) với L4 (N50PK + Azotobacter), cho kết tương tự trọng lượng thân (L2: 31,62 g/cây L4: 35.54 g/cây), cho thấy bổ sung Azotobacter vào đất giảm tới 50% lượng urea Và cải phát triển tốt ghi nhân lô thí nghiệm L5, bón 100% phân đạm kết hợp với chủng Azotobacter, giá trị trung bình chiều cao thân 31.04 cm/cây; trọng lượng thân 47.64 g/cây; số 9.8 lá/cây, chiều dài rễ 16.02 cm/cây; khối lượng rễ 4.58 g/cây, trọng lượng thân tăng 50.66% Các kết nghiên cứu tương tự tác giả B R Chandrasekar cộng (2005) Footer Page 95 of 166 - 85 - Header Page 96 of 166 Kết - Biện luận Echinochloa frumentacea , tăng trưởng tốt kết hợp 100% urea với Azotobacter; hay tác giả Iqbal Umar cộng (2009), dâu tây (Fragariax ananassa), phát triển cho suất tốt bón kết hợp Azotobacter với 100% urea L0 L3 L1 L4 L2 L5 Hình 3.13 Cây cải xanh lô thí nghiệm khác Footer Page 96 of 166 - 86 - Header Page 97 of 166 PHẦN KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ Footer Page 97 of 166 Header Page 98 of 166 Kết luận – Đề nghị 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu trên, rút kết luận sau:  Phân lập, làm 20 chủng vi khuẩn có khả cố định nitơ tự xác định chủng thuộc chi Azotobacter dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào số test sinh hóa  Chọn lọc hai chủng Azotobacter có khả cố định đạm cao chủng Az 03 (155.90 mg/l) Az 07 (164.27 mg/l) môi trường Ashby  Định danh hai chủng Az 03 Az 07 phương pháp giải trình tự 16 S rRNA, cho kết quả: chủng Az 03 thuộc loài: Azotobacter vinelandii Az 07 thuộc loài: Azotobacter beijerinckii  Môi trường tối ưu cho tăng trưởng cố định nitơ chủng Az 03 Az 07 MT2 (mục 2.1.2)  Một số điều kiện nuôi cấy thích hợp chủng Az 03 Az 07 là: Az 03 Điều kiện nuôi cấy Az 07 Tăng sinh Cố định nitơ Tăng sinh Cố định nitơ pH 7.5 7.5 7.5 Nồng độ sucrose (%) 2.5 2.5 3 - - 0.015 0.015 Tốc độ lắc (vòng/phút)(*) 250 200 250 200 Thời gian nuôi cấy (giờ) 108 120 132 144 Nồng độ Mn2+ (%) Ghi chú: (*): nuôi cấy Az 03 Az 07 erlen 250ml, chứa 150ml môi trường nuôi cấy máy lắc vòng  Ion Cu2+ ức chế tăng trưởng cố định nitơ hai chủng Az 03 Az 07  Các nguồn đạm urea, NH4Cl cao nấm men kích thích tăng trưởng hai chủng Az 03 Az 07, chúng lại gây ức chế lên khả cố định nitơ  Nguồn đạm urea với nồng độ 0.01% thích hợp cho tăng trưởng chủng Az 03 nguồn đạm NH4Cl với nồng độ 0.005% thích hợp cho tăng trưởng chủng Az 07 Footer Page 98 of 166 - 87 - Header Page 99 of 166 Kết luận – Đề nghị  Hai chủng Az 03 Az 07 có khả cố định nitơ tốt môi trường đất, với hàm lượng nitơ cố định tương ứng 13.94 mg/kg đất (Az 03) 15.77 mg/kg đất (Az 07)  Khi bổ sung hỗn hợp hai chủng Az 03 Az 07 theo tỷ lệ 1:1 vào đất trồng cải xanh cho thấy, cải xanh phát triển tốt có bổ sung hỗn hợp hai chủng làm giảm 50% lượng đạm bổ sung vào đất Và cải xanh phát triển tốt bón 100% urea + Azotobacter, làm tăng 50.66% trọng lượng thân so với bón 100% urea mà không bổ sung Azotobacter 4.2 Đề nghị Với kết thu trên, nhận thấy cần nghiên cứu thêm số vần đề sau:  Nghiên cứu khả tạo bào xác hai chủng chọn lọc nhằm tăng thời gian bảo quản chế phẩm  Nghiên cứu nuôi cấy bán rắn để thu nhận sinh khối dạng bột thuận tiện cho việc bảo quản vận chuyển  Thử nghiệm hai chủng Az 03 Az 07 quy mô đồng ruộng  Nghiên cứu khả sinh tổng hợp phytohormon (IAA, Gibberellin, Cytokinin) chủng phân lập Footer Page 99 of 166 - 88 - Header Page 100 of 166 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Nguyễn Kim Anh, Phạm Thị Ngọc Hoa, Lê Thị Thúy Hoa, Nguyễn Thị Quỳnh Như, Đậu Thị Tỉnh (2008) Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenase sinh tổng hợp IAA từ đất thôn Bình Kỳ - Hòa Quý – Ngũ Hành Sơn – Tp Đà Nẵng Tuyển tập báo cáo “Hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa học” lần thứ 6, Đại học Sư Phạm Đà Nẵng [2] Lâm Thị Kim Châu, Nguyễn Thượng Lệnh, Văn Đức Chín (1997) Thực tập lớn Sinh hóa Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh, Trang 16 -23 [3] Lê Duy Hoàng Chương (2008) Phân lập định danh vi khuẩn cố định nitơ họ đậu Luận văn tốt nghiệp Đại học, Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh [4] Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiên, Lê Đình Lương, Đoàn Xuân Mượu Phạm Văn Ty (1978) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập III Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật [5] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003) Vi sinh vật học Nhà xuất Giáo Dục [6] Phạm Ngọc Hà (2010) Phân lập, tuyển chọn thu nhận sinh khối vi sinh vật cố định đạm tự Khóa luận tốt nghiệp – Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại Học Nông Lân Tp Hồ Chí Minh [7] Trần Tú Thuỷ, Vũ Thuý Nga, Phạm Văn Toản, Nguyễn Ngọc Quyên, Lê Văn Nhượng, Nguyễn Lan Hương (2005) Sử dụng vi sinh vật cố định đạm phân giải lân để sản xuất phân hữu Viện Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam, Viện công nghệ sinh học-CNTP, Đại học Bách khoa Hà Nội [8] Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Như Thành, Dương Đức Tiến (2004) Vi sinh vật học nông nghiệp Nhà suất Đại học Sư Phạm, trang 179-85 [9] Bùi Trang Việt (2000) Sinh lý thực vật đại cương, phần II: Phát triển Nhà xuất Đại học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh Footer Page 100 of 166 Header Page 101 of 166 TÀI LIỆU TIẾNG ANH [10] Anton Hartmann and Jose Ivo Baldani (2006) The genus Azospirillum, Prokaryote pp 115-140 [11] B.R Chandrasekar, G Ambrose and N Jayabalan (2005) Influence of biofertilizers and nitrogen source level on the growth and yield of Echoniochloa frumentacea (Roxb.) Link Journal of Agricultural Technology Vol 1, No 2, pp 223-234 [12] Dan H Jone (1920) Further studies on the growth cycle of Azotobacter Journal of Bacteriology Vol 5, No 4, pp 325-341 [13] Dhamangaonkar Sachin N (2009) Effect of Azotobacter chroococcum (PGPR) on the growth of Bamboo (Bambusa bamboo) and Maize (Zea mays) plants Biofrontiers Vol 1, Issue 1, pp 24-31 [14] Don J Brenner, Noel R Krieg, James T Staley (2005) Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Springe Second edition, Vol 2, Part B, pp 384-401 [15] Farah Ahmad, Iqbal Ahmad, Mohd Saghir Khan (2004) Indole acetic acid production by the indigenous isolates of Azotobacter and fluorescent Pseudomonas in the presence and absence of tryptophan Turk J Biol Vol 29, pp 29-34 [16] George J Sorger (1968) Regulation of nitrogen fixation in Azotobacter vinelandii OP and in an apparently partially constitutive mutant Journal of bacteriology Vol 95, No 5, pp 1721-1726 [17] Gül Fidan Saribay (2003) Growth and nitrogen fixation dynamics of Azotobacter chroococcum in nitrogen-free and OMW containing medium A thesis submitted to the graduate school of natural and applied sciences of the midde east technical university pp 1-11 [18] G V Mali and M G Bodhankar (2009) Antifungal and phytohormone production potential of Azotobacter chroococcum isolates from Groundnut (Arachis hypogea L.) Asian J exp Sci Vol 23, No 1, pp 293-297 [19] H L Jensen (1954) The Azotobacteriacea Deparment of bacteriology, state laboratory of plant culture, Lyngby, denmark Vol 18, pp 195-209 Footer Page 101 of 166 Header Page 102 of 166 [20] I K Kurdish, Z T Bega, A S Gordienko and D I Dyrenko (2008) The effect of Azotobacter vinelandii on plant seed germination and adhesion of these bacteria to Cucumber roots Applied Biochemistry and Microbiology Vol 45, No 4, pp 400404 [21] Joel Oppenheim and Leon Marcus (1970) Correlation of ultranstructure in Azotobacter vinelandii with nitrogen soure for growth Journal Bacteriology Vol 101, No 1, pp 286-291 [22] Loon LC (2007) Plant response to plant growth-promoting rhizobacteria, Springer Euro Journal Plant Pathology Vol 119, pp 243-254 [23] Martin Dworkin, Stanley Falkow, Eugene, Rosenberg (2006) The Prokaryotes, a handbook on the Biology of Bacteria Springer Third edition, Vol 6, pp 759-784 [24] M Constantiono, R Gomez-Alvarez, J D Alvarez-Solis, V Geissen (2008) Effect of inoculation with rhizobacteria and Arbuscular Mycorrhizal fungi on growth and yield of Capsicum chinense Jacquin Journal of Agriculture and Rural Development in the Tropics and Subtropics.Vol 109, No 2, pp 169-180 [25] M D Socolofsky and Orville Wyss (1961) Cysts of Azotobacter Journal Bacteriology.Vol 81, No 6, pp 946-954 [26] M Mirzakhani, M R Ardakani, F Rejali and A H Shirani (2009) Response of spring safflower to co-inoculation with Azotobacte chroococum and Glomus intraradices under different levels of nitrogen and phosphorus American Journal of Agricultural and Biological Sciences.Vol 4, No 3, pp 255-261 [27] N Mrkovacki, V Milic (2001) Use of Azotobacter chroococcum as potentially useful in agricultural application Annals of Microbiology.Vol 51, pp 145-155 [28] Premsekhar, M and Rajashree, V (2009) Influnece of bio-fertilizers on the growth characters, yiel attributes, yield attributes yield and quality of tomato, American-Eurasian Journal of Sustainable Agriculture Vol 3, No 1, pp 68-70 [29] Ridvan Kizilaya (2009) Nitrogen fixation capacity of Azotobacter spp strains isolated from soils in different ecosystems and relationship between them and the microbiological proprrties of soils Journal of Enviromental Biology Vol 30, No 1, pp 73-82 Footer Page 102 of 166 Header Page 103 of 166 [30] S Ravikumar, K Kathiresan, S Liakath Alikhan, G Prakash Williams and N Anitha Anandha Gracelin (2007) Growth of Avicennia marina and Ceriops decandra seedlings inoculated with halophilic azotobacters Journal of Environmental Biology Vol 28, No 3, pp 601-603 [31] S Ravikumar, K Kathiresan, S Thadedus Maria Ignatiammal, M Babu Selvam, S Shanthy (2004) Nitrogen-fixing azotobacters from mangrove habitat and their utility as their utility as marine biofertilizer Journal of Environmental Marine Biology and Ecology Vol 312, pp 5-7 [32] Samuel S Gnamanickam (2006) Plant- Associated Bacteria Springer pp 712 [33] Suliasih, Sri Widawati (2005) Isolate and identification of Phosphate solubilizing and Nitrogen fixing bacteria from soil in Wamena biological, Garden, Jayawijaya, Papua Biodiversitas Vol 6, No 5, pp 175-177 [34] Winogradsky S (1938) Surla morphologie et l’oecologie des Azotobacter Ann Inst Pasteur Vol 60, pp 351-400 [35] Zahera Abbass and Yaacov Okon (1993) Plant growth promotion by Azotobacter paspali in the rhizosphere oil Boil Biochem Vol 25, No 8, pp 1075-1083 TÀI LIỀU INTERNET [36] http://d.violet.vn/uploads/resources/49/40123/preview.swf [37] http://www.micro.siu.edu/micr425/425notes/12-nitrfix.html [38] http://www.fondriest.com/tech_notes-htm/nitrogencycle.htm [39] http://printfu.org/read/azotobacter-agar-mannitolc38.html?=1qeYpurp6WihSUpOG umKynh63p5dnjysbT5s7glKfczteMl8PG4tbO5OHVl5ah6KeXppHq2Zaj2Kqjmqi W0Org2dnfxrXZ1MqSrdyopaCX04en4rCYrKKH2Obd3q6VpOTc453ezuH [40] http://news.socbay.com/phan_ung_moi_de_pha_vo_cac_lien_ket_hoa_hoc_manh _lien_ket_trong_phan_tu_nitrogen-601858851-201326592 Footer Page 103 of 166 ... trọng nhằm nâng cao suất trồng Với lý trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu đặc tính tăng trưởng, cố định đạm vi khuẩn Azoterbacter – Thử nghiệm trồng Footer Page of...  Mục tiêu nghiên cứu: Tuyển chọn chủng Azotobacter có hoạt tính cố định đạm cao từ chủng phân lập, nghiên cứu đặc tính tăng trưởng cố định đạm chủng chọn lọc, từ ứng dụng lĩnh vực trồng trọt... 2000), cho thấy tăng nồng độ oxy hòa tan tốc độ khuấy làm tăng mật độ tế bào vi khuẩn cố định đạm Azotobacter [8] Tuy nhiên cố định đạm vi khuẩn lại bị ưc chế oxy Ở vi khuẩn hiếu khí, cố định N2 xẩy