Báo cáo " PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC TỪ NEM CHUA TRUYỀN THỐNG LÀM GIỐNG KHỞI ĐỘNG NEM CHUA PROBIOTIC " potx

Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 149 PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC TỪ NEM CHUA TRUYỀN THỐNG LÀM GIỐNG KHỞI ĐỘNG NEM CHUA PROBIOTIC Nguyễn Hoài Hương 1 , Dương Thúy Vy 1 , Trần Linh Châu 2 , Đoàn Kim Như 1 1 Khoa Môi trường & Công nghệ Sinh học, Trường ĐH Kỹ thuật Công nghệ TP.HCM 2 Khoa Công nghệ thực phẩm, Trường ĐH Kỹ thuật Công nghệ TP.HCM TÓM TẮT Các vi khuẩn lên men lactic đƣợc phân lập từ nem chua truyền thống Ninh Hòa, Thủ Đức, Lai Vung trên môi trƣờng MRS chứa 0.2% Na-azide và định danh đến cấp giống Lactobacillus bằng phƣơng pháp nuôi cấy tuân theo khóa phân loại Bergey. Để làm vi sinh vật khởi động sản xuất nem chua, các vi khuẩn phân lập đƣợc tuyển chọn theo hoạt tính probiotic: khả năng kháng khuẩn tổng quát, khả năng kháng khuẩn sau khi loại bỏ tác nhân sinh acid, khả năng chịu acid và muối mật cũng nhƣ theo các tiêu chuẩn khác dành cho giống khởi động lên men thịt nhƣ hoạt tính protease, không sinh bioamine, tốc độ lên men lactic, khả năng tạo giá trị cảm quan truyền thống. Kết quả cho thấy kết hợp giữa Lactobacillus T13 từ nem Ninh Hòa và LactobacillusT3từ nem Thủ Đức theo tỉ lệ 1:1 cho kết quả nem chua đạt yêu cầu về vệ sinh an toàn thực phẩm và cảm quan, hơn nữa với mật độ LAB sống 10 8 cfu/g, đạt tiêu chuẩn về thực phẩm probiotic. Từ khóa: giống khởi động, thịt lên men, thực phẩm probiotic, vi khuẩn lên men lactic (LAB). ĐẶT VẤN ĐỀ Nem chua là sản phẩm thịt lên men truyền thống của Việt Nam và các nƣớc Đông Nam Á đƣợc đánh giá cao về giá trị cảm quan và dinh dƣỡng. Sản xuất nem chua truyền thống ở Việt Nam hiện nay theo hai hƣớng: hƣớng thứ nhất không cấy vi sinh vật khởi động mà chủ yếu dựa vào vi khuẩn lactic có sẵn trong thịt hay trong lá cây gói kèm; hƣớng thứ hai sử dụng giống khởi động từ nem chua mẻ trƣớc. Hai phƣơng thức sản xuất này dẫn đến chất lƣợng nem chua không đồng đều về cảm quan và vệ sinh an toàn thực phẩm. Những năm gần đây, với xu thế công nghiệp hóa các sản phẩm truyền thống, nem chua sản xuất tại các cơ sở sản xuất lớn và nhà máy sử dụng giống khởi động nhập khẩu từ nƣớc ngoài nhƣ Danisco (Đan Mạch) (Truong et al., 2007). Vi khuẩn khởi động thịt lên men nhập khẩuthƣờng bao gồm hỗn hợp vi khuẩn lên men lactic (LAB) và một số vi khuẩn khác nhằm sản xuất thịt lên men châu Âu, cho một chất lƣợng đồng nhất nhƣng cảm quan không đạt yêu cầu cho ngƣời Việt Nam. Quy trình lên men thịt châu Âu thƣờng bao gồm hai quá trình: quá trình lên men lactic và quá trình chín hay lên men phụ để tạo hƣơng vị. Trong khi đó,sản xuất nem chua Việt Nam chỉ gồm quá trình lên men lactic. Toàn bộ giá trị cảm quan của sản phẩm phụ thuộc vào quá trình này. Do đó LAB trong nem chua Việt Nam hẳn phải có nhiều đặc điểm khác biệt so với LAB trong giống khởi động châu Âu.Ý thức đƣợc điều này và nhằm bảo tồn nguồn tài nguyên vi sinh vật Việt Nam,nhiều nhà nghiên cứu trong và ngoài nƣớc đã quan tâm đến phân lập, định danh và nghiên cứu đặc điểm của LAB từ nem chua ở Việt Namnhƣ Ho và đồng tác giả, 2007, Nguyen và đồng tác giả, 2010 và Tran và đồng tác giả,2011. Gần đây nhiều nghiên cứu còn cho thấy các vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ thịt lên men có khả năng chịu acid, muối mật, sinh bacteriocin tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh thực phẩm nhƣ E. coli, Salmonella, Staphylococcusaureus và Listeria monocytogenes(De Vuyst et al., 2008). Thực phẩm lên men ngày càng đƣợc ƣa chuộng vì khả năng cung cấp vi khuẩn sống cho hệ vi sinh đƣờng ruột (Heller, 2001). Xu hƣớng sản xuất thực phẩm chứa vi sinh vật có ích sống sót qua đƣờng tiêu hóa hay còn đƣợc gọi là thực phẩm probiotic cũng đang đƣợc quan tâm(Mattila- Sandholm et al.,2002). Thịt lên men đƣợc đánh giá là ―chất mang‖ thích hợp đối với vi khuẩn probiotic (Hammes et al.,2008). Nghiên cứu sử dụng LAB phân lập từ nem chua làmvi sinh vật khởi động cũng bắt đầu đƣợc quan tâm ở Việt Nam (Ho et al.,2009). Thêm một bƣớc nữa chúng tôi quan tâm đến việc sản xuất Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 150 giống khởi động nem chua có hoạt tính probiotic. Đó là mục tiêu nghiên cứu của nhóm chúng tôi, bao gồm nội dung nhƣ sau: - Phân lập vi khuẩn lên men lactic trong các sản phẩm nem chua truyền thống - Tuyển chọn vi khuẩn lactic này theo tiêu chuẩn probiotic và giống khởi động nem chua. - Sử dụng vi khuẩn lactic tuyển chọn để sản xuất nem chua probiotic. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Vi khuẩn lactic đƣợc phân lập từ các nem chua truyền thống nem Ninh Hòa (Nha Trang) - ký hiệu T13, nem Thủ Đức (TP. HCM) - ký hiệu T3, nem Lai Vung (Đồng Tháp), ký hiệu N8. Một chủng Lactobacillus rhamnosus (L.R) đƣợc phân lập từ chế phẩm probiotics dƣợc phẩm cho ngƣời. Môi trƣờng phân lập: thạch MRS chứa 0.02 % Na-azide. Để sàng lọc vi khuẩn lactic, sơ đồ thử nghiệm đƣợc thiết lập theo Khóa phân loại Bergey xuất bản lần 2 (Hammes, Hertel, 2006). Các phƣơng phân tích vi sinh cổ điển nhƣ nhuộm Gram, nhuộm bào tử, nhuộm kháng acid, thử nghiệm catalase, thử nghiệm acid lactic, khả năng di động, khả năng lên men đƣợc đƣợc tiến hành theo các phƣơng pháp thông dụng (Benson, 2001). Lên men đƣờng đƣợc tiến hành trong môi trƣờng MRS chứa đƣờng thích hợp và sử dụng bromocresol green làm chất chỉ thị màu. Tăng sinh chủng phân lập trong canh MRS, giữ giống trong thạch MRS. Thử nghiệm đối kháng đối với E. coli và Salmonellaspp. đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp đo độ đục (Skytta, Sandholm,1991). Khả năng chịu acid: vi khuẩn phân lập tăng sinh sau 18 h, cấy chuyền sang môi trƣờng MRS pH 2.0, ủ 1, 2 giờ ở 37oC , sau đó trải đĩa và đếm khuẩn lạc sau 48 giờ ủ ở 37oC (Tuomola et al.,2001) Khả năng chịu muối mật: vi khuẩn phân lập tăng sinh sau 18 h, cấy chuyền sang môi trƣờng MRS chứa 0.3% cao mật bò (Ox bile), ủ 1, 2 giờ ở 37oC , sau đó trải đĩa và đếm khuẩn lạc sau 48 giờ ủ ở 37oC (Tuomola et al.,2001). Hoạt tính protease: đo đƣờng kính vòng phân giải bằng kỹ thuật đục lỗ giếng thạch trên đĩa thạch chứa cơ chất protease là gelatin, casein và protein tác chiết từ thịt theo tính quy trình (Fransen et al., 1997). Khả năng tiết decarboxylase đƣợc kiểm tra sử dụng canh Lysine decarboxylase và Ornithine decarboxylase. Các sản phẩm tạo ra làm tăng pH môi trƣờng và đổi màu chất chỉ thị chỉ thị bromocresol purple (5,2 – 6,8) (Moeller, 1954). Nem chua thí nghiệm có thành phần nguyên liệu nhƣ sau: thịt nạc 1000 g, đƣờng cát vàng 300 g, muối (NaCl chứa 0.5% NaNO 2 ) 20 g, bột ngọt 7 g, tiêu 10 g, tỏi 35g, ascorbic acid 5 g,da heo (bì) 200 g. Chuẩn bị vi sinh vật khởi động: tăng sinh trong canh MRS, 18 giờ ở 37oC, cấy tạo mật độ xác định. Nồng độ tế bào đƣợc xác định bằng cach đo OD 610 nm và suy ra đơn vị nồng độ cfu/ml nhờ đƣờng chuẩn đƣợc thiết lập dựa trên phƣơng pháp định lƣợng bằng trải đĩa và và đo OD 610nm đƣợc tiến hành đồng thời trên một huyền phù tế bào. Acid tổng đƣợc xác định bằng cách chuẩn độ, tổng vi khuẩn lactic xác định bằng phƣơng pháp chuẩn độ sử dụng NaOH 0.1 N, phenolphthalein là chất chị thị và tính theo acid lactic. Đánh giá cảm quan bằng phƣơng pháp so hàng(Garrigaet al.,1996, Lawless, Heymann, 2010). Xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân lập vi khuẩn lactic từ nem chua Vi khuẩn lactic trong các sản phẩm nem chua (Bảng 1) đƣợc tăng sinh và phân lập trên môi trƣờng MRS chứa 0.02% Na-azide với mục đích ức chế một số vi khuẩn hiếu khí tồn tại trong nem, nhƣ Bacillus spp.,Pseudomonas spp., trong khi Lactobacillus spp. và Streptococcus spp. vẫn tăng Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 151 trƣởng với nồng độ Na-azide 0,02%(Lichstein, Soule, 1944). Việc cấy chuyền sang thạch MRS nhằm loại bỏ vi khuẩn kị khí bắt buộc (Hình 1). Hình 1. Sơ đồ phân lập sàng lọc vi khuẩn lactic trong nem chua Bằng các phƣơng pháp nuôi cấy và phép thử cổ điển, các dạng vi khuẩn sau đây đƣợc loại bỏ khỏi bộ sƣu tập chủng thuần khiết nhƣ nhuộm Gram, nhuộm bào tử, nhuộm kháng acid, thử nghiệm catalase, thử nghiệm khả năng tổng hợp lactic acid và thử nghiệm khả năng di động. Theo Khóa phân loại Bergey xuất bản lần 2 (Hammes, Hertel,2008), vi khuẩn lên men lactic gồm các vi khuẩn hình que và hình cầu.Vi khuẩn hình que chủ yếu thuộc giống Lactobacillus và Carnobacterium,tuy nhiên Carnobacteriumspp. không thể tăng trƣởng ở pH 4.5 nên nem chua không phải là ổ sinh thái tự nhiên của vi khuẩn này. Lactobacillus đƣợc mô tả là những vi khuẩn hình que Gram dƣơng, không sinh bào tử, không kháng acid, không có cytochrome nên phản ứng catalase âm tính, tổng hợp lactic acid và không di động. Kết quả cho thấy một bộ sƣu tập các vi khuẩn phân lập đƣợc từ ba loại nem truyền thống, phần lớn có khuẩn lạc màu trắng sữa đục, lồi, vi khuẩn Gram dƣơng có chiều dài khác nhau (Bảng 1). Kết quả phân lập trình bày trong Bảng 1 cũng cho thấy rõ ràng là mỗi một loại nem truyền thống với tên gọi xuất xứ hàng hóa khác nhau chứa LAB khác nhau, do đó đều có hƣơng vị đặc trƣng riêng. Hình thái khuẩn lạc tƣơng tự nhƣ probiotic Lb.rhamnosus, trong khi chiều dài tế bào có khác biệt. Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 152 Bảng 1.Hình thái khuẩn lạc (40X) và hình thái tế bào (1000 X) Chủng phân lập Hình thái khuẩn lạc (nhìn thẳng) Hình thái khuẩn lạc (nhìn nghiêng) Hình thái tế bào T13 (Ninh Hòa) Khuẩn lạc tròn, to, nhẵn bóng, màu trắng sữa, lồi nhiều, không có núm. Vi khuẩn hình que thon, dài. T3 (Thủ Đức) Khuẩn lạc tròn, to, nhẵn bóng, màu trắng đục, lồi nhiều, không có núm. Vi khuẩn hình que ngắn N8 (Lai Vung) Khuẩn lạc tròn, to, nhẵn bóng, trắng đục,mép trơn đều, lồiít. Vi khuẩn hình que rất ngắn. L.R (chế phẩm) Khuẩn lạc tròn, to, nhẵn bóng, màu trắng đục, lồi ít, không có núm.Vi khuẩn hình que nhỏ, rất ngắn. Khả năng lên men đƣờng đồng hình và dị hình của vi khuẩn lactic phân lập từ thịt đƣợc quan tâm. Lên men dị hình ngoài lactic acid tạo cấu trúc gel,còn sinh CO 2 và ethanol, cũng nhƣ aldehyte, diacetyl, acetoin và acid béomạch ngắn có ảnh hƣởng nhiều đến cảm quan sản phẩm (Cocconcelli, Fontana, 2008). Hình 2 và bảng 2 cho thấy các vi khuẩn phân lập có khả năng lên men đƣờng tổng hợp acid với nồng độ khácnhau,đa số đều lên men dị hình. Hình 2.Khảo sát khả năng lên men đƣờng và sinh khí của chủng LAB phân lập ĐC 1 2 3 Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 153 ĐC: Đối chứng- không đổi màu và không sinh khí – không lên men (-/-) 1 – Xanh nhạt ít đổi màu và sinh khí – lên men tổng hợp ít acid (+/+) 2 - Xanh lá cây và sinh khí – lên men tổng hợp acid trung bình (++/+) 3 – Màu đổi từ xanh sang vàng (pH <3.8) – sinh khí – lên men tổng hợp nhiều acid (+++/+). Bảng 2.Khả năng lên men đƣờng của một số chủng phân lập Chủng T13 T3 N8 L.R Đƣờng Khả năng lên men đƣờng/sinh khí Glucose +++/+ +++/+ +/+ +/+ Mannitol ++/+ +++/+ ++/ + +/+ Xylose +/+ ++/+ +/ + -/- Maltose +++/+ +++/+ +++/+ +/+ Lactose -/- +/+ +++/ + +/- Sucrose +++/+ +++/+ +++/+ ++/+ Bảng 2 cho thấy các chủng phân lập từ nem chua truyền thống đều có khả năng lên men đƣờng glucose sinh khí, đặc biệt T13 và T3 lên men glucose rất mạnh, sinh acid làm pH giảm xuống 3.8 làm canh trƣờng chuyển từ màu xanh dƣơng sang màu vàng rõ rệt. Những vi khuẩn này đều thuộc loại lên men dị hình, giải thích tại sao nem chua truyền thống có hƣơng vị đặc trƣng mà không trải qua quá trình chínnhƣ thịt lên men châu Âu. Các chủng từ nem đều lên men maltose và sucrose, đặc biệt sucrose,phù hợpvới thói quen bổ sung khá nhiều đƣờng trong nemchua NamViệt Nam. Rất ít loài Lactobacillusspp. lên men mannitol và xylose, nên có thể thu hẹp phạm vidự đoán các lòai vi khuẩn phân lập trong phạm vi Lb.salivarus, Lb.plantarumhoặc Lb.brevis (Hammers và Hertel,2006). Theo Ho và đồng tác giả, 2007,25.19% LAB phân lập đƣợc từ nemchua truyền thống là Lb. brevis, 21.37% là Lb.plantarum,còn lại là cầu khuẩn nhƣ 14.50% Leuconostoc mesenteroides dextranicum, 12.21% Pediococcus pentosaceus và 11.45% Lactococcus lactis. Trong khi đó Tran và đồng tác giả, 2010 lại phân lập đƣợc từ nem chua 67.6% Lb. plantarum, sau đó là P.pentosaceus (21.6%) vàLb.brevis(9.5%). Trên thực tế từ nem chua truyền thống nêu trên chúng tôi phân lập đƣợc hàng loạt vi khuẩn lên men lactic nhƣng chúng tôi chỉ quan tâm đến những vi khuẩn có khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh thực phẩm và chịu acid muối mật có tiềm năng là probiotics. Do đó trong chúng tôi tiếp tục sàng lọc các chủng phân lập theo những tính chất thể hiện hoạt tính probiotic và chỉ báo cáo các chủng có hoạt tính tƣơng đối mạnh. Tuyển chọn các LAB phân lập có tiềm năng probiotic Theo định nghĩa của FAO/WHO thì probiotic là những vi sinh vật sống hoạt động tích cực cho sức khỏe vật chủ trong đƣờng ruột (Tuomola et al.,2001). Những tiêu chuẩn đầu tiên đƣợc sử dụng để tuyển chọn probiotics là khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh và khả năng sống sót qua đƣờng ống tiêu hóa để phát huy hoạt động tại đích là ruột non và ruột già. Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh thực phẩm Các vi khuẩn gây bệnh thực phẩm thƣờng có trong thịt là E.coli, Salmonella spp., Staphylococcus spp và Listeria monocytogenes Việc loại trừ các vi khuẩn này trong qúa trình lên men thịt đƣợc quan tâm để bảo đảm chất lƣợng vệ sinh cho thịt lên men. Nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn lactic thƣờng ức chế vi khuẩn gây bệnh theo nhiều cơ chế,chủ yếu do acid hữu cơ tạo thành, CO 2 sinh ra trong quá trình lên men và bacteriocin. Để khảo sát khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh, chúng tôi áp dụng phƣơng pháp đo độ đục (turbidimetricmethod) dịch nuôi cấy vi khuẩn chỉ thị ủ với dịch nuôi cấy LAB sau khi ly tâm loại bỏ tế bào trƣớc và sau khi trung hòa acid theo Schillinger và đồng tác giả, 1989. Tỉ lệ ức chế không trung hòa biểu hiện khả năng ức chế toàn phần của LAB, trong khi đó trung hòa loại trừ tác nhân acid nhằm biểu hiện khả năng ức chế của các tác nhân khác, có thể là của bacteriocin. Cũng cần phải ghi chú rằng trong điều kiện thí nghiệm ủ hiếu khí, CO 2 không tích tụ để ức chế tăng trƣởng vi khuẩn chỉ thị. Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 154 Hình 3.Tỷ lệ (D %) ức chế tăng trƣởng E.coli của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic không trung hòa và trung hòa, D% = 100 x (1 – OD TN /OD DC ) Hình 4.Tỷ lệ (D%) ức chế sự tăng trƣởng vi sinh chỉ thị Salmonella của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic không trung hòa và trung hòa, D% = 100 x (1 – OD TN /OD DC ) Hình 3 và hình 4 cho thấy LAB T13, T3 và N8 phân lập từ nem truyền thống có khả năng ức chế 77-88% E.coli và 85-87% Salmonellalà vi khuẩn gây bệnh thực phẩm Gram âm, trong khi Lb.rhamnosus từ chế phẩm không ức chế những vi khuẩn này. Sau khi trung hòa, T13, T3 và N8 từ nem truyền thống còn khả năng ức chế 42-48% E.coli và 25-30% Salmonella.Phần lớn các LAB trong xúc xích lên men châu Âu ức chế vi khuẩn Gram dƣơng (Schillinger et al., 1989), trong khi các vi khuẩn gây bệnh thực phẩm chủ yếu thuộc vi khuẩn Gram âm. Điều này cho thấy thực phẩm lên men truyền thống là nguồn cung cấp chủng LAB kháng vi khuẩn gây bệnhtiềm năng. Để tìm hiểu tác nhân ức chế vi khuẩn sau khi trung hòa, protein kết tủa bằng (NH4) 2 SO 4 từ T13 thể hoạt tính kháng khuẩn cùng phổ nhƣ dịch nuôi cấy, vì vậy có thể suy ra rằng protein này có thể là bacteriocin (kết quả chƣa công bố). Bacteriocin luôn đƣợc tìm kiếm trong vi khuẩn khởi động nem chua vì có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Gram dƣơng nguy hiểm phát triển trong quá trình chế biến và bảo quản thịt ở nhiệt độ mát là Listeria monocytogenes (Demeyer, 2004). Khả năng chịu acid và muối mật Vi khuẩn ức chế tác nhân gây bệnh chỉ có giá trị nhƣ một probiotic nếu có khả năng sống sót qua đƣờng tiêu hóa, cụ thể là chịu acid và muối mật.Để xác định một chủng có khả năng kháng acid và muối mật hay không, ngƣời ta xác định tỉ lệ sống sót của chủng đó trong môi trƣờng có pH bằng pH dịch vị là 2.0 hoặc nồng độ cao mật bò 0.3% trong thời gian 1 -2 giờ là thời gian thức ăn lƣu trong dạ dày hoặc ruột non (Tuomola et al., 2001 ). Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 155 Hình 5. Tỉ lệ sống sót của LAB phân lập sau khi ủ 1-2 giờ ở pH =2.0 Hình 6. Tỉ lệ sống sót của LAB phân lập sau khi ủ 1-2 giờ với muối mật 0.3% Hình 5,6 cho thấy T13, T3 và N8 phân lập từ nem truyền thống đều sống sót với tỉ lệ>50 % sau khi ủ ở pH 2.0 hai giờ, trong đó T13 thể hiện khả năng sống sót cao hơn cả. Ngƣợc lại,Lb. rhamnosus phân lập từ chế phẩm lại tỏ ra chịu yếu hơn. Điều này càng chứng tỏ thực phẩm lên men truyền thống có thể là nguồn cung cấp probiotic tiềm năng. Tuyển chọn chủng có khả năng làm giống khởi động nem chua Các tiêu chuẩn để chọn lọc giống khởi động nem chua là có khả năng tổng hợp bacteriocin trong quá trình lên men‘không tổng hợp bioamine và có khả năng sử dụng protein thịt làm nguồn amino acid cho sự tăng trƣởng LAB (Hammes, Hertel,1996; Talon, Leroy, 2006). Không sinh bioamine trong quá trình lên men Bioamine là sản phẩmphụ của thực phẩm lên men, gây quan ngại về vấn đề vệ sinh an toàn thựcphẩm. Thịt lên men không đƣợc chứa nhiều hơn 100mg/kg bioamine (Hammes, 2008). Bioamine sinh ra chủ yếu do enzyme decarboxylase của vi sinh vật có mặt trong thịt. Vi khuẩn Gram âm gây hƣ hỏng thịt thƣờng sinh ra putrescine và cadaverine, trong khi LAB có xu hƣớng khử nhóm carboxyl từ tyrosine, histidine và ornithine sinh ra tyramine, histamine và putrescine. Do đóchọn lọc các chủng LAB không có hoạt tính decarboxylase đóng vai trò quan trọng bảo đảm không sinh bioamine trong quá trình lên men. t n đc Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 156 Hình 7. Khảo sát hoạt động enzyme decarboxylase từ các chủng LAB phân lập (Mẫu đối chứng (đc): không cấy LAB, mẫu thí nghiệm có cấy LAB lên men đƣờng sinh acid làm giảm pH (màu vàng - âm tính, màu tím - dƣơng tính) Kết quả cho thấy tất cả các chủng LAB phân lập đều không thể hiện hoạt tính decarboxylase. Hoạt tính protease Hoạt tính protease của LAB thƣờng rất thấp và khó xác định so với các vi khuẩn khác (Fransen et al., 1997), nhƣng lại đóng vai trò vô cùnng quantrọng đối với LAB trong việc thích nghi môi trƣờng thịt, tức là khả năng tự tạo nguồn yếu tố tăng trƣởng cho LAB. Thông thƣờng để so sánh hoạt tính protease bán định lƣợng, phƣơng pháp đục lỗ giếng thạch thƣờng đƣợc sử dụng và đo đƣờng kính vòng phân giải (Hình 8). Tuy nhiên các cơ chất thông thƣờng sử dụng để xác định hoạt tính protease trong phòng thí nghiệm không phải là cơ chất tự nhiên của protease của LAB. Để có cơ chất thích hợp, phòng thí nghiệmchúng tôi đã điều chế protein từ thịt làmcơ chất cho protease trong thử nghiệm này. Hình 8. Xác định hoạt tính protease bằng phƣơng pháp bán định lƣợng Bảng 3.Đƣờng kính vòng phân hủy cơ chất của enzyme protease bằng phƣơng pháp khuyếch tán qua giếng thạch Vi khuẩn lactic Đƣờng kính vòng phân hủy cơ chất của enzyme protease (mm) Protein thịt Gelatin Casein T13 18 34 15 T3 20 33 15 N8 19 29 14 L.R 18 25 15 Trong thành phần nguyên liệu làm nem chua thƣờng có protein thịt và bì heo là cơ chất tự nhiên của enzyme protease. Bảng 3 cho thấy các chủng thủy phân protein thịt tƣơng đƣợng, trong khi có hoạt tính phân hủy gelatin khác biệt. Trong các LAB phân lập, vi khuẩn có nguồn gốc nem chua truyền thống thể hiện nhiều ƣu điểm hơn so với vi khuẩn từ chế phẩm probiotics. Lb. rhamnosus đƣợc nhiều nơi trên thế giới sử dụng làm giống khởi động thịt lên men (Erkkilä et al.,2001).Các chủng từ nem chua truyền thống Việt Nam thể hiện nhiều ƣu điểm đƣợc tiếp tục thử nghiệm sản xuất nem chua probiotics. Nhƣ vậy từ các nguồn nem truyền thống khác nhau, chúng tôi đã phân lập đƣợc 12 chủng LAB. Tuy nhiên sau khi sàng lọc hoạt tính kháng E.coli và Salmonella, khả năng chịu acid và muối mật, hoạt tính protease và không có enzyme decarboxylase, T13 (nem Ninh Hòa), T3 (nemThủ Đức) và N8 (nem Lai Vung) thể hiện hoạt tính mạnh hơn cả, đƣợc đƣa vào sản xuất thử nem chua probiotic. Sản xuất thử nem chua probiotics từ LAB phân lập Khảo sát tốc độ lên men đc Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 157 Tốc độ lên men lactic có ý nghĩa quan trọng với chất lƣợng nem chua về khía cạnh vệ sinh an toàn lẫn khía cạnh cảm quan. Lên men nhanh đồng nghĩa với các vi khuẩn khác trong thịt bị ức chế sớm, nhƣng không đáp ứng nhu cầu cảm quan. Điểm khác biệt giữa nem chua châu Á và thịt lên men châu Âu là ở chỗ nem chua đơn thuần là quá trình lên men lacticlàm giảm pH đến pI (4.5) làm đông tụ gel protein, trong khi đó xuc xích lên men châu Âu cònthêm quá trình chín kéo dài tạo nhiều hƣơng vị đăc trƣng. Một đặc điểm quan trọng ảnh hƣởng đến tốc độ lên men nem chua miền Nam là nồng độ đƣờng bổ sung vào nguyên liệu thịt thƣờng rất lớn, từ 20-50% so với khối lƣợng thịt. Hình 9 cho thấy thấy tốc độ giảm pH sử dụng các giống khởi động khác nhau, nhƣng khác biệt không đáng kể. pH đạt đến pI sau hơn 2 ngày lên men ở nhiệt độ phòng. Ở thịt lên men châu Âu, hàm lƣợng đƣờng thƣờng là 0.7%,bảo đảm pH giảm đến 4.7 sau 24 h lên men (Demeyer, 2004). Trong khi đó,Ho và đồng tác giả, 2007 khảo sát nem truyền thống lên men tự phát,pH >5.2 sau 24 giờ và chỉ ổn định về 4.2 sau 72-96 giờ; còn nem lên men có định hƣớng (sử dụng nem đã chua làm giống khởi động) thì pH giảm nhanh hơn,nhƣng cũng phải sau 48 giờ mới đạt mức ổn định là 4.0. Thí nghiệmcủa chúng tôi cho biết với 20% đƣờng bổ sung ngay cả khi cấy giống đạt 10 5 cfu/g cũng đòi hỏi 48 giờ để đạt pH 4.5. Hình 9. Biến thiên pH trong thời gian lên men (đƣờng bổ sung 30%, mật độ cấy giống 10 3 cfu/g) Song song với động học pH là động họctổng hợp acid hữu cơ (tính theo acid lactic). Bảng 4 cho thấy sau 4 ngày lên men, hàm lƣợng acid tổng hợp đƣợc đạt xấpxỉ 1.7% là hàm lƣợng acid lactic thƣờng đo đƣợc trong thực phẩm lên men truyền thống (Steinkraus, 1992). Khôngcósựkhác biệt đáng kể về tốc độ giảm pH và tổng hợp acid giữa các nem đƣợc sản xuất từ các nguồn giống khởi động khác nhau. Bảng 4. Biến thiên acid tổng trong 4 ngày lên men thịt Giống khởi động T13 T3 N8 Ngày 0 Sau khi cấy giống 0.70 0.70 0.70 Ngày 1 0.74 0,76 0.78 Ngày 2 1.12 1.10 1.04 Ngày 3 1.57 1.48 1.55 Ngày 4 1.67 1.68 1.74 Khảo sát chất lượng cảm quan của nem thí nghiệm Hƣơng vị nem truyền thống đƣợc ƣa chuộng nhờ sự đóng góp của hỗn hợp các chủng LAB có mặt trong nem truyền thống từng vùng.Nguồn vi khuẩn ấy có thể là lá chùm ruột,lá ổi thích nghi lâu đời trên môi trƣờng thịt. Phân lập tuyển chọn vi khuẩn LAB từ nemtruyền thống làm giống khởi động lên men thịt là để đáp ứng cùng lúc nhu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm và cảm quan. Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 158 Bằng phƣơng pháp so hàng xếp hạng theo độ ƣa thích giảm dần, các chỉ tiêu màu, mùi, vị, cấu trúc của sản phẩm đƣợc 20 đối tƣợng chọn ngẫu nhiên đánh giávà tổng điểm đƣợc trình bày trong bảng 5. Bảng 5. Bảng điểm tổng cộng đánh giá các chỉ tiêu cảm quan nem thí nghiệm Giống khởi động T13 Ninh Hòa T3 Thủ Đức N8 Lai Vung T13:T3= 1:1 Màu 43 54 41 21 Mùi 58 41 43 30 Vị 59 43 55 30 Cấu trúc 50 54 59 29 Chỉ tiêu màu không quan trọng lắm vì có thể sử dụng màu thực phẩm bổ sung.Chỉ tiêu mùi vị và cấu trúc đóng vai trò quyết định hơn trong đánh chất lƣợng cảm quan thực phẩm. T 3 từ nem Thủ Đức có mùi vị đƣợc ƣa chuộng hơn nemsản xuất từ T13 (Ninh Hòa và Lai Vung). Mặt khác, nem sản xuất từ T13 có cấu trúc tốt hơn. Kết hợp T13 và T3 theo tỉ lệ 1:1 cho ra nem có các chỉ tiêu cảm quan cải thiện đáng kể. Mặc dù sự tƣơng tác giữa hai vi khuẩn này chƣa đƣợc nghiên cứu, những rõ ràng chúng cótác động tƣơng hỗ làm thay đổi giá trị cảm quan sản phẩm. Bảng 6.Kết quả đánh giá cảm quan theo mức độ ƣa thích của các sản phẩm nem Thành viên Vị trí hạng của các mẫu A B C D E Màu 62 60 54 67 57 Mùi vị 63 42 64 66 65 Cấu trúc 76 44 53 59 68 Trong đó: A:nem Dƣ phƣớc, B: nem thí nghiệm, C: Nem Lai Vung, D: nem Đức Thịnh, E: nem Vissan. Ngoài ra kết quả đánh giá cảm quan mức độ ƣa chuộng đối với các sản phẩm nem chua khác nhau hiện có mặt trên thị trƣờng Việt Nam và nem chua thí nghiệm T13-T3 (1:1) cho thấy nem thí nghiệm trội hơn hẳn về mùi vị và cấu trúc (p<0.05), trong khi không khác biệt đáng kể so với các nem khác vè màu sắc (bảng 6). Khảo sát vệ sinh an toàn thực phẩm của nem thí nghiệm Sản phẩm kiểm nghiệm đạt về các yêu cầu vi sinhthực phẩm theo TCVN 7050 : 2002. Khảo sát sự biến thiên pH sau 15 ngày bảo quản, ta thấy pH vẫn ổn định ở 4.2,điều này chứng tỏ bioamine không đƣợc tạo thành, hoàn toàn tƣơng ứng với kết quả khảo sát hoạt tính decarboxylase. [...]... Phân lập tuyển chọn các vi khuẩn probiotic từ những nguồn này để sản xuất giống khởi động vừa hạn chế nhập khẩu vừa cải thiện chất lƣợng thịt lên men về khía cạnh cảm quan và vệ sinh an toàn thực phẩm Thiết lập quy trình sản xuất giống khởi động từ LAB phân lập là một hƣớng nghiên cứu triển khai để đƣa giống khởi động nguồn gốc nemchua truyền thống đi vào sản xuấ Vi khuẩn probiotic từ những nguồn này... LAB phân lập từ nem Ninh Hòa T13 và nem Thủ Đức T3 theo tỉ lệ 1:1, chúng tôi đã sản xuất thử thành công nem chua bảo đảm chất lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm và cảm quan cạnh tranh đƣợc với nem trên thị trƣờng; ngoài ra nem chua của chúng tôi còn chứa 108 cfu/g vi khuẩn tiềm năng probiotic KẾT LUẬN Thực phẩm lên men truyền thống, trong đó có nem chua là nguồn LAB tiềmnăng probiotic đáng quý Phân lập tuyển. .. thiên pH nem thí nghiệm T13-T3 (1:1) trong quá trình sản xuất và bảo quản Đánh giá hoạt tính probiotic của nem thí nghiệm Thực phẩm đƣợc gọi là probiotic khi mật độ vi sinh vật probiotic phải không dƣới 108cfu/g sản phẩm(Mattila-Sandholm,2002) Phân tích định lƣợng LAB trên môi trƣờng thạch MRS chứa 0.02% Na-azide cho thấy trong nem thành phẩm chứa 2.3*108 cfu/g, đáp ứng tiêu chuẩn là thực phẩm probiotic. .. quality of nem chua – a Vietnamese fermented meat product, Int.Food Res Journal 16, pp 71-81 Keith H Steinkraus (1992) Lactic fermentation Applications of Biotechnology to Traditional Fermented Foods Lichstein HC, Soule MH (1944) Azide on Microbic Growth J Bacteriol 47:221-230 Mattila-Sandhol T, MyllarinenP, CrittendenR, Mogensen G, Fonden R, Saarela M (2002) Technological challenges for future probiotic. .. Isolation and identification of lactic acid bacteria of the nem chua – fermented meat product of Vietnam International workshop on food safety and processing technology, Ho Chi Minh City, November 29-30 159 Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 Ho TNT, Nguyen NT, Deschamps A, Hadj Sassi A, Urdaci M, Caubet, R (2009) The impact of Lactobacillus brevis and Pediococcus pentosaceus... of Bacteria, Springer, Hammes WP, Hertel C (1996), Selection and improvement of lactic acid bacteria used in meat and sausage fermentation Lait 76, © Elsevier/INRA., pp 159-168 Harry T Lawless, Hildegarde Heymann (2010)Sensory Evaluation of Food: Principles and Practices Springer, 149-179 Heller KJ 2001 Probiotic bacteria in fermented foods: product characteristics and starter organisms.Am J Clin Nutr... foods Int Dairy J 12: 173–182 Moeller (1954) Activity determination of amino acid decarboxylases in EnterobacteriaceaeActa Pathol Microbiol Scand 34:102 Nguyen HTH, Elegado FB, Librojo-Basilio NT, Mabesa RC,Dizon EI (2009).Isolation and characterisation of selected lactic acid bacteria for improved processing of Nem chua, a traditional fermented meat from Vietnam, Wageningen Academic Publishers, 1(1),... KTM, May BK, Smooker PM, VanTTH, Coloe PJ (2011) Distribution and genetic diversity of lactic acid bacteria from traditional fermented sausage.Food Res Int 44 338–344 Truong LT, Baumgartner P, Nguyen MH, Markham J.(2007).Survival of fortified Escherichia coli, Staphylococcus aureus, and Listeria monocytogenes in Nem Chua produced by traditional technology and modified technology International workshop... starter cultures for meat fermentation purposes Int J Food Micr 36: 235239 Garriga M, HugasM, Gou P, Aymerich MT, Arnau J, Monfort JM (1996) Technological and sensorial evaluation of Lactobacillus strains as starter cultures in fermented sausages International Journal of Food Microbiology 32, pp 173-183 Hammes WP, Haller D, Gänzle MG (2008) Fermented Meat,in Handbook of Fermented Functional Foods Second... hệ thống TÀI LIỆU THAM KHẢO Benson (2001) Microbiological Applications Lab manual in General Microbiology The Mc GrawHill Cocconcelli PS, Fontana C (2008), Characteristics and Applications of Microbial Starters in Meat Fermentations, Meat Biotechnology, Springer Science+Business Media, LLC, 233 Spring Street, New York,NY 10013, USA, pp 138-152 De Vuyst L, Falony G, Leroy F (2008) Probiotics in fermented . trường và Công nghệ sinh học năm 2011 149 PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC TỪ NEM CHUA TRUYỀN THỐNG LÀM GIỐNG KHỞI ĐỘNG NEM CHUA PROBIOTIC Nguyễn Hoài Hương 1 , Dương Thúy. thực phẩm probiotic. Từ khóa: giống khởi động, thịt lên men, thực phẩm probiotic, vi khuẩn lên men lactic (LAB). ĐẶT VẤN ĐỀ Nem chua là sản phẩm thịt lên men truyền thống của Vi t Nam và. phẩm nem chua truyền thống - Tuyển chọn vi khuẩn lactic này theo tiêu chuẩn probiotic và giống khởi động nem chua. - Sử dụng vi khuẩn lactic tuyển chọn để sản xuất nem chua probiotic. VẬT LIỆU