PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI XENLULOZ NHẰM ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ BÃ THẢI HOA QUẢ LÀM THỨC ĂN CHĂN NUÔI Chu Thị Thanh Bình, Nguyễn Lân Dũng, Lương Thuỳ Dương Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội. I. MỞ ĐẦU Từ lâu con người đã biết đến nấm men và ứng dụng của chúng trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm. Tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu tập trung vào nấm men phân giải xenluloz, nguyên nhân có thể do trong tự nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật tỏ ra ưu thế hơn so với nấm men về khả năng sinh enzym xenlulaza. Nhưng nếu xét về khả năng chống chịu pH thì nấm men lại tỏ ra ưu thế hơn các nhóm vi sinh vật này. Hàng năm công nghiệp chế biến hoa quả nước ta thải ra hàng trăm ngàn tấn bã thải. Lượng bã thải này hiện nay vẫn chưa được xử lý riêng rẽ mà vẫn được đổ chung với nguồn rác thải thành phố vừa lãng phí vừa gây ô nhiễm môi trường. Nếu lượng bã thải này được xử lý làm thức ăn gia súc hoặc phân bón thì sẽ là một nguồn lợi lớn. Một khó khăn của việc xử lý bã thải hoa quả đó là pH của chúng rất thấp (3-5) [4,6]. Lấy ví dụ bã thải dứa trong công nghiệp sản xuất rượu vang, đồ hộp, bã thải này vừa có pH thấp vừa chứa một lượng lớn xenluloz. Ở pH này thông thường nhóm vi khuẩn và xạ khuẩn không hoặc kém sinh trưởng và phát triển nhưng nhóm nấm men lại hoàn toàn có thể. Đã có một số nghiên cứu sử dụng nấm sợi trong xử lý bã thải hoa quả làm thức ăn gia súc với mục đích bổ sung protein đơn bào [1,2]. Nhóm nấm sợi cũng có khả năng chịu pH nhưng với đặc tính dễ tạo thành bào tử nếu chúng được dùng trong chế biến thức ăn gia súc có thể sẽ gây ra các bệnh về đường hô hấp. Nấm men phân giải xenluloz khi phát triển trên nguồn cơ chất bã thải dứa có pH thấp và giàu xenluloz sẽ chuyển hoá xenluloz thành nguồn protein đơn bào, nếu được dùng làm thức ăn gia súc sẽ rất tốt. Tuy nhiên trong thực tế, số lượng các loài nấm men phân giải xenluloz lại ít hơn nhiều so với nấm sợi, vi khuẩn, xạ khuẩn có cùng chức năng. Nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào phân lập, tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng phân giải xenluloz với hy vọng các chủng được lựa chọn sẽ có triển vọng ứng dụng trong việc xử lý bã thải hoa quả làm thức ăn gia súc. II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vi sinh vật: 343 chủng nấm men bao gồm các chủng phân lập được từ các mẫu bún, gỗ đang phân huỷ, từ bánh men rượu ở xung quanh Hà nội và bộ nấm men phân lập từ trước thuộc Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật. 2.2. Hoá chất và dụng cụ cần thiết: các hoá chất và thiết bị cần thiết cho nuôi cấy và xác định hoạt tính phân giải xenluloz của vi sinh vật 2.3. Các phương pháp nghiên cứu: [5] - Phương pháp xác định khả năng phân giải một số nguồn cacbon bằng phương pháp khuếch tán trên thạch - Các phương pháp xác định đặc tính nuôi cấy của các chủng nấm men - Phương pháp lên men xốp xác định hoạt tính phân giải xenluloz của các chủng nấm men III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tuyển chọn các chủng nấm men phân giải xenluloz: Các chủng nấm men phân lập được từ các mẫu bún, gỗ đang phân huỷ, từ bánh men rượu ở xung quanh Hà nội và bộ giống nấm men thuộc Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật được phân lập từ trước và sơ tuyển bằng phương pháp cấy vạch trên môi trường Hansen với nguồn cacbon là CMC (carboxymethylcellulose) (10g/l). Hoạt tính phân giải CMC của các chủng được dựa vào khả năng tạo vòng phân giải xung quanh vạch sau 2 ngày nuôi cấy khi thử với Lugol. Kết quả sơ tuyển được trình bày ở bảng sau: Bảng 1. Sơ tuyển các chủng nấm men có khả năng phân giải CMC. 32 chủng nấm men có vòng phân giải CMC tiếp tục được kiểm tra khả năng phân giải CMC. Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành đồng thời nuôi cấy các chủng nấm men trên môi trường Hansen có nguồn đường sacaroz và trên môi trường nguồn đường được thay thế bằng CMC để chiết dịch enzym xenlulaza. Một số công trình nghiên cứu đã cho thấy xenlulaza là một enzym cảm ứng, một số nguồn cacbon như glucoz, sacaroz, axetat, xuccinat lại chính là tác nhân ức chế quá trình tổng hợp enzym này [3]. Mục tiêu tuyển chọn tiếp của chúng tôi là chọn ra các chủng vừa sinh trưởng trên nguồn đường sacaroz vừa có khả năng sinh enzym phân giải xenluloz. Điều này gắn liền với mục tiêu chọn ra các chủng vừa có khả năng sinh trưởng trên bã thải hoa quả với hàm lượng đường còn khá cao vừa có khả năng phân giải xenluloz chứa trong các bã thải này. Hoạt tính xenlulaza được xác định bằng phương pháp đục lỗ, khuếch tán trên thạch. Bảng 2 thể hiện kết quả của thí nghiệm này: Bảng 2. Hoạt tính xenlulaza của các chủng nấm men được chọn Kết quả cho thấy rõ ràng có những chủng có hoạt tính xenlulaza cao khi nuôi cấy trên môi trường có chứa CMC nhưng hoạt tính này lại rất thấp hoặc thậm chí không có hoạt tính khi nuôi trên môi trường có chứa sacaroz. Điều này phù hợp với một số kết quả nghiên cứu trước đây [3]. 11 chủng có hoạt tính xenlulaza khi nuôi cấy trên 2 loại môi trường trên và 7 chủng khác không có hoạt tính xenlulaza khi nuôi trên môi trường có chứa sacaroza nhưng lại có hoạt tính cao khi nuôi trên môi trường có chứa CMC tiếp tục được thử khả năng phân giải một số nguồn cacbon khác: Avicel, xenluloz. Kết quả được thể hiện trên bảng 3. Bảng 3. Hoạt tính phân giải một số nguồn cacbon của các chủng nấm men được chọn. 5 chủng nấm men 9B1, 30B1, 97m, VTCC 2.0243, 4B2 có hoạt tính phân giải Avicel và xenluloz cao nhất được chọn để tiếp tục các thử nghiệm sau này. 3.2. Nghiên cứu một số đặc điểm nuôi cấy của các chủng nấm men được lựa chọn Các thí nghiệm này phục vụ cho mục đích nghiên cứu tạo dạng “giống khởi động” (starter culture) cho quá trình xử lý bã thải hoa quả giàu xenluloz từ các chủng nấm men được lựa chọn 3.2.1. Ảnh hưởng của pH nuôi cấy ban đầu 5 chủng nấm men được nuôi cấy trên môi trường chứa CMC với các thang pH từ 3 đến 6. Nuôi cấy lắc 220 vòng/phút, ở 300C. Sau 3 ngày nuôi cấy, xác định hoạt tính CMC-aza của các chủng nấm men. Kết quả được thể hiện trên hình 1. Hình 1. Ảnh hưởng của pH ban đầu tới hoạt tính xenlulaza của nấm men Kết quả cho thấy tất cả 5 chủng đều có khả năng tổng hợp enzym xenlulaza trong dải pH môi trường nuôi cấy là 4,0 - 6,0 nhưng pH tối ưu nhất là 5,0. Chủng 97m có hoạt tính cao nhất trong số 5 chủng. Chủng VTCC 2.0243 và 4B2 tuy có hoạt tính không cao bằng các chủng khác nhưng nó lại có thể phát triển trên môi trường có pH ban đầu 3,0 và 3,5. Như vậy chúng có thể phát huy được vai trò khi xử lý các bã thải có pH thấp (3-3,5). 3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Các chủng nấm men được nuôi cấy lắc trong môi trường chứa CMC, pH 5,0; 220 vòng/phút ở các thang nhiệt độ từ 200C - 450C. Sau 3 ngày xác định hoạt tính CMC-aza. Kết quả được ghi ở hình 2. Hình 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzym của các chủng nấm men. Kết quả cho thấy các chủng nấm men được chọn để nghiên cứu đều không phải là các chủng nấm men ưa nhiệt. Chúng phát triển thích hợp nhất ở nhiệt độ 30 - 350C tùy từng chủng. Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp của các chủng 9B1, 97m, 30B1 là 300C; còn của các chủng 4B2, VTTC 2.0243 là 350C. Ở nhiệt độ cao (40 - 450C), hoạt tính của các chủng đều giảm, thậm chí có chủng mất hoạt tính hoàn toàn như các chủng 97m và 30B1. 3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Hình 3. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng tổng hợp enzym của nấm men Các chủng 9B1, 97m, 30B1 được nuôi cấy lắc ở 300C còn chủng 4B2 và VTCC 2.0243 được nuôi ở 350C; pH 5,0. Sau mỗi ngày xác định hoạt tính phân giải CMC, đồng thời xác định sinh khối tế bào thông qua hàm lượng protein. Kết quả được thể hiện trên hình 3 và hình 4. Hình 4. Sự thay đổi hàm lượng protein của các chủng nấm men theo thời gian Như vậy thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tổng hợp enzym xenlulaza. Sau ngày nuôi cấy đầu tiên, chủng VTCC 2.0243 đã đạt được hoạt tính lớn nhất. Chủng 4B2 đạt được hoạt tính cao nhất bắt đầu từ ngày nuôi cấy thứ hai. Các chủng còn lại đều đạt hoạt tính cao nhất vào ngày nuôi cấy thứ ba. Qua ngày thứ ba, hoạt tính của tất cả các chủng đều giảm dần có thể do sinh trưởng của nấm men giảm dần, nguồn dinh dưỡng cạn dần hoặc do xenlulaza bị thủy phân Riêng chủng 97m có hoạt tính CMC-aza cao nhất vào ngày thứ ba nhưng hàm lượng protein lại đạt giá trị lớn nhất vào ngày thứ tư, có thể do nguồn dinh dưỡng trong môi trường vẫn còn nhưng chất cảm ứng tổng hợp xenlulaza lại hết. Các kết quả nghiên cứu trên đây đã lần lượt trả lời được các câu hỏi: ở điều kiện nhiệt độ, pH nào, thời gian nuôi cấy bao lâu để hoạt tính phân giải xenluloz của các chủng nấm men cao nhất đồng thời đạt được sinh khối tế bào cao nhất. Các kết quả này rất quan trọng trong việc sản xuất “giống khởi động”, là tập hợp của các chủng nấm men được tuyển chọn, dùng trong chế biến thức ăn gia súc từ phế thải của các nhà máy chế biến hoa quả, đặc biệt là nhà máy chế biến dứa. 3.3. Khả năng phân giải xenluloz tự nhiên 3.3.1. Thăm dò khả năng phân giải xenluloz trong bã thải dứa của các chủng nấm men Các chủng nấm men được nuôi cấy trên môi trường có nguồn xenluloz tự nhiên là bã thải dứa. Sau 3 ngày nuôi cấy, kết quả thu được như sau: Bảng 4. Hoạt tính phân giải nguồn xenluloz tự nhiên của các chủng nấm men Trong thực tế, rất nhiều chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải xenluloz hòa tan (CMC) nhưng lại không có khả năng phân giải nguồn xenluloz tự nhiên hoặc phân giải rất kém nhưng kết quả nghiên cứu cho thấy cả 5 chủng nấm men được tuyển chọn đều có khả năng phân giải nguồn cơ chất tự nhiên là bã dứa tuy hoạt tính không cao như khi nuôi cấy trên môi trường có chứa xenluloz hòa tan. Mặc dù vậy, đây là một kết quả có ý nghĩa bởi nó giúp khẳng định rằng các chủng nấm men được tuyển chọn có thể được ứng dụng trong xử lý bã thải dứa giàu xenluloz làm thức ăn chăn nuôi. 3.3.2. Khả năng tích lũy sinh khối và hoạt tính xenlulaza của các chủng nấm men khi nuôi trên nguồn cơ chất bã dứa “Giống khởi động” là hỗn hợp của các chủng nấm men trên được tạo ra dưới dạng bột khô. Sử dụng dạng bột khô này cấy vào bã thải dứa với các tỷ lệ 1/100, 1/1000, 1/10.000 nhằm tìm ra tỷ lệ giống cấy thích hợp sao cho vừa đạt được sinh khối tế bào lớn nhất vừa có hoạt tính phân giải xenluloz trong bã dứa cao nhất. Kết quả sự biến đổi sinh khối tế bào theo thời gian được thể hiện trên bảng 5 và thể hiện rõ hơn trên hình 5 Bảng 5. Số lượng tế bào biến đổi theo ngày trong các mẫu bã dứa được cấy “giống khởi động” với các tỷ lệ khác nhau Hình 5. Sự biến đổi sinh khối tế bào theo thời gian với các tỷ lệ giống cấy khác nhau Có thể thấy sinh khối tế bào lớn nhất ở ngày thứ 8 ở cả 3 tỷ lệ giống cấy. Với tỷ lệ cấy 1/100, số lượng tế bào đạt lớn nhất. Song song với việc theo dõi sự thay đổi của sinh khối tế bào chúng tôi còn xác định sự thay đổi của hoạt tính phân giải xenluloz ở các mẫu. Kết quả được trình bày ở bảng 6 Bảng 6. Hoạt tính phân giải xenluloz của nấm men với các mẫu bã dứa Bảng 6 cho thấy trong 2 ngày đầu, các chủng nấm men chưa phát huy được hoạt tính phân giải xenluloz mà chúng cần phải có thời gian sinh trưởng và thích nghi. Hoạt tính này tăng dần từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 8 và giảm ở ngày thứ 10. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu về sự biến dổi của sinh khối tế bào. Ở đây ta cũng thấy với tỷ lệ giống cấy 1/100 thì hoạt tính phân giải xenluloz là lớn nhất, nhưng chỉ lớn hơn một chút so với mẫu có tỷ lệ giống cấy 1/1000. Tuy nhiên khi ra thực tế sản xuất thì cần phải cân nhắc về khía cạnh kinh tế nên phải chọn tỷ lệ giống như thế nào để vừa đảm bảo được chất lượng sản phẩm mà cụ thể là sinh khối tế bào (hay chính là hàm lượng protein chứa trong sản phẩm), giảm hàm lượng xenluloz trong thức ăn, vừa tiết kiệm được chi phí đầu vào cho sản xuất. Vì vậy cần phải cân nhắc giữa tỷ lệ giống cấy 1/100 hay 1/1000 xem tỷ lệ nào là phù hợp với mục tiêu sản xuất. Để ứng dụng các chủng nấm men này trong thực tế xử lý bã thải dứa làm thức ăn chăn nuôi còn cần tiến hành rất nhiều nghiên cứu sâu hơn nữa ở quy mô trong và ngoài phòng thí nghiệm. IV. KẾT LUẬN 1. Từ 343 chủng nấm men phân lập được kết hợp với bộ giống nấm men của Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật, 5 chủng nấm men có hoạt tính phân giải xenluloz cao nhất với ký hiệu 9B1, 30B1, 97m, VTCC 2.0243, 4B2 đã được tuyển chọn. 2. Đã xác định được các điều kiện nuôi cấy thích hợp như pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy cho các chủng nấm men được tuyển chọn 3. Bước đầu thử nghiệm nuôi các chủng nấm men trên nguồn cơ chất tự nhiên là bã dứa cho thấy các chủng đều có hoạt tính xenlulaza và sinh trưởng mạnh trên nguồn cơ chất này tạo ra lượng sinh khối tế bào đáng kể. Kết quả này mở ra một hướng nghiên cứu tiếp, đó là ứng dụng các chủng nấm men trong chế biến bã thải hoa quả giàu xenluloz làm thức ăn chăn nuôi. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Berk Z. Production of feed as an objective for bioconversion systems. In: Bioconversion of organic residues for rural communities. Tokyo, Japan: United Nations University, p:23-25. 1979. 2. Guerra NB, Stamford TLM, de Medeiros RB, de Freitas CP, Maia SR, Cavalcante ML. Protein enrichment of pineapple waste for animal feeds. Food Nutr. Bull.;8(1):77-80. 1986. 3. Izuka, M. et al. Screening for microorganisms producing cellulose-degrading enzyme and producing oligosaccharides from cellulose. Annul.Reports I.C.Biotechnol, 14: 350. 1991. 4. Morton, J and Miami, F.L. Pineapple. In: Fruits of warm climates. p. 18–28. 1987. 5. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Văn Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học. Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, p. 325-378. 1972. 6. Stanton R. Bioconversion of fruit and vegetable wastes. In: Bioconversion of organic residues for rural communities. Tokyo, Japan: UN University, p: 120-121. 1979. . tính phân giải xenluloz của các chủng nấm men III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tuyển chọn các chủng nấm men phân giải xenluloz: Các chủng nấm men phân lập được từ các mẫu bún, gỗ đang phân. các loài nấm men phân giải xenluloz lại ít hơn nhiều so với nấm sợi, vi khuẩn, xạ khuẩn có cùng chức năng. Nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào phân lập, tuyển chọn các chủng nấm men có khả. ở bảng sau: Bảng 1. Sơ tuyển các chủng nấm men có khả năng phân giải CMC. 32 chủng nấm men có vòng phân giải CMC tiếp tục được kiểm tra khả năng phân giải CMC. Trong thí nghiệm này chúng