Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn acetobacter xylinum, chế tạo mặt nạ dưỡng da

Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngnh Vi sinh vật học Lời cảm ơn Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, em đà nhận đợc hớng dẫn, bảo tận tình PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung, thầy cô giáo môn Vi sinh Đồng thời em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Khoa Sinh KTNN đà tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Em cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo, anh, chị học tập làm việc phòng thí nghiệm trờng Đại học S phạm Hà Nội đà giúp đỡ nhiệt tình tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn Cuối em xin chân thành đợc cảm ơn gia đình, bạn bè đà quan tâm, động viên, giúp đỡ em suốt thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội , ngày.thángnăm 2009 Sinh viên thực hiên Hoàng Thị Hạnh Mục lục Hong Thị Hạnh -1- Lớp 31b Sinh- KTNN Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngnh Vi sinh vật học Trang Mở Đầu Chơng Tổng quan tài liệu 1.1 Lợc sử nghiên cứu phân loại vi khuẩn Acetobacter 1.2 Đặc điểm chung vi khuẩn Acetobacter 1.3 Một số đặc điểm nhóm vi khuẩn Acetobacter 11 Chơng Đối tợng phơng pháp nghiên cứu 2.1 Đối tợng nghiên cứu 15 2.2 Trang thiết bị hoá chất 15 2.3 Môi trờng 16 2.4 Phơng pháp nghiên cứu 17 Chơng Kết nghiên cứu thảo luận 26 3.1 Phân lËp vi khn axetic tõ mét sè ngn nguyªn liƯu 26 3.2 Tun chän chđng vi khn A xylinum cho màng mỏng 31 3.3 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum 36 3.4 Khảo sát khả tạo màng chủng A xylinum C5 môi trờng nuôi cấy khác 39 3.5 Khảo sát khả tạo màng vi khuẩn A xylinum C5 thời gian nuôi cấy khác 40 3.6 Xử lý màng BC bớc đầu thử nghiệm làm mặt nạ dỡng da số phụ nữ 41 Kết luËn Vμ kiÕn nghÞ KÕt luËn 47 KiÕn nghị 47 Ti liệu tham khảo 48 Hong Thị Hạnh -2- Lớp 31b Sinh- KTNN Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngnh Vi sinh vật học Lời cam đoan Tôi xin khẳng định kết nghiên cứu riêng cá nhân tôi, tất số liệu đợc thu thËp tõ thùc nghiƯm vµ qua xư lý thèng kê, hoàn toàn số liệu chép, bịa đặt đề tài nghiên cứu không trùng với công trình nghiên cứu tác giả khác Tác giả Hoàng Thị Hạnh Danh mục từ viết tắt Hong Thị Hạnh -3- Lớp 31b Sinh- KTNN Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngnh Vi sinh vật học Từ viết tắt Từ ®Çy ®đ A xylinum Acetobacter xylinum BC Bacterial Cellulose CNSH C«ng nghƯ sinh häc C5 Acetobacter xylinum C5 EM Effective Micorgamisms MPA M«i trêng nu«i cÊy vi sinh vËt kiĨm định Hong Thị Hạnh -4- Lớp 31b Sinh- KTNN Khoá luËn tèt nghiªp Chuyªn ngμnh Vi sinh vËt häc Danh mục bảng v hình Bảng Trang Bảng 1.1 Những đặc điểm phân biệt Acetobacter Gluconobacter so sánh với Pseudomonas Bảng 3.1 Hàm lợng axit axetic số chủng Acetobacter 30 Bảng 3.2 Quan sát thời gian, đặc điểm màng tạo thành đặc điểm khuẩn lạc chủng Acetobacter phân lập đợc 32 Bảng 3.3 Đặc ®iĨm sinh ho¸ cđa chđng vi khn Acetobacter xylinum 33 Bảng 3.4 Khảo sát khả tạo màng vi khuẩn Acetobacter xylinum 35 Bảng 3.5 Khảo sát khả tạo màng môi trờng khác 39 Bảng 3.6 Khảo sát khả tạo màng thời gian khác 40 Bảng 3.7 Phiếu nhận xét cho điểm số ngời thử nghiệm dùng màng BC đắp mặt 45 Hình Hình 2.1 Tế bào số chủng vi khuẩn thuộc nhóm III 21 Hình 3.2 Mẫu dịch lên men giấm 27 Hình 3.3 Khuẩn lạc vi khuẩn axetic mẫu phân lập 28 Hình 3.4 Khả phân oxy hoá axetat vi khuẩn axetic 30 Hình 3.5 Khuẩn lạc C5 37 Hình 3.6 Vòng phân giải CaCO3 C5 Hình 3.7 Màng BC C5 37 37 Hình3.8 Tế bào C5 nhuộm Gram 37 Hình 3.9 Khả sát khả tạo màng môi trờng lên men 38 Hình 3.10 Khả kháng khuẩn màng BC tẩm mật ong Hong Thị Hạnh -5- 42 Lớp 31b Sinh- KTNN Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngnh Vi sinh vật học Mở Đầu Lý chọn đề tài Ngy vi s phát trin khoa học kĩ thuật c«ng nghệ, c«ng nghệ sinh học (CNSH) đ· trở thành ngành kinh tế chủ đạo nhiều quốc gia trªn giới Là phận ngành CNSH, c«ng nghệ vi sinh học đ· ph¸t triển mạnh mẽ với ứng dụng thiết thực vào sống như: c«ng nghiệp, nông nghip, y hc Bng vic ng dng trình lên men vi sinh vt vo sn xut c¸c chế phẩm, chóng ta đ· tận dụng tiết kiệm chi phÝ việc giải nhiều vấn đề n«ng nghiệp, c«ng nghiệp, bảo vệ m«i trng Vì vậy, việc nghiên cứu trình lên men, đặc tính hoá, sinh học chủng vi khuẩn đợc nhiều ngời quan tâm Một chủng vi khuẩn đợc nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter (còn gọi vi khuẩn giấm) Khi nuôi cy loi vi khun Acetobacter b mt môi trng lỏng nã tạo thành lớp màng cã chất l hemixenluloza b mt thoáng ca dung dch gäi lµ mµng BC (mµng sinh häc, bacterial cellulose, BC) Màng dïng để làm sợi tơ to khoẻ cã độ đàn hồi cao m«i trường nước nãng Màng xem nguyªn liệu cã tiềm ứng dụng để sản xuất n kiêng v tráng ming Trong công nghip, n«ng nghiệp vi khuẩn dïng để sản xuất EM (Effective Micorgamisms) có tác dng a hiu nhiu lĩnh vực đặc biệt lĩnh vực xử lý r¸c thải: EM gióp khử mïi h«i giảm chi phÝ 10 ln so vi t rác Trong công nghip sn xuất giấy chất lượng cao người ta đ· sử dụng nguyên liu mng BC to thnh trình nu«i cấy vi khuẩn giấm Trong c«ng nghiệp thực phẩm, vi khuÈn Acetobacter (chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum) sử dụng để sản xuất thạch dừa - mãn ăn giàu dinh dưỡng kh¸ phổ biến Hoμng Thị Hạnh -6- Lớp 31b Sinh- KTNN Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngnh Vi sinh vật học Các nh khoa học nghiªn cứu tÝnh đặc biệt như: bám chc b mt nc bc hi, kh«ng cho nước thấm qua lại cho nước di chuyển, cã khả ngăn cản vi khuẩn, thay da tạm thời V× vậy, màng BC coi nguyªn liệu quý y học dïng để làm da nhân to, mng mch máu, mt n dng da cho phụ nữ Nã cã thể thay da tạm thời cho bệnh nh©n bỏng từ cấp độ đến cấp độ Chỉ riªng Viện bỏng Quốc gia Hà Nội năm phải tiếp nhận 4.000 ca bng Vi bnh nhân b bng nng chi phí cho tm mng p lên vt bng rt cao Ngoi ra, loi mng dùng p lên vết thương hở màng dïng để đắp mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ phải nhập ngoại với giá t 30.00045.000 ng /1 chic Trong mng BC hoàn toàn cã thể sản xuất ë nc bng trình lên men nhờ vi khun Acetobacter xylinum Xà hi cng phát trin nhu cu lm đẹp quan t©m mặt nạ dưỡng da c ch to bng trình lên men ca vi khuẩn với nhiều ưu điểm lựa chọn ca nhiu ch em phụ n Vì vy, xut phát từ thực tiễn nhu cÇu sử dụng màng BC nước, hợp với lý luận t×m hiĨu ë trên, c s k tha kt qu nghiên cứu số t¸c giả ngồi nước, đồng thời vào điều kiện sở nghiªn cu tin hnh nghiên cu ti: Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter xylinum, chÕ t¹o mặt n dng da Mục tiêu đề tài + Phân lập vi khuẩn axetic từ số nguồn nguyên liƯu + Tun chän chđng vi khn Acetobacter xylinum cho màng mỏng + Xử lý màng BC bớc đầu thử nghiệm làm mặt nạ dỡng da Nội dung đề tài Nội dung đề tài Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter xylinum, chế tạo mặt nạ dỡng da để tìm hiểu đặc điểm, hình thái vi khuẩn Hong Thị Hạnh -7- Lớp 31b Sinh- KTNN Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngnh Vi sinh vật học Acetobacter, từ phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng theo hớng chế tạo mặt nạ dỡng da ý nghĩa đề tài Đề tài cho phép phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả tạo màng mỏng, từ chế tạo mặt nạ dỡng da cho phụ nữ Hong Thị Hạnh -8- Lớp 31b Sinh- KTNN Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngnh Vi sinh vật học Chơng Tổng quan tI liệu 1.1 Lợc sử nghiên cứu phân loại vi khuẩn giấm Từ lâu lịch sử ngời đà biết cách làm giấm song cha nắm đợc sở khoa học, giải thích đợc cách rợu loÃng lại biến thành giấm ăn Cho đến đầu kỷ XIX, khoa học kĩ thuật phát triển, đặc biệt với ®êi cđa kÝnh hiĨn vi, thÕ giíi vi sinh vật đợc khám phá, ngời biết đợc giấm sản phẩm trình lên men nhờ nhãm vi sinh vËt mµ ngµy ng−êi ta gäi chóng lµ vi khn Acetobacter hay vi khn axetic [4,5] Năm 1822, Peson đà tiến hành nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter từ lớp màng thu đợc bề mặt bình sản xuất giấm Ông khẳng định loại vi sinh vật gọi Mycoderma aceti [7] Năm 1837, Kiitzing sau loại bá hÕt vi sinh vËt chum lµm giÊm vµ thấy giấm không đợc tạo thành Ông đà đa nhận xét: trình lên men giấm thiết phải có mặt vi sinh vật không không diễn chuyển hoá rợu thành giấm Cũng năm 1837, Hansen (ngời Đan Mạch) đà tách đợc từ màng giấm hai loại vi khuẩn khiết Mycoderma aceti Mycoderma pasteurianum Từ năm 1862 đến năm 1868, Pasteur nhờ trợ giúp đắc lực kính hiển vi đà chứng minh đắn nhận xét Kiitzing Hansen khẳng định chất trình lên men giấm Ông nghiên cứu lớp màng nhầy xuất bề mặt bia, rợu vang đến kết luận: màng đợc tạo thành loại trực khuẩn ông gọi trực khuẩn Mycoderma aceti Hong Thị Hạnh -9- Lớp 31b Sinh- KTNN Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngnh Vi sinh vật học Cùng với nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter, nghiên cứu khác nh nghiên cứu sau nhằm tìm hiểu rõ thêm tìm cách cải thiện qua trình lên men giấm Hiện nay, ngời ta vào nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Acetobacter cách phân lập chủng vi khuẩn khiết, nghiên cứu đặc điểm cấu tạo, sinh lý, sinh hoá chúng nhằm tìm chủng tốt cho ứng dụng sở đối chiếu tiêu chuẩn phân loại đà đợc đa 1.1.1 Các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn Acetobacter + Địa điểm nơi phân lập: nơi c trú có liên quan đến điều kiện môi trờng sống + Đặc điểm hình thái: hình dạng tế bào, cách xếp tế bào, khả di động, màu sắc, hình thành tiêm mao, vỏ nhày, màu sắc nhuộm Gram + Đặc điểm nuôi cấy: dựa vào trạng thái vết mọc, đặc điểm vết mọc, đặc tính vết mọc (trơn, xu xì), tính chất vết mọc (đục, trong), màu sắc vết mọc môi trờng thạch Trên môi trờng lỏng cần la ý tình trạng môi trờng sau thời gian nuôi cấy (đục hay trong, có mùi hay mùi) + Đặc điểm sinh lý: mèi quan hƯ víi c¸c u tè nhiƯt độ, pH môi trờng, khả hình thành sắc tè, quan hƯ víi oxy (thc lo¹i hiÕu khÝ hay kỵ khí), khả lên men axetic, khả sử dụng hợp chất vô hữu 1.1.2 Phân loại vi khuẩn Acetobacter Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Acetobacter đợc thực từ kỷ XIX Từ năm 1898 Rothenback đà tiến hành phân loại, Hoyer (1899), Beijerink đà phân loại vi khuẩn Acetobacter dùa vµo hai dÊu hiƯu [6]: * Mét lµ: Khả sử dụng đạm amoni để thực trình sinh trởng phát triển vi khuẩn Acetobacter Hong Thị Hạnh - 10 - Lớp 31b Sinh- KTNN Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngnh Vi sinh vật học Khoảng ngày sau màng xuất hiện, màng dày lên nhanh, ngày sau chậm dần Màng mỏng, dày, trơn, nhăn, dai, môi trờng nuôi cấy đục Thu màng, rửa sạch, đem cân thu đợc kết quả: Bảng 3.5 Khảo sát khả tạo màng số chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum Tên chủng C1 Khối lợng màng/1 l môi trờng nuôi cấy (g) 3,73 Thời gian tạo màng (ngày) Độ dày màng Đặc điểm màng (mm) C2 3,11 0,8 C3 3,29 1,5 C4 3,93 1,65 C5 3,32 0,5 1,2 Màng mỏng, dai , dịch nuôi cấy đục Màng mỏng, dai, nhẵn, có màu sáng , dịch nuôi cấy Màng mỏng, dai, màu đậm Màng dày, màu vàng ngà, dịch nuôi cấy đục Màng mỏng, dai, nhẵn, trắng trong, dịch nuôi cấy Từ kết nghiên cứu trên, bớc đầu khẳng định chủng vi khuẩn Acetobacter C5 thuộc loại vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả tạo thành màng cellulose mỏng, dai Chúng định lựa chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum C5 làm đối tợng cho nghiên cứu Kiểm tra khả tạo màng ổn định chủng vi khuẩn C5 qua lần liên tiếp cách: từ mẫu màng dai, nhẵn, mỏng thu đợc (do khuẩn lạc chủng C5 vào môi trờng dịch thể) tiến hành phân lập lại môi trờng thạch đĩa Các khuẩn lạc biểu đồng (đặc điểm màu sắc, kích thớc khuẩn lạc giống với chủng C5) Từ khuẩn lạc tiếp tục tiến hành nuôi cấy môi trờng dịch thể cịng thÊy xt hiƯn mµng sau - ngµy nuôi cấy Qua lần tuyển chọn Hong Thị Hạnh - 40 - Líp 31b Sinh- KTNN Kho¸ ln tèt nghiêp Chuyên ngnh Vi sinh vật học liên tiếp thấy xuất màng đặc điểm khuẩn lạc đồng Do khẳng định chủng vi khuẩn C5 có khả tạo màng mỏng ổn định Nh đà chọn đợc chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum C5 có khả cho màng mỏng, ổn định 3.3 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum Để quan sát hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum, tiến hành làm tiêu nhộm Gram mẫu vi khuẩn Lấy mẫu váng dịch nuôi cấy vi khuẩn cấy thạch nghiêng làm tiêu nhuộm Gram Đa lên kính hiển vi để quan sát thấy vi khuẩn Acetobacter xylinum trực khuẩn hình que, đứng riêng rẽ xếp thành chuỗi, không di động, vi khuẩn Gram âm (Gr-) bắt màu hồng Fucshin Khi quan sát kính hiển vi Olympus với độ phóng đại 1000 lần nhận thấy mẫu vi khuẩn có kích thớc khoảng 1,4 - 1,6 m đợc bao bọc chất nhầy tạo váng dầy bắt màu hồng (khi nhuộm thuốc nhuộm iôt H2SO4 váng bắt màu xanh phản ứng hemixeluloza), C5 có kích thớc dài (1,6 m) Trên kính quan sát thấy bắt màu đậm nhạt khác cảu phần khác bên tế bào vi khuẩn Theo tác giả Sokolnicki cs (2006) [11], độ dai cđa mµng cellulose tû lƯ thn víi kÝch th−íc cđa tế bào vi khuẩn Nếu kích thớc tế bào vi khuẩn lớn sợi cellulose tổng hợp dai tính bền vững cao Để đáp ứng đợc mục đích nghiên cứu đề tài phải tuyển chọn đợc củng vi khuẩn có khả hình thành màng nhanh, mỏng, dai, bề mặt nhẵn, định lựa chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum C5 làm đối tợng nghiên cứu Hong Thị Hạnh - 41 - Líp 31b Sinh- KTNN Kho¸ ln tèt nghiêp Chuyên ngnh Vi sinh vật học Hình3.5 Khuẩn lạc C5 Hình 3.6 Vòng phân giải CaCO3 Hình 3.7 Màng BC C5 Hong Thị Hạnh Hình 3.8 Tế bào C5 nhuém Gram - 42 - Líp 31b Sinh- KTNN Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngnh Vi sinh vật học 3.4 Khảo sát khả tạo màng môi trờng nuôi cấy khác Mng BC thu c trình lên men axetic vi s tham gia ca vi khuẩn Acetobacter xylinum C5 dïng làm mặt nạ dưỡng da phi m bo yêu cu sau: mng (0,5-1mm), phải cã độ dai, chắc, bề mặt trơn nhẵn, mu sc sáng Mặt khác, nghiên cứu tìm môi trờng dinh dỡng cho thời gian tạo màng phù hợp để áp dụng rộng rÃi quy mô công nghiệp đem lại lợi ích kinh tế cao Do việc tìm môi trờng nuôi cấy phù hỵp cho chđng vi khn Acetobacter xylinum cã ý nghÜa lớn Độ dày, mỏng màng BC phụ thuộc vào hàm lợng cellulose sinh kết hợp với tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum Mặt khác, mật độ tế bào lại tỷ lệ thuận với hàm lợng cellulose theo thời gian nuôi cấy [12; 13] Cellulose lại đợc cấu tạo từ đơn phân đờng glucose, theo cân hàm lợng C N môi trờng nuôi cấy yếu tố quan trọng định độ dày, mỏng màng BC Do vậy, dựa vào môi trờng sở (MT2) để thiết lập số môi tròng cách thay đổi thành phần C, N yếu tố sinh trởng khác Chúng sử dụng môi trờng 2; 3; 4; 5; để khảo sát khả tạo màng BC chủng C5 theo dõi thời gian tạo màng quan sát tính chất, cân khối lợng khô thử khả chịu lực màng tạo thành Hình 3.9 Khảo sát khả tạo màng môi trờng lên men Hong Thị Hạnh - 43 - Lớp 31b Sinh- KTNN Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngnh Vi sinh vật học Bảng 3.6 Khảo sát khả tạo màng môi trờng kh¸c MT2 MT3 Chủng C5 Thời gian bắt đầu tạo màng Kh¸ dai TÝnh chất Kh¸ dai màng Màu s¸ng Vàng nhạt Màu sắc màng 3,54 3,45 Khối lượng màng /1lm«i trường nu«i cấy Khả chịu Tốt Tốt lực màng MT4 MT5 MT6 Dai Dai Kh¸ dai Màu s¸ng Vàng đậm Vàng ngà 3,38 4,26 3,71 Rất tốt Tốt Tt Môi trờng có đầy đủ thành phần: nguồn cacbon từ đờng glucose, nguồn nitơ hữu (pepton) vô (NH4)2SO4, nguồn vitamin từ cao nấm men cã chøa mét sè axit amin kh«ng thay thÕ cịng nh nguồn vitamin phong phú đóng vai trò chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng cho vi khuÈn Acetobacter xylinum Mục đích tạo màng mỏng lựa chọn môi trờng thích hợp Môi trờng bao gồm thành phần: Glucose : 20g; Axit axetic : 2%; (NH4)2SO4: 3g; Rượu etylic; KH2PO4 : 2g; Cao nấm men: 5g; Pepton: 6g thÝch hỵp nhÊt môi trờng đà khảo sát trên, cho mng BC dai chắc, bề mặt nhẵn, cã khối lượng 3,38g Kết nghiên cứu phù hợp với số tác giả nh: Saibuatong O [14] đà tìm môi trờng nớc dừa nuôi cấy chủng Acetobacter xylinum cho mµng BC lµ: saccrose: 5%, (NH4)2SO4: 0,5% axit axetic: 0,1%; Neelobon Swannapinunt sử dụng môi trờng gồm: glucose: 30 g, (NH4)2SO4: g/l Hong Thị Hạnh - 44 - Líp 31b Sinh- KTNN Kho¸ ln tèt nghiêp Chuyên ngnh Vi sinh vật học 3.5 Khảo sát khả tạo màng vi khuẩn Acetobacter xylinum C5 thời gian nuôi cấy khác Qua thực nghiệm nhận thấy: thời gian thu hoạch ảnh hởng đến độ dày, mỏng màng Điều đợc giải thích nh sau: màng BC tập hợp tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum kết hợp với phân tử đờng glucose, số lợng tế bào vi khuẩn nhiều môi trờng đợc cung cấp đủ chất dinh dỡng màng tạo thành dày Tuy nhiên, đến khoảng thời gian môi trờng nuôi cấy đà trở nên thiếu hụt chất dinh dỡng màng tự chìm xuống bị phân huỷ màng lấy chất dinh dỡng hình thành lên lớp màng Do vậy, thời gian thu hoạch màng thích hợp vấn đề quan trọng Tiến hành nguyên yếu tố: thành phần môi trờng, nhiệt độ, pH nuôi cấy mÉu cña chñng Acetobacter xylinum C5 thêi gian nuôi cấy khác Kt qu thu c nh sau: Bảng 3.7 Khảo s¸t khả tạo màng ë c¸c thi gian nuôi cy khác Tên mu Thi gian (ngày) Khối lượng màng thu (g /l) M1 4,50 4,038 M2 4,16 3,941 M3 3,92 3,29 M4 5,00 4,562 M5 6,00 4,761 Như chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum nu«i cấy m«i trường số thời gian nu«i cấy 3,92 ngày cho màng BC tèt nht vi lng l 3,29 g/l Hong Thị Hạnh - 45 - Líp 31b Sinh- KTNN Kho¸ ln tèt nghiªp Chuyªn ngμnh Vi sinh vËt häc 3.6 Xử lý màng BC bước đầu thử nghiệm lµm mặt nạ dưỡng da số phụ nữ 3.6.1 Thu ho¹ch, xử lý thử khả kháng khuẩn màng BC Chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum C5 tuyển chọn qua nhiều lần thử khả lªn màng môi trng dch th khác Các kt qu nghiên cu cho thy chng vi khun C5 n định, cho màng BC đủ độ mỏng 0,5 →1 mm có kh nng hình thnh mng nhanh môi trng dch th Trên c s nghiên cu [12] chủng Acetobacter xylinum sinh trưởng ph¸t triển tạo màng cellulose mỏng tốt điều kiện nu«i cấy tĩnh, nhiệt độ nu«i cấy 25ºC - 30ºC, pH ban đầu m«i trường nu«i cấy pH = - 5→6 Nguồn cacbon glucose, nguồn nitơ cã thể sử dng c nit vô (NH4)2SO4 v nit hu c (pepton, cao nm men) Qua kho sát môi trng nuôi cy v thi gian nuôi cy khác ó la chọn m«i trường số 4, thời gian nu«i cấy - ngày phï hợp nhằm mục ®Ých tạo màng mỏng BC ứng dụng thực nghiệm dïng làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ (thÝ nghiệm thm dò) Sau tìm c môi trng dinh dng v thi gian thích hp, tiến hành nuôi cấy, thu hoạch khoảng 200 mµng BC b»ng trình lên men vi khun Acetobacter xylinum C5 vi độ dày, mỏng (0,5-1mm) diện tÝch kh¸c Màng BC đợc nuôi môi trờng số sau - ngày vớt tiến hành xử lý thông qua bc x lý sau: Bớc1: Màng BC sau tách khỏi môi trờng dich nuôi cấy đem rửa dới vòi nớc máy từ đến lần, để loại bỏ bớt hàm lợng axit sản phẩm d môi trờng, làm giá trị pH tăng dần khoảng 3,5 lên 4,5 đo giấy quỳ Hong Thị Hạnh - 46 - Lớp 31b Sinh- KTNN Khoá ln tèt nghiªp Chuyªn ngμnh Vi sinh vËt häc B−íc 2: Đem đun cách thuỷ màng BC nhiệt độ 100C vòng 30 phút, loại tế bào vi khuẩn có mặt màng BC, sau rửa lại nớc vô trùng để màng BC có giá trị pH khoảng từ 5,5 - 6,0 Bớc 3: Tẩm mật ong thử nghiệm đắp da thỏ Hình 3.10 Khảo sát khả kháng khuẩn màng BC tẩm mật ong Màng BC sau đợc xử lý có đặc điểm sau: Màu trắng, mùi thơm dễ chịu, khả bám dính tốt, khả hấp thụ nớc cao, tính đàn cao Đặc biệt màng BC sau xử lý có khả kháng khuẩn lớn, nhng độ trơ màng tăng Để làm tăng tác dụng màng BC đắp cần bổ sung vào màng số dỡng chất Mật ong nguồn dợc liệu thiên nhiên có chứa nhiều yếu tố có lợi cho da sức khoẻ ngời (vitamin, nhân tố khoáng, số axit hữu cơ) Vì việc sử dụng mật ong tẩm lên màng BC nguồn cung cÊp d−ìng chÊt bỉ sung cho da lµ rÊt tèt Thử khả kháng khuẩn màng BC: Theo Hiệp định hoà hợp Asean mỹ phẩm (Nxb Asean cosmetic documents 2003) quy định mỹ phẩm không đợc nhiễm loại vi khuẩn (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus, E.coli) Đây nhóm vi khuẩn thờng tồn da, tóc, mũi sản sinh độc tố gây hại đến sức khoẻ ngời.Vì việc thử khả kháng khuẩn màng BC cần thiết đợc tiến hành theo bớc sau: + Nuôi cấy loài vi khuẩn môi trờng MPA Hong Thị Hạnh - 47 - Lớp 31b Sinh- KTNN Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngnh Vi sinh vật học + Phủ màng BC tẩm mật ong lên bề mặt môi trờng nuôi cấy loài vi khuẩn trên, quan sát tợng sau 24h Qua khảo sát: phủ màng tẩm mật ong lên môi trờng MPA có cấy vi sinh vật kiểm định: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus, E.coli nhận thấy xung quanh vi trí màng bao phủ tạo vòng kháng khuẩn, nhằm ngăn cách sinh trởng vi sinh vật kiểm định hình thành vòng kháng khuÈn xung quanh mµng BC tÈm mËt ong Mµng BC có khả ức chế sinh trởng vi sinh vật kiểm định Đây đặc tính quan trọng, cần thiết màng BC tẩm mật ong dùng làm mặt nạ 3.6.2 Thử nghiệm màng BC làm mặt nạ dỡng da 3.6.2.1 Thử nghiệm da thỏ Chúng tiến hành thử nghiệm đối tợng da thỏ nhà khoẻ mạnh, có khối lợng 1,5 kg Tiến hành thí nghiệm cách: Cạo nhẵn vùng lông thỏ có kích thớc ì 4cm, lau vải mềm, ớt Tiến hành đắp màng BC lần ngày Chúng bố trí thí nghiệm thành lô nh sau: Lô 1: Đắp màng BC qua xử lý bớc Lô 2: Đắp màng BC qua xử lý bớc Lô 3: Đắp màng BC cã tÈm mËt ong Sau 30 ngµy tiÕn hµnh thí nghiệm quan sát cảm quan, nhËn thÊy nh− sau: L« 1: Da cđa thá bãng, nhẵn nhng ban đỏ sau sử dụng Điều giải thích nh sau: màng BC sau vớt khỏi môi trờng lên men (pH = 3) lợng axit sau rửa dới nớc nhiều (pH = 4,5) Vì vậy, màng BC sử dụng đắp lên da Thỏ thờng gây lên kích ứng da ban đỏ Mặt khác hàm lợng axit có màng góp phần tẩy trắng làm da Hong Thị Hạnh - 48 - Lớp 31b Sinh- KTNN Khoá ln tèt nghiªp Chuyªn ngμnh Vi sinh vËt häc cđa thỏ, đồng thời cung cấy lợng nớc làm cho da trở nên sáng bóng nhăn ban đầu Lô 2: Màng BC sau xử lý giai đoạn 2, lợng axit lại màng (pH = 5,5) sử dụng da tợng bị ban đỏ Da trở nên bóng nhăn Lô 3: Màng BC đợc bổ sung d−ìng chÊt mËt ong (vitamin nhãm B, vitamin E….) đà giúp da trở nên sáng bóng nhăn Từ kết qủa thu đợc trên, định sử dụng màng BC tẩm mật ong bớc đầu thử nghiệm thăm dò làm mặt nạ dỡng da 3.6.2.2 Thử nghiệm da ngời Màng BC tẩm mật ong sau xử lý có độ dài từ - 3mm, màu trắng trong, có khả thấm nớc tốt, có mùi thơm dễ chịu Chúng ®· cung cấp cho số phụ nữ tự nguyện dïng màng BC làm mặt nạ dưỡng da Màng BC sau đợc xử lý, p trc tip lên da sau 30 Rót nhËn xÐt Hầu người thử nghiệm cho màng BC cã t¸c dụng tốt là: làm da mặt, mïi th¬m d chịu, lm se l chân lông, không gây kích ứng da Kết cụ thể tr×nh bày phiu cho im 3.6.2 Hong Thị Hạnh - 49 - Líp 31b Sinh- KTNN Kho¸ ln tèt nghiªp Chuyªn ngμnh Vi sinh vËt häc Bảng 3.8 Phiếu nhận xÐt cho điểm số người thử nghiệm dùng mng BC p mt Các đánh giá tiêu Các tiêu cụ thể Mùi vị (5 điểm) Cảm quan Độ dày, mỏng (5 điểm) Độ đồng ( điểm) Độ dai độ đàn hồi (điểm) Phản ứng sau đắp mặt nạ Độ se lỗ chân lông Độ Thời gian trì độ bền sau đắp (15 điểm) Phản ứng để lại da Nng, khó chu Không mùi t thm Thm du hài hoµ Mỏng Hơi dày Dày Màng nhăn Nhăn Ýt Hơi nhn B mt nhn Vò nhẹ rách Dai Dai vừa Dai Không se Có se Không Sạch Da xuất nhờn sau đắp Da xuất nhờn sau 1h, 3h, 8h, 12h Mùi khó chịu Không mùi Mùi thơm S im Tỷ lệ % kết ti đa 5 1 -⅔ 5 5 35 65 36 64 17 10 73 17 18 65 36 64 25 75 33 ⅓; 1;2;15 67 -5; -2 +5; +2 46 54 Các biến đổi Không đổi mau da, có +2 +10 63,7 da sau đắp xu hớng tốt Đổi màu da, gây kích -2 -10 ứng Gây khó chịu đắp -1 Không gây khó chịu +1 23 Không gây kích ứng +10 11,3 da (nóng, dát, di ứng ) Hong Thị Hạnh - 50 - Líp 31b Sinh- KTNN Kho¸ ln tèt nghiªp Chuyªn ngμnh Vi sinh vËt häc Qua sư dơng thăm dò 200 màng BC tẩm mật ong làm mặt nạ dỡng da cho nhận thấy rằng: * Màng BC tẩm mật ong có đặc tính tốt nh: độ đàn hồi cao, khả thấm hút tốt, độ bám dính màng tốt, đặc biệt có khả kháng khuẩn cao, thích hợp cho sử dụng làm mặt nạ dỡng da * Trong màng BC tẩm mật ong có chứa lợng lớn dỡng chất (vitamin B, vitami E, axit hữu cơ) cã tõ mËt ong Chóng rÊt cã lỵi cho da đắp nh khả tẩy bỏ tế bào già chết da, vitamin E chống lÃo hoá da, da bớt sạm màu, trở nên trắng hồng hơn, đồng thời cân độ pH da * Có 78% ý kiến cho đắp mặt nạ không gây kÝch øng cho da, cã 67% ý kiÕn cho r»ng không xuất nhờn sau đắp có 65% ý kiÕn cho r»ng mµng BC tÈm mËt ong cã mùi thơm dễ chịu cho ngời sử dung * Bên cạnh có 22% ý kiến cho sử dụng màng gây kích ứng cho da nh: ngứa, gây đỏ, gây mụn trình sử dụng * Đặc biệt hiệu thử da khô màng có chứa lợng lớn nớc với axit hữu có màng có tác dụng tẩy tế bào hoá sừng làm cho da trở nên mịn màng, mềm mại Trên kết bớc đầu khảo sát tác dụng màng BC dùng làm mặt nạ dỡng da, nhận thấy nguồn polymer sinh học có nhiều triển vọng lĩnh vực, đặc biệt lĩnh vực y học mỹ phẩm Hong Thị Hạnh - 51 - Lớp 31b Sinh- KTNN Khoá luận tèt nghiªp Chuyªn ngμnh Vi sinh vËt häc KÕt luËn v kiến nghị Kết luận Từ nguồn nguyên liệu: bia, rợu vang, dịch hoa đẵ phân lập đợc 25 mẫu khuẩn lạc vi khuẩn giấm Qua sơ tuyển, đà chọn đợc chủng có khả tạo màng tơng đối mỏng xác định đợc thuộc chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum, đà chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum C5 cho màng dai, mỏng Đà tiến hành thí nghiệm thăm dò, dùng màng BC làm màng đắp mặt nạ dỡng da số phụ nữ tù ngun cho kÕt qu¶ tèt víi kho¶ng 200 tÊm màng BC có độ dày 0,5 mm, kích thớc khác Kiến nghị Đây kết nghiên cứu bớc đầu chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum C5, để đạt đợc mục đích đề nhiều vấn đề phải giải quyết, cần tiến hành nghiên sâu Do có số đề nghị sau: Chủng Acetobacter xylinum C5 chủng vi khuẩn có giá trị ứng dụng vào thực tiễn cao Bởi cần nghiên cứu sâu đặc tính sinh học chủng Định loại đến loài sinh học phân tử giải mà trình tù gen ARN 16 Më réng nghiªn cøu tèi u hoá khả tạo màng BC mỏng với nhiều yếu tố nh : (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, glucoza, pH,từ tìm môi trờng dinh dỡng thích hợp cho tạo mµng cđa vi khn Acetobacter xylinum C5 cho mµng máng sản xuất màng quy mô công nghiệp Hong Thị Hạnh - 52 - Lớp 31b Sinh- KTNN Khoá luËn tèt nghiªp Chuyªn ngμnh Vi sinh vËt häc TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn L©n Dũng cộng (1972), Mt s phng pháp nghiên cu vi sinh vt học, Tập 1, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn L©n Dũng cộng (1976), Một s phng pháp nghiên cu vi sinh vt hc, Tp 2, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn L©n Dũng cộng ( 1978 ), Một s phng pháp nghiên cu vi sinh vt hc, Tp 3, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyn Lân Dng, Nguyn Đình Quyn, Phm Vn Ty (2002), Vi sinh vật học, Nxb Gi¸o dục, Hà Nội Ngun L©n Dịng (1983), Thùc tËp vi sinh vËt häc (sách dịch), Nxb Mir Moskwa, Nxb Đại học trung học chuyên nghiệp, Hà Nội Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vơng Trọng Hảo (1986), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, Giáo dục Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vơng Trọng Hảo (1990), Thực hành vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, Hà Nội Đinh Thị kim Nhung (1997), Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn Acetobacter ứng dụng làm thạch dừa, Thông báo khoa học Trờng Đại học S phạm Hà Nội 2, số 1, trang 181- 186, Hà Nội Đinh Thị Kim Nhung (2000), Phân lập vi khuẩn Acetobacter từ số nguồn nguyên liệu Việt Nam, Báo cáo tổng kết đề tài cấp bộ, Hà Nội 10 Cazafa W, Young.D.J, Kawechi.M, Brow.R.M.Je, (2007) “ The future prospects of microbial celluose applicatios biomacromolecules”, p.l -12 11 Haim W, Shai S, Dorit A, Yehudit S, Gail V, Patrccia O, Moshe B(1997), Cdi – binding protein, a new factor regulating cellulose synthesis in Acetobacter xylinum, FEBS lettr 416, 207-201 12 Hong J.S, Moon S.H, Young G.K and Sang J.L (2001), Otimization of fermentation condition for the production of bacterial cellulose by a Hong Thị Hạnh - 53 - Lớp 31b Sinh- KTNN Khoá luận tốt nghiêp Chuyên ngnh Vi sinh vật häc newly isolated Acetobacter A9 in shacking cultures Biotechnol Appl Biochem, 331- 335 (printed in Great Britain) 13 Saibuatong O, Sangrungraungroj W, Sanchavanakit N, Phisalaphong M Biosynthesis and Characterization of bacterial cellulose Email: muenduen p@chula ac th 14 Fontana J.D, de Soura A.M, Fontana C.k, Torriani I.L, Moreschi J.C, Gallotti et al (1990), Appl Biotechnol, 24/25.253 - 264 15 http: // www Amolf nl/ publications/ theses/ diotallevi/ chap Pdf Hong Thị Hạnh - 54 - Lớp 31b Sinh- KTNN ... đầu thử nghiệm làm mặt nạ dỡng da Nội dung đề tài Nội dung đề tài Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter xylinum, chế tạo mặt nạ dỡng da để tìm hiểu đặc điểm, hình thái vi khuẩn Hong Thị Hạnh... ngμnh Vi sinh vËt häc Acetobacter, từ phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng theo hớng chế tạo mặt nạ dỡng da ý nghĩa đề tài Đề tài cho phÐp ph©n lËp, tun chän vi. .. nghiên cu ti: Phân lp, tuyn chọn vi khuẩn Acetobacter xylinum, chÕ t¹o mặt nạ dưỡng da Mục tiêu đề tài + Phân lập vi khn axetic tõ mét sè ngn nguyªn liƯu + Tun chän chđng vi khn Acetobacter xylinum