Luận văn sư phạm Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn ACETOBATER XYLINUM cho màng mỏng

Khoá luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi sinh vật học TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN -*** - TRẦN THỊ THOA PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM CHO MÀNG MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học HÀ NI - 2007 Trần Thị Thoa Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN Khoá luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi sinh vật học Lời cảm ơn hon thnh ti nghiên cứu em nhận hướng dẫn, bảo tận tình TS Đinh Thị Kim Nhung, thầy cô giảng dạy môn Vi sinh Đồng thời em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Khoa Sinh - KTNN tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2007 Sinh viên thực Trần Thị Thoa Lp 29A Khoa Sinh KTNN Trần Thị Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ ln tèt nghiƯp Chuyên ngành Vi sinh vật học LI CAM OAN Tụi xin khẳng định kết nghiên cứu riêng cá nhân tôi, đề tài nghiên cứu không trùng với cơng trình nghiên cứu tác giả khỏc Tỏc gi Trn Th Thoa Trần Thị Thoa Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN Khoá luận tốt nghiệp Chuyên ngµnh Vi sinh vËt häc MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Bản cam đoan Mục lục Danh mục bảng hình Đặt vấn đề Nội dung Chương Tổng quan tài liệu 1.1 Lược sử nghiên cứu phân loại vi khuẩn Acetobacter 1.2 Đặc điểm chung vi khuẩn Acetobacter 10 1.3 Một số đặc điểm nhóm vi khuẩn Acetobacter 14 Chương Đối tượng phương pháp nghiên cứu 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.2 Trang thiết bị hóa chất 18 2.3 Môi trường 19 2.4 Phương pháp nghiên cứu 19 Chương Kết nghiên cứu thảo luận 24 3.1 Phân lập vi khuẩn axetic từ số nguồn nguyên liệu 24 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum 29 cho màng mỏng 3.3 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum …………… 34 Chương Kết luận kiến nghị 37 4.1 Kết luận ………………………………………………………… 37 4.2 Kin ngh 37 Ti liu tham kho Trần Thị Thoa 38 Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ ln tốt nghiệp Chuyên ngành Vi sinh vật học DANH MC BẢNG VÀ HÌNH Trang Bảng: Bảng 1.1 Những đặc điểm phân biệt Acetobacter 12 Gluconobacter so sánh với Pseudomonas Bảng 3.1 Khảo sát khả tạo màng mẫu 29 vi khuẩn axetic Bảng 3.2 Khảo sát khả tạo màng số ……………………… 33 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum Hình : Hình Mẫu dịch lên men giấm ……………………………………… 24 Hình Mẫu lên men dịch hoa ……………………………………… 25 Hình Khuẩn lạc phân lập từ giấm 27 Hình Khuẩn lạc phân lập từ dịch hoa quả……………………………… 28 Hình Ảnh vi khuẩn Acetobacter xylinum ………………………… 35 kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần Hình Vi khuẩn Acetobacter xylinum G11 trờn mụi trng 36 thch nghiờng Trần Thị Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ ln tèt nghiƯp Chuyên ngành Vi sinh vật học T VN Ngy với phát triển khoa học kĩ thuật công nghệ, công nghệ sinh học (CNSH) trở thành ngành kinh tế chủ đạo nhiều quốc gia giới Là phận ngành CNSH, công nghệ vi sinh vật học phát triển mạnh mẽ với ứng dụng thiết thực vào nhiều lĩnh vực sống như: công nghiệp, nông nghiệp, y học Bằng việc ứng dụng trình lên men vi sinh vật vào sản xuất chế phẩm tận dụng tiết kiệm chi phí việc giải nhiều vấn đề ví dụ nơng nghiệp, cơng nghiệp, bảo vệ môi trường… Một chủng vi khuẩn ứng dụng rộng rãi công nghệ lên men vi sinh vật học vi khuẩn Acetobacter (còn gọi vi khuẩn giấm) Khi nuôi cấy loại vi khuẩn Acetobacter bề mặt mơi trường lỏng tạo thành lớp màng có chất hemixenluloza bề mặt thoáng dung dịch Màng dùng để làm sợi tơ khỏe có độ đàn hồi cao mơi trường nước nóng Màng xem nguyên liệu có tiềm ứng dụng để sản xuất micro có độ xác cao, sản xuất thạch dừa, sản xuất giấy chất lượng cao, công nghiệp sản xuất đồ ăn kiêng đồ ăn tráng miệng… [13] Trong công nghiệp, nông nghiệp vi khuẩn dùng để sản xuất EM (Effective Micoorganisms) có tác dụng đa hiệu nhiều lĩnh vực đặc biệt lĩnh vực xử lý rác thải: EM giúp khử mùi giảm chi phí 10 lần so với đốt rác Trong công nghiệp sản xuất giấy chất lượng cao người ta sử dụng nguyên liệu màng hemixenluloza tạo thành q trình ni cấy vi khuẩn giấm Trong công nghiệp thực phẩm, vi khuẩn Acetobacter (chủng Acetobacter xylinum) sử dụng để sản xuất thạch dừa - ăn giàu dinh dưỡng ph bin hin Trần Thị Thoa Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN Khoá luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi sinh vËt häc Hiện nay, nghiên cứu tính đặc biệt màng hemixenluloza cho thấy thay da tạm thời Cơng nghệ y học đại công nhận nghiên cứu ứng dụng màng hemixenluloza làm da nhân tạo hướng nghiên cứu triển vọng có giá trị Nó thay da tạm thời cho bệnh nhân bỏng từ cấp độ đến cấp độ Các bác sĩ phẫu thuật tạo hình, chữa bỏng cho bệnh nhân bỏng cấp độ ; ; ghép da bị nhiễm trùng sử dụng da nhân tạo thấy có kết tốt như: màng bám lên bề mặt nước bốc hơi, khơng cho nước lỏng thấm qua lại cho nước khí di chuyển qua, màng có độ giúp dễ dàng quan sát biến chuyển vết thương Đây đặc điểm quan trọng ứng dụng y học [13] Có thể nói vi khuẩn giấm ứng dụng nhiều sống Với mong muốn tìm hiểu thêm chủng vi khuẩn Acetobacter ứng dụng hữu ích đặc biệt ứng dụng làm da nhân tạo điều trị bỏng, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter xylinum cho mng mng Trần Thị Thoa Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN Khoá luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi sinh vËt häc NỘI DUNG Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lược sử nghiên cứu phân loại vi khuẩn giấm Từ lâu lịch sử người biết cách làm giấm song chưa nắm sở khoa học, khơng thể giải thích cách rượu lỗng lại biến thành giấm ăn Cho đến đầu kỷ XIX, khoa học kĩ thuật phát triển, đặc biệt với đời kính hiển vi, giới vi sinh vật khám phá, người biết giấm sản phẩm q trình lên men nhờ nhóm vi sinh vật mà ngày người ta gọi chúng vi khuẩn Acetobacter hay vi khuẩn axetic [4,5] Năm 1822, Person tiến hành nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter từ lớp màng thu bề mặt bình sản xuất giấm Ơng khẳng định loài vi sinh vật gọi Mycoderma aceti [7] Năm 18, Kützing sau loại bỏ hết vi sinh vật chum làm giấm thấy giấm khơng tạo thành Ơng đưa nhận xét: trình lên men giấm thiết phải có mặt vi sinh vật khơng khơng diễn chuyển hóa rượu thành giấm Cũng năm 18, Hansen (người Đan Mạch) tách từ màng giấm hai loại vi khuẩn khiết Mycoderma aceti Mycoderma pasteurianum Từ năm 1862 đến năm 1868, Pasteur nhờ trợ giúp đắc lực kính hiển vi chứng minh đắn nhận xét Kützing Hansen khẳng định chất q trình lên men giấm Ơng nghiên cứu lớp màng nhầy xuất bề mặt bia, rượu vang đến kết luận: màng tạo thành loại trực khuẩn, ông gọi trực khuẩn ú l Mycoderma aceti Trần Thị Thoa Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN Khoá luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi sinh vËt häc Cùng với nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter, nghiên cứu khác nghiên cứu sau nhằm tìm hiểu rõ thêm tìm cách cải thiện trình lên men giấm Hiện nay, người ta vào nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Acetobacter cách phân lập chủng vi khuẩn khiết, nghiên cứu đặc điểm cấu tạo, sinh lý, sinh hóa chúng nhằm tìm chủng tốt cho ứng dụng sở đối chiếu với tiêu chuẩn phân loại đưa 1.1.1 Các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn Acetobacter + Địa điểm nơi phân lập: nơi cư trú có liên quan đến điều kiện mơi trường sống + Đặc điểm hình thái: hình dạng tế bào, cách xếp tế bào, khả di động, màu sắc, hình thành tiêm mao, vỏ nhày, màu sắc nhuộm Gram… + Đặc điểm nuôi cấy: dựa vào trạng thái vết mọc, đặc điểm vết mọc, đặc tính vết mọc (trơn, xù xì…), tính chất vết mọc (đục, trong…), màu sắc vết mọc môi trường thạch Trên môi trường lỏng cần lưu ý tình trạng mơi trường sau thời gian ni cấy (đục hay trong, có mùi hay khơng có mùi) + Đặc điểm sinh lý: mối quan hệ với yếu tố nhiệt độ, pH môi trường, khả hình thành sắc tố, quan hệ với oxy (thuộc loại hiếu khí hay kỵ khí…), khả lên men axetic, khả sử dụng hợp chất vô hữu 1.1.2 Phân loại vi khuẩn Acetobacter Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Acetobacter thực từ kỉ XIX Từ năm 1898 Rothenback tiến hành phân loại, Hoyer (1899) Cũng năm 1899, Beijerink phân loại vi khuẩn Acetobacter dựa vào hai du hiu [6]: Trần Thị Thoa Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN Khoá luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi sinh vËt häc - Một là: Khả sử dụng đạm amoni để thực trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn Acetobacter - Hai là: Có hay khơng có giai đoạn di động q trình phát triển Còn Heneberg (1926) lại chia vi khuẩn axetic thành nhóm dựa vào nơi sống đặc trưng chúng: - Nhóm 1: vi khuẩn khơng phát triển bia hoa Hublon độc với chúng - Nhóm 2: vi khuẩn phát triển bia - Nhóm 3: vi khuẩn phát triển dung dịch rượu vang - Nhóm 4: vi khuẩn dùng để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh Năm 1934, theo nghiên cứu nhà vi khuẩn học người Hoa Kỳ, vi khuẩn axetic có khả sử dụng hợp chất tương đối đơn giản cacbon nitơ nên kết hợp chúng vào họ Nitrobacteriaceae Từ vi khuẩn axetic gọi Acetobacter Năm 1936, Kenyver Wanniel Staniel đề xuất ý kiến ghép vi khuẩn Acetobacter vào họ Pseudomonas chúng có tượng ghép cực xoắn phần di động Năm 1948, Vaught công bố kết thu quan sát di động nhiều loại vi khuẩn: Acetobacter aceti, Acetobacter oxydans, Acetobacter zancens, Acetobacter melanognum, Acetobacter pasteurianum Ông kết luận lồi thuộc loại có đơn mao cực xác nhận vị trí vi khuẩn Acetobacter họ Pseudomonas Ngày nay, theo khóa phân loại Bergeys (1914) nhiều tác giả khác vi khuẩn Acetobacter Gluconobacter – vi khuẩn acetic - xếp vào họ riêng Acetobacteriaceae Trong khóa phân loại Bergeys, đáng ý khóa phân loại lồi thuộc giống Acetobacter, ơng phân ging Acetobacter thnh hai loi: Trần Thị Thoa Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN Khoá luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi sinh vËt häc Hình Mẫu lên men dịch hoa lỗng Mơi trường để phân lập vi khuẩn Acetobacter môi trường (thành phần môi trường trình bày mục 2.3) Mơi trường (mơi trường thạch đĩa) khử trùng nồi hấp cao áp Autoclave áp suất 0,5 atm, nhiệt độ 110oC, hấp lần ngày liên tiếp Nguyên tắc phương pháp khử trùng nồi cao áp: kết hợp tác động áp lực nhiệt độ cao để tiêu diệt vi sinh vật (kể nội bào tử chịu nhiệt vi khuẩn).Trong nồi hấp cao áp, mơi trường bị làm nóng nước bão hòa, áp suất nồi tạo áp suất nước Khi áp suất đồng hồ áp kế khoảng 0,2 atm, dùng van xả hết nồi kim áp suất số (để loại hết khơng khí sót lại nồi) Đóng van lại đưa áp suất đến mức cần thiết, giữ đủ theo thời gian yêu cầu Ở lần hấp cuối bổ sung rượu etylic axit axetic Sau trùng cần để vào tủ ấm 24h – 28h để kiểm tra vụ trựng ca mụi trng Trần Thị Thoa Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN Khoá luận tốt nghiệp Chuyên ngµnh Vi sinh vËt häc Để phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter ta dùng que cấy đũa thủy tinh lấy lượng màng định cho vào nước vô trùng Dùng que cấy đũa thủy tinh đánh tan hay lấy dịch lên men pipet vơ trùng, tiến hành pha lỗng (theo phương pháp pha loãng Pasteur) độ pha loãng khác nhau: 10 -1; 10 -2; 10 -3; …; 10 -9; 10 -10 Sau nhỏ giọt dung dịch pha loãng nồng độ từ 10 -7 đến 10 -10 lên môi trường thạch đĩa (môi trường số đổ hộp petri) Dùng bàn trang thủy tinh vô trùng dàn giọt dịch khắp bề mặt thạch để tách riêng rẽ tế bào vi sinh vật Cho hộp petri vào tủ ấm, nuôi nhiệt độ 30oC Sau – ngày, bề mặt thạch đĩa xuất khuẩn lạc to nhỏ khác nhau, có đường kính 0,8 – 2,5 mm (đơi xuất khuẩn lạc lớn có đường kính tới – mm) bề mặt trơn bóng, phần lồi lên dày màu sẫm xung quanh, có dạng bề mặt xù xì, khơ, mép khuẩn lạc nhăn nheo Sau có khuẩn lạc môi trường thạch đĩa, dựa vào đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter môi trường thạch đĩa (đã nêu trên) chọn khuẩn lạc riêng rẽ, kích thước lớn, tròn, bề mặt trơn bóng dùng que cấy đầu tròn khử trùng lửa đèn cồn gợt lấy khuẩn lạc, khuẩn lạc cấy ống thạch nghiêng, ống mẫu vi khuẩn mã hóa kí hiệu khác Từ dịch lên men giấm, sau thời gian phân lập, thu 30 mẫu khuẩn lạc Các mẫu có đường kính 0,8 – mm, bề mặt trơn bóng, phần lồi có màu sẫm (Hình 3) Từ 30 mẫu khuẩn lạc cấy 30 ống thạch nghiêng có kí hiệu từ G1 đến G30 TrÇn Thị Thoa Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN Khoá luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi sinh vật học Hỡnh Khuẩn lạc phân lập từ giấm Từ dịch lên men dịch hoa lỗng chúng tơi thu 27 mẫu khuẩn lạc môi trường thạch đĩa Tôi nhận thấy khuẩn lạc phân lập từ dịch hoa ngồi khuẩn lạc có bề mặt trơn bóng, phần lồi có màu sẫm lớn, xuất khuẩn lạc khơng có màu, mỏng hạt sương nhỏ, bề mặt trơn bóng, dễ dàng dùng que cấy gạt khỏi mơi trường (Hình 4) Từ 27 mẫu khuẩn lạc đem cấy 27 ống thạch nghiờng c kớ hiu t D1 n D27 Trần Thị Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ ln tèt nghiệp Chuyên ngành Vi sinh vật học Hỡnh Khun lạc phân lập từ dịch hoa Kết quả: phân lập thu 57 mẫu vi khuẩn axetic từ hai nguồn nguyên liệu giấm dịch hoa loãng Những mẫu vi khuẩn phân lập giữ ống thạch nghiêng, cấy chuyển từ ống thạch nghiêng sang ống thạch nghiêng khác với chu kì tháng lần để tránh thối hóa giống Từ mẫu vi khuẩn axetic thu tiến hành tuyển chọn mẫu vi khuẩn Acetobacter khiết có khả tạo màng dai môi trường nuôi cấy dịch thể 3.2 Tuyển chọn mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng, dai mơi trường nước dừa Khi có mẫu vi khuẩn axetic phân lập từ hai nguồn nguyên liệu cần tiến hành thử khả lên màng mẫu môi trường dịch thể nước dừa để tuyển chọn mẫu có khả nng to mng dai Trần Thị Thoa Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN Khoá luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi sinh vËt häc Tiến hành nuôi cấy 57 mẫu vi khuẩn thu trên môi trường nước dừa theo dõi, quan sát khả tạo màng, màu dịch nuôi cấy Kết thu sau 15 – 18 ngày nuôi cấy dẫn bảng sau: Bảng 3.1 Khảo sát khả tạo màng mẫu vi khuẩn axetic Khả tạo màng STT Kí hiệu mẫu Màng tan Môi trường nuôi cấy Màng dai Đục Trong Axetic G1 + _ + _ Axetic G2 + _ + _ Axetic G3 _ + _ + Axetic G4 _ + + _ Axetic G5 _ + _ + Axetic G6 + _ + _ Axetic G7 + _ + _ Axetic G8 + _ + _ Axetic G9 + _ + _ 10 Axetic G10 _ + _ + 11 Axetic G11 _ + + _ 12 Axetic G12 + _ + _ 13 Axetic G13 + _ _ + 14 Axetic G14 + _ _ + 15 Axetic G15 + _ _ + 16 Axetic G16 + _ + _ 17 Axetic G17 _ + + _ 18 Axetic G18 + _ + _ 19 Axetic G19 + _ + _ 20 Axetic G20 + _ + _ Trần Thị Thoa Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN Khoá luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi sinh vật häc 21 Axetic G21 + _ + _ 22 Axetic G22 + _ _ + 23 Axetic G23 + _ _ + 24 Axetic G24 _ + _ + 25 Axetic G25 _ + + _ 26 Axetic G26 _ + + _ 27 Axetic G27 + _ _ + 28 Axetic G28 + _ _ + 29 Axetic G29 + _ _ + 30 Axetic G30 + _ + _ 31 Axetic D1 + _ _ + 32 Axetic D2 + _ _ + 33 Axetic D3 + _ + _ 34 Axetic D4 + _ + _ 35 Axetic D5 _ + _ + 36 Axetic D6 + _ _ + Axetic D7 + _ _ + 38 Axetic D8 + _ _ + 39 Axetic D9 + _ + _ 40 Axetic D10 _ + + _ 41 Axetic D11 _ + + _ 42 Axetic D12 + _ + _ 43 Axetic D13 + _ + _ 44 Axetic D14 + _ _ + 45 Axetic D15 + _ + _ 46 Axetic D16 + _ _ + Trần Thị Thoa Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN Khoá luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi sinh vật häc 47 Axetic D17 + _ _ + 48 Axetic D18 _ + + _ 49 Axetic D19 _ + _ + 50 Axetic D20 _ + _ + 51 Axetic D21 + _ + _ 52 Axetic D22 + _ _ + 53 Axetic D23 + _ + _ 54 Axetic D24 + _ + _ 55 Axetic D25 + _ _ + 56 Axetic D26 + _ _ + 57 Axetic D27 _ + + _ Ghi chú: (+) : có (-) : khơng Qua kết dẫn bảng ta thấy có 41 mẫu vi khuẩn axetic tạo màng tan, 16 mẫu vi khuẩn axetic cho màng dai với độ dày mỏng khác Chúng chia thành loại: + Loại thứ nhất: mẫu vi khuẩn axetic cho màng dai, dịch nuôi cấy + Loại thứ hai: mẫu cho màng dai, dịch nuôi cấy đục + Loại thứ ba: cho màng tan, dịch nuôi cấy + Loại thứ tư: cho màng tan, dịch nuôi cấy đục Chúng giữ lại 16 chủng vi khuẩn axetic cho màng dai để tiếp tục tiến hành thí nghiệm nhằm tuyển chọn nhng chng vi khun Acetobacter thun khit Trần Thị Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ ln tèt nghiƯp Chuyên ngành Vi sinh vật học xỏc nh xem 16 mẫu vi khuẩn axetic cho màng dai Acetobacter hay Gluconobacter, thử mẫu trên môi trường A Kết thu được: Cả 16 mẫu tạo vòng sáng xung quanh khuẩn lạc có lớp cặn đục viền khuẩn lạc hướng phía vòng sáng Dựa vào kết thí nghiệm chúng tơi khẳng định 16 mẫu vi khuẩn vi khuẩn Acetobacter khơng phải Gluconobacter Như có vi khuẩn Acetobacter có khả tạo màng dai Gluconobacter khơng có khả Đồng thời tơi khẳng định 16 mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum ni cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum môi trường lỏng chúng tạo thành màng bề mặt thoáng dung dịch Màng sản phẩm trình trao đổi chất vi khuẩn trình sinh trưởng phát triển Màng xenluloza gồm bó vi sợi xenluloza đẩy ngồi nhờ nhệ thống lỗ nằm màng tế bào tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum Những dải xenluloza bện vào tạo thành màng Chất kiến tạo trình tổng hợp xenluloza glucoza – thành phần mơi trường ni cấy Acetobacter xylinum Như tất vi khuẩn Acetobacter chọn cho màng dai mà có vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả tạo màng dai môi trường nước dừa Từ 16 mẫu vi khuẩn Acetobacter tơi tiến hành làm thí nghiệm tiếp nhằm tìm mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng Chúng tiến hành tuyển chọn mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng theo tiêu chí sau: + Màng tạo mỏng, dai + Bề mặt màng trn + Thi gian to mng ngn Trần Thị Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ ln tèt nghiƯp Chuyên ngành Vi sinh vật học Chỳng tụi dựng 16 mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum tuyển chọn cấy sang môi trường lỏng (môi trường số 3, thay nước máy nước dừa) Môi trường khử trùng nồi hấp Autoclave áp suất 0,5 atm thời gian 30 phút, ngày liên tiếp để nguội, bổ sung thêm rượu etylic, axit axetic 2%, cấy giống Theo dõi khả tạo màng, độ dày màng, đặc điểm mơi trường ni cấy Khi theo dõi q trình hình thành màng vi khuẩn môi trường số 3, thấy đa số mẫu màng bắt đầu hình thành ngày thứ 7, thứ Khoảng bốn ngày kể từ màng xuất hiện, màng dày lên nhanh, ngày sau màng phát triển chậm dần Màng mỏng dày, trơn nhăn, dai, môi trường nuôi cấy đục Kết thu sau 15 ngày nuôi cấy sau: Bảng 3.2 Khảo sát khả tạo màng số mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum Khả tạo màng STT Kí hiệu mẫu Mơi trường ni cấy Mỏng Dày Đục Trong Acetobacter xylinum G3 _ + _ + Acetobacter xylinum G4 + _ + _ Acetobacter xylinum G5 _ ++ _ + Acetobacter xylinum G10 _ + _ + Acetobacter xylinum G11 + _ _ + Acetobacter xylinum G17 _ ++ + _ Acetobacter xylinum G24 _ ++ _ + Acetobacter xylinum G25 _ + + _ Acetobacter xylinum G26 _ ++ + _ _ + _ + 10 Acetobacter xylinum D5 Trần Thị Thoa Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN Khoá luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi sinh vËt häc 11 Acetobacter xylinum D10 _ + + _ 12 Acetobacter xylinum D11 + _ + _ 13 Acetobacter xylinum D18 _ + + _ 14 Acetobacter xylinum D19 _ + _ + 15 Acetobacter xylinum D20 _ + _ + 16 Acetobacter xylinum D27 _ + + _ Ghi chú: Dấu (+) : có Dấu (-) : không Dấu (+ +…) : màng dày tăng dần Qua theo dõi, quan sát trình hình thành màng vào độ dày màng dai sau 15 ngày nuôi cấy, nhận thấy 16 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum có phát triển màng, chúng phổ biến loại: Loại thứ nhất: Cho màng mỏng (≤ 1cm), dịch nuôi cấy Loại thứ hai: Cho màng mỏng, dịch nuôi cấy đục Loại thứ ba: Cho màng dày (≥ cm) dịch nuôi cấy Loại thứ tư: Cho màng dày, dịch nuôi cấy đục Vi khuẩn Acetobacter xylinum vi khuẩn hiếu khí nên môi trường nuôi cấy lỏng, tĩnh chúng tạo thành lớp màng xenluloza tế bào vi khuẩn nằm mắc Màng dày, mỏng khác mang đặc điểm tùy tính chất loại 3.3 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum Để quan sát hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum tiến hành làm tiêu nhuộm Gram 16 mẫu vi khuẩn Lấy mẫu váng dịch nuôi cấy vi khuẩn cấy ống thạch nghiêng làm tiêu nhuộm Gram Đưa lên kính hiển vi để quan sát thấy vi khuẩn Acetobacter xylinum trực khuẩn hình que, đứng riêng rẽ xếp thành chuỗi, không di động, vi khuẩn Gram âm (Gr -) bắt màu hng ca Fucshin Trần Thị Thoa Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN Khoá luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi sinh vËt häc Khi quan sát kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần thấy rõ tế bào vi khuẩn dài có kích thước khoảng µm bao bọc chất nhầy tạo thành váng dầy bắt màu hồng (khi nhuộm thuốc nhuộm iôt H2SO4 váng bắt màu xanh phản ứng hemixenluloza) Trên kính quan sát thấy bắt màu đậm nhạt khác phần khác bên tế bào vi khuẩn (Hình 5) Hình Ảnh vi khuẩn Acetobacter xylinum kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần Từ kết so sánh trình hình thành màng, độ dày màng, hình thái tế bào kính hiển vi mẫu, chọn mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng (độ dày màng 0.5 cm) có kí hiệu G11 Chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum G11 có đặc tính cho màng mỏng cả, màng dai, có màu trắng thich hp ng dng lm da nhõn to Trần Thị Thoa Líp 29a Khoa Sinh - KTNN Kho¸ ln tèt nghiệp Chuyên ngành Vi sinh vật học Hỡnh Vi khuẩn Acetobacter xylinum G11 nuôi cấy môi trường thạch nghiờng Trần Thị Thoa Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN Khoá luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi sinh vật học Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ mẫu dịch lên men hai nguồn nguyên liệu giấm dịch hoa lỗng, chúng tơi phân lập 57 mẫu khuẩn lạc vi khuẩn axetic có 16 mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum Khi tiến hành thử khả lên màng 16 mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum trên, kết hợp với quan sát hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần chọn mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng dai, mỏng 4.2 Kiến nghị Trên kết nghiên cứu bước đầu em chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum G11 cho màng mỏng Do thời gian nghiên cứu có hạn hạn chế lực thân nên em nghiên cứu sâu chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum G11 Em mong tiếp tục có nghiên cứu ảnh hưởng nhân tố như: (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, glucoza, pH,… từ tìm mơi trường dinh dưỡng thích hợp cho tạo màng chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum G11 cho màng mỏng Em mong nhà trường, khoa tạo điều kiện cho chúng em nghiên cứu sâu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng Đây hướng nghiên cứu có triển vng hin Trần Thị Thoa Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN Khoá luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi sinh vËt häc TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lân Dũng cộng (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 1, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng cộng (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 2, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng cộng (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 3, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực tập vi sinh vật học (sách dịch), Nxb “Mir” Moskwa, Nxb Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo (1986), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990), Thực hành vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, Hà Nội Đinh Thị Kim Nhung (1997), Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn Acetobacter ứng dụng làm thạch dừa, Thông báo khoa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, số 1, trang 181 – 186, Hà Nội Đinh Thị Kim Nhung (2000), Phân lập vi khuẩn Acetobacter từ số nguồn nguyên liệu Việt Nam, Báo cáo tổng kết đề tài cấp bộ, Hà Nội 10 Nguyễn Thị Tuyến (2006), Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố tới khả tạo màng vi khuẩn Acetobacter xylinum N13, Khóa luận tốt nghiệp, Hà Nội 11 Fontana J.D, de Soura A.M, Fontana C.K, Torriani I.L, Moreschi J.C, Gallotti et al (1990), Appl Biochem Biotechnol, 24/25 253 – 264 Trần Thị Thoa Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN Khoá luận tốt nghiệp Chuyên ngành Vi sinh vật học 12 Haim W, Shai S, Dorit A, Yehudit S, Gail V, Patriccia O, Moshe B (1997), Cdi – binding protein, a new factor regulating cellulose synthesis in Acetobacter xylinum, FEBS letter 416, 207 – 201 13 Hong J.S, Moon S.H, Young G.K and Sang J.L (2001), Otimization of fermentation condition for the production of bacterial cellulose by a newly isolated Acetobacter A9 in shacking cultures Biotechnol Appl Biochem, 331 – (printed in Great Britain) Trần Thị Thoa Lớp 29a Khoa Sinh - KTNN ... Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng mỏng Mục đích tiến hành nghiên cứu để chọn chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng mỏng, chúng tơi tiến hành tuyển chọn chủng cho màng mỏng dựa... thảo luận 24 3.1 Phân lập vi khuẩn axetic từ số nguồn nguyên liệu 24 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum 29 cho màng mỏng 3.3 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum. .. Từ mẫu vi khuẩn axetic thu tiến hành tuyển chọn mẫu vi khuẩn Acetobacter khiết có khả tạo màng dai môi trường nuôi cấy dịch thể 3.2 Tuyển chọn mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng mỏng, dai