Luận văn sư phạm Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn có khả năng phân giải Cellulose trong đất đồi Đại Lải

Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học mở đầu Lý chọn đề tài Vi sinh vật (Microorganisms) tất sinh vật có hình thể bé nhỏ, muốn thấy rõ đợc ngời ta phải sư dơng tíi kÝnh hiĨn vi VSV ph©n bè réng khắp nơi Trái Đất, từ đáy biển sâu đến độ cao hàng nghìn mét không khí, từ thể thực vật, động vật đến vật liệu khô cằn nh kính, sắt phát thấy sống VSV Tuy nhiên đất nơi c− tró phỉ biÕn nhÊt cđa c¸c nhãm VSV kĨ thành phần số lợng Bởi chúng đóng vai trò quan trọng, trớc hết trình hình thành phát triển đất Chính nhờ VSV tự dỡng mà thành phần đá mẹ bị phân huỷ dần thành đất Sự hoạt động nhóm VSV khác hình thành tích luỹ chất mùn làm nên độ phì nhiêu đất VSV tham gia mạnh mẽ vào trình chuyển hoá vật chất đất, góp phần khép kín vòng tuần hoàn vật chất tự nhiên Hầu hết khâu chu trình chuyển hoá vËt chÊt ®Êt ®Ịu cã sù tham gia cđa VSV Trớc hết nhóm VSV tham gia vào trình phân huỷ cellulose- hợp chất hữu có nhiều đất, thành phần cấu tạo nên thể thực vật cellulose chiếm 90% trọng lợng khô, loài gỗ khác cellulose chiếm 40-50% Có nhiều nhóm VSV có khả phân giải cellulose c trú đất nh vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, niêm vi khuẩn Đáng ý xạ khuẩn (Actinomycetes) Chúng phân bố rộng rãi đất, tham gia vào nhiều trình phân giải hợp chất hữu cơ: cellulose, tinh bột góp phần khép kín vòng tuần hoàn vật chất tự nhiên Đặc tính đợc ứng dụng trình chế biến, phân huỷ rác, xử lý bã thải nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm Từ lý với mục đích tìm hiểu, làm quen với phơng pháp nghiên cứu VSV nói chung, phơng pháp nghiên cứu xạ khuẩn phân giải cellulose nói Đại học s phạm H Nội K31B Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học riêng, chọn đề tài Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn có khả phân giải cellulose đất đồi Đại Lải Mục tiêu đề tài - Phân lập, khảo sát mật độ phân bố xạ khuẩn có khả phân giải cellulose ba độ sâu: 5cm, 10cm, 20cm địa điểm đồi Đải Lải thuộc phờng Đồng Xuân - thị xã Phúc Yên - tỉnh Vĩnh Phúc - Đa số nhận xét dẫn đến nguyên nhân có tập trung xạ khuẩn phân giải cellulose vị trí - Thử hoạt tính enzym cellulase số chủng xạ khuẩn phân lập đợc - Nghiên cứu ảnh hởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp cellulase số chủng thuộc chi Micromonospora - Nghiên cứu ảnh hởng độ pH môi trờng đến khả sinh tổng hợp cellulase mét sè chñng thuéc chi Micromonospora Néi dung cña đề tài Nội dung đề tài Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn có khả phân giải cellulose đất đồi Đại Lải để tìm hiểu đặc điểm, phân bố xạ khuẩn, khẳng định đợc vai trò chúng đất, đồng thời tìm hiểu điều kiện ảnh hởng: độ ẩm, độ pH, loại đất tới phân bố xạ khuẩn phân giải cellulose ý nghĩa đề tài Đề tài góp phần tạo sở khoa học cho phơng thức canh tác, cày xới, cải tạo đất, bón phân theo hớng lợi dụng VSV phân giải cellulose, tăng cờng trình phân giải hợp chất hữu để làm giàu dinh dỡng cho đất, tăng suất cho trồng Mặt khác đề tài cho phép tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả phân giải cellulose mạnh, từ ®ã cã thĨ t¹o mét chÕ phÈm VSV chøa chủng xạ khuẩn phục vụ cho việc ủ rác sinh học Đại học s phạm H Nội 2 K31B Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học Chơng tổng quan ti liệu 1.1 Sơ lợc nhóm vi sinh vật có khả phân giải cellulose Tất nhóm VSV phân giải cellulose thuộc nhóm dị dỡng, hoại sinh Chúng có khả nhờ có hệ enzym cellulose ngoại bào Trong đất nhóm VSV gồm nhiều loại khác nhau: vi khuẩn, niêm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc Vi nấm nhóm có khả phân giải cellulose tiết môi trờng lợng lớn enzym đầy đủ thành phần Các nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose đáng ý Tricoderma Hầu hết loài thuộc chi Tricoderma sống hoại sinh đất có khả phân giải cellulose Chúng tiến hành phân giải tàn d thực vật để lại đất góp phần chuyển hoá lợng hữu khổng lồ Trong nhóm vi nấm, Tricoderma có nhiều giống khác có khả phân giải cellulose nh: Aspergillus, Fusarium, Mucor Nhiều loài vi khuẩn có khả phân huỷ cellulose, nhiên cờng độ không mạnh vi nấm Do số lợng enzym tiÕt m«i tr−êng cđa vi khn th−êng nhá hơn, thành phần loại enzym không đầy đủ, đất thờng có loài vi khuẩn có khả tiết loại enzym hệ enzym cellulose Nhóm tiết loại enzym, nhóm khác tiết loại khác, chúng phối hợp với để phân giải chất mối quan hệ hữu sinh Nhóm vi khuẩn hiếu khí đại diện là: Cellulomonas, Pseudomonas, Achromonobater, Bacillus Nhóm vi khuẩn kị khí Clostridium, đặc biệt cầu khuẩn thuộc chi Ruminococcus có khả phân giải cellulose thành đờng axit hữu cơ, sống cỏ động vật nhai lại Chính nhờ nhóm mà trâu bò sử dụng đợc cellulose có cỏ, rơm rạ làm thức ăn Đại häc s− ph¹m Hμ Néi K31B – Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học Niêm vi khuẩn (Myxobacteriales) vi khuẩn Gram (-) có khuẩn lạc nhày ớt, tế bào hình que, nhỏ bé (0,3 - 0,4ì 0,7 - 10m), uốn cong, thờng có đầu nhọn, có thành tế bào mỏng nhuộm màu so với vi khuẩn khác Niêm vi khuẩn phân giải cellulose đợc tìm thấy giống: Promyxobacterium, Cytophaga, Sporocytophaga, Sorangium Chúng sống môi trờng axit kiềm Trên bề mặt vật liệu chứa cellulose, niêm vi khuẩn phát triển dạng thể nhày hình xác định, lan rộng, có màu vàng, da cam hay đỏ Màu sắc khuẩn lạc thờng tơng ứng với chỗ cellulose bị phân giải nhiều hay Xạ khuẩn có khả phân giải cellulose mạnh, tiết đầy đủ thành phần hệ enzym cellulose Vì có khả phân giải cellulose mà sống mối quan hệ hỗ sinh với loài khác Xạ khuẩn phân giải cellulose gồm giống: Proactinomyces, Actinomyces, Micromonospora, Streptomyces 1.2 Sơ lợc xạ khuẩn 1.2.1 Vị trí xạ khuẩn hệ thống sinh giới Xạ khuẩn (Actinomycetes) nhóm VSV lớn giới Bacteria Chóng thc nhãm VSV Gram (+) vµ lµ nhãm chuyển tiếp Nấm (Fungi) vi khuẩn (Bacteria) Theo Krassilnikov (1970) xạ khuẩn (Actinomycetes) đợc tách thành lớp riêng gồm có xạ khuẩn bậc cao (có hệ sợi phát triển, có quan sinh sản riêng) nhóm xạ khuẩn bậc thấp (có hệ sợi phát triển, tế bào có dạng hình que hình cầu) Xạ khuẩn có hệ sợi ngắn nh họ Mycobacteriaceae Actinomycetaceae, hệ sợi dài nh họ Streptomycetaceae Xạ khuẩn đợc Bergey xếp vào riêng Actinomycetales (Bergeys Manual, 1989) thuộc siêu giới nhân sơ (Prokaryota), Giới Bacteria, Ngành Firmicutes, Lớp Actinobacteria, Lớp phụ Actinobacteriaceae Theo hệ thống phân loại nay, xạ khuẩn thuộc nhóm VSV nhân nguyên thuỷ (Prokaryota) thc giíi khëi sinh (Monera) hƯ thèng ph©n §¹i häc s− ph¹m Hμ Néi K31B – Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học loại giới hay hệ thống phân loại giới xạ khuẩn thuộc giới vi khuẩn chuẩn (Eubacteria) thuộc siêu giới nhân sơ Bộ xạ khuẩn gồm 10 hä: Actinomycetaceae, Actinoplanaceae, Permatophilaceae, Frankiaceae, Micromonosporaceae, Thermomonosporaceae, Micobacteriaceae, Nocarddiceae Streptomycetaceae 1.2.2 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn 1.2.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn Tuỳ loại môi trờng mà xạ khuẩn có hình thái khác Trên môi trờng đặc, xạ khuẩn phát triển thành khuẩn lạc Tuỳ theo loài, môi trờng nuôi cấy mà kích thớc màu sắc khuẩn lạc khác nh: đỏ, da cam, vàng, nâu, tím, hồng, xám Khuẩn lạc xạ khuẩn thờng chắc, xù xì, có dạng da, dạng nhung tơ, hay dạng màng dẻo thờng có cấu trúc ba lớp: lớp có cấu trúc sợi bền chặt, lớp có cấu trúc tổ ong lớp có cấu trúc tơng đối xốp Cấu tróc khn l¹c x¹ khn víi h−íng sinh tr−ëng môi trờng tạo hệ sợi chất (HSCC) mặt môi trờng tạo hệ sợi khí sinh (HSKS) Đờng kính hệ sợi xạ khuẩn thay đổi khoảng 0,2-1,0m đến 2,0-3,0m Đa số xạ khuẩn có hệ sợi phân nhánh mạnh, vách ngăn Màu sắc hệ sợi đa dạng, gặp màu trắng, vàng, da cam, đỏ, nâu, lục, tím, đen HSCC sinh sắc tố tan nớc dung môi hữu HSKS tận thờng chuỗi bào tử có dạng xoắn, lợn sóng, thẳng, vòng Đây đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn Các bào tử xạ khuẩn có hình tròn, hình bầu dục, hình que, hay hình trụ Cấu trúc bề mặt bào tử nhẵn (Smooth), có gai (Spinny), khối u (Warty), nếp nhăn (Rugose) hay dạng tóc (Hair- like) Hình dạng, kích thớc, cấu trúc bề mặt bào tử tiêu quan trọng để định loại xạ khuẩn Đại học s phạm H Nội K31B Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học Khi nuôi cấy xạ khuẩn môi trờng dịch thể, xạ khuẩn mọc thành dạng màng hay dạng vòng thành bình nuôi cấy, bề mặt môi trờng hay thành dạng bọt kết tủa kiểu vi khuẩn Khi nuôi cấy chìm máy lắc nồi lên men đợc khuấy đảo xạ khuẩn phát triển thành dạng sợi cặn xốp Nhng thờng gặp xạ khuẩn phát triển thành cầu nhỏ chứa đầy môi tr−êng, kÝch th−íc tõ 0,1mm ®Õn 2- 3mm 1.2.2.2 CÊu tạo xạ khuẩn Xạ khuẩn có cấu tạo tơng đối gièng vi khuÈn gåm cã thµnh tÕ bµo, mµng tÕ bào chất, vật chất nhân sơ hạt dự trữ Xạ khuẩn thuộc nhóm VSV Gram (+) Thành tế bào dày khoảng 20nm có vai trò trì hình dạng hệ sợi bảo vệ tế bào, đợc cấu tạo chủ yếu gồm lớp glucopeptide, gốc N - Acetylglucosamine liên kết với N - Acetylmuramic (hoặc N Glycolylmuramic ví dụ nh chi Micromonospora) Căn vào kết cấu hoá học chia thành tế bào xạ khuẩn thành nhóm sau: Nhóm (Type I): Có chứa L-Diaminopimelic (L-ADP) glycine Gồm có chi Streptomyces, Streptoverticillium, Chairia, Nocardioider • Nhãm (Type II): Cã chứa Meso-Diaminopimelic (Meso-ADP) glycine Gồm chi Micromospora, Actinoplans, Ampullariella, Dactilosporangium • Nhãm (Type III): Cã chøa Meso- Diaminopimelic (Meso-DAP) Gåm cã Actinomadura, Actinobigfida, Dermatophilus, Geodermatophilus, Nocardiopsis, Micronobispora… • Nhãm (Type IV): Cã chøa Meso-Diaminopimelic (Meso-DAP) Gåm có Nocardia, Oerskovia, Promicromonospora, Pseudonocardia, Rhodococcus, Mycrobacterium Đại học s phạm H Nội K31B Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học 1.2.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá xạ khuẩn Xạ khuẩn nhóm thể dị dỡng, chúng sử dụng đờng, rợu, axít hữu cơ, lipit, protein nhiều hợp chất khác để làm nguồn cacbon Còn nitrat, nitrit, muối amon, ure, axit amin, pepton, cao men, cao thịt để làm nguồn nitơ loài khác khả hấp thụ hợp chất khác Phần lớn xạ khuẩn VSV hiếu khí, a ẩm, nhiệt độ thích hợp cho sinh trởng phát triển 25 - 300C Đa số xạ khuẩn phát triển tốt môi trờng có pH 6,8 - 7,0, số có khả phát triển tốt môi trờng kiềm Xạ khuẩn nhóm vi khuẩn Gram (+), đặc biệt khác với sinh vật khác nhóm nhân sơ có tỉ lệ G + X cao (>70%), vi khuẩn thấp (25% - 45%) Một đặc điểm đáng lu tâm xạ khuẩn chúng không bền vững mặt di truyền thờng xảy xếp lại phân tử ADN Điều gây tính đa dạng hình thái, tính chất sinh lí, sinh hoá xạ khuẩn (khả đồng hoá nguồn cacbon, khả đồng hoá nguồn nitơ, hoạt tính kháng sinh, tính kháng thuốc, khả phân giải cellulose) 1.2.3 Phân bố xạ khuẩn Xạ khuẩn nhóm VSV phân bố rộng rãi tự nhiên Xạ khuẩn phân lập từ đất, nớc, không khí, bùn, rác Đặc biệt đất xạ khuẩn chiếm số lợng lớn (Kuster, 1986) Theo Waksman đất xạ khuẩn chiếm 9% - 45% tổng số VSV Và gam đất có chứa tới 2900024.000.000 mầm xạ khuẩn Tuy nhiên tuỳ vùng đất khác giới mà có biến đổi lớn số lợng xạ khuẩn đất Số lợng xạ khuẩn miền Nam bán cầu cao miền Bắc bán cầu Ngoài số lợng xạ khuẩn đất phụ thuộc vào mức độ canh tác, độ phì nhiêu đất, mức độ che phủ thực vật Đất giàu dinh dỡng, hữu , khoáng có nhiều xạ khuẩn so với đất nghèo dinh dỡng Trong gam đất canh tác phân lập đợc 5.000.000 CFU/g xạ khuẩn Đất vùng sa mạc khô Đại học s phạm H Nội K31B Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học nóng, nghèo dinh dỡng có số lợng xạ khuẩn hơn, dao động khoảng 10.000 - 100.000 CFU/g Xạ khuẩn nhóm VSV a trung tính hay kiềm yếu, phân bố xạ khuẩn đất phụ thuộc vào độ pH đất đất có độ pH trung tính kiềm có mật độ xạ khuẩn cao so với vùng đất có độ pH kiềm axit (chua) Đồng thời số lợng xạ khuẩn phụ thuộc vào thời điểm năm Do lấy mẫu đất nghiên cứu cần phải ý tới điều kiện nh thành phần lớp đất, sinh cảnh, thời điểm lấy mẫu, độ ẩm, nhiệt độ 1.2.4 Vai trò xạ khuẩn Xạ khuẩn nhiỊu lo¹i VSV cã ý nghÜa quan träng tù nhiên vai trò tích cực việc tham gia vào trình chuyển hoá hợp chất đất, nớc Xạ khuẩn có khả sinh chất kháng sinh, có 60%-70% xạ khuẩn phân lập từ đất có khả nh: Atinoplanes, Streptoverticinnium, Streptomyces chất kháng sinh có giá trị chúng sinh đợc sử dụng rộng rãi y học Mặt khác xạ khuẩn có khả phân giải cellulose bã thải nông nghiƯp, c«ng nghiƯp thùc phÈm nh»m øng dơng chÕ biến thức ăn gia súc, phân bón hữu 1.2.5 Phân loại xạ khuẩn 1.2.5.1 Sơ lợc lịch sử phân lo¹i x¹ khn Tr−íc thÕ kØ XIX, ng−êi ta xÕp xạ khuẩn vào giới nấm (Fungi) Về sau, nghiên cứu cho thấy chúng có nhân nguyên thuỷ, kích thớc bỊ ngang nhá nh− vi khn nªn ng−êi ta xÕp vào giới vi khuẩn (Eubacteria) Foster ngời phân lập loài xạ khuẩn từ tuyến mắt ngời đợc John miêu tả năm 1874 Và đến năm 1977, Harz mô tả loài xạ khuẩn có hệ sợi điển hình, đựợc phân lập từ bệnh nấm trâu bò đặt tên Actinomyces bovis Năm 1914, Krassinilcov lần đề tiêu việc phân biệt loài khác sơ Đại học s phạm H Nội K31B Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học phân loại 17 chủng thuộc chi Actinomyces Ông coi đặc điểm sinh lý mấu chốt nguyên tắc phân loại Waksman Curtis (1979) đề cập đến dạng trung gian mô tả phân loại Các ông coi đặc điểm hình thái bào tử đặc tính quan trọng thể Năm 1926, Millard Burr tìm 17 loài mới, Jensen (1930-1931) tìm đợc loài Đến năm 1934, Dutche tìm 13 loài Baldacci cộng nghiên cứu xạ khuẩn từ năm 1936-1953 công bố khoá phân loại chi Streptomyces dựa sở HSKS, HSCC số đặc điểm trung gian khác Waksman Henrici (1953) đa hệ thống phân loại, đến năm 1961 đợc sửa đổi lại Trong hệ thống phân loại này, xạ khuẩn đựơc xếp thành nhóm gồm họ, chia nhỏ thành 10 chi mô tả chi tiết 250 loài thuộc chi Streptomyces Krassinilcov từ năm 1941-1949 phát 38 loài Năm 1970, ông công bố hệ thống phân loại nấm tia dựa vào hệ thống công bố năm 1949, xạ khuẩn đợc phân thành họ gồm 26 chi Năm 1957, Gause cộng công bố hệ thống phân loại Hệ thống phân loại dựa vào màu sắc HSKS, HSCC, hình dạng mµng bµo tư vµ cng sinh bµo tư HƯ thèng đợc chỉnh lý tái năm 1983 Càng ngày, số lợng hệ thống phân loại xạ khuẩn nhiều nh hệ thống phân loại Prihan (1972), Nonomura (1972) đáng ý hệ thống phân loại Goodfellow Stackebradt (1988) Và để thống cách mô tả, ISP (Iternational Streptomyces Project) nêu lên phơng pháp môi trờng mô tả (Shirling Gottlieb, 1966) 1.2.5.2 Một số phơng pháp phân loại xạ khuẩn 1.2.5.2.1 Dựa vào đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy Hầu hết chi xạ khuẩn đợc mô tả phân chia khác tuỳ thuộc vào khác đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy nh: màu Đại häc s− ph¹m Hμ Néi K31B – Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học sắc HSKS, HSCC màu sắc sắc tố tan, hình dạng cuống sinh bào tử, hình dạng kết cấu bề mặt bào tử Dựa vào đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy ngời ta chia xạ khuẩn thành nhóm sau: Nhóm 1: Gồm xạ khuẩn có bào tử rõ rệt Đặc trng nhóm sinh sản bào tử, có hệ sợi phân nhánh thành HSKS HSCC Nhóm 2: Gồm xạ khuẩn có bào tử nang Đặc trng nhóm hệ sợi phân chia theo hớng vuông góc với tạo thành cấu trúc tơng tự nang bào tử Nhóm 3: Gồm xạ khuẩn có dạng Nocardia Đặc trng nhóm sinh sản cách phân đốt hệ sợi Nhóm 4: Gồm xạ khuẩn có dạng tơng tự Corynebacterium dạng hình cầu Tế bào có hình chữ V, T dạng cầu, thờng hệ sợi Theo tài liệu ISP đợc nêu lên Shirling Gottlieb (1968, 1969 vµ 1972) vµ cuèn “Bergey’s Manual” đợc xuất lần thứ 8, ngời ta chia xạ khuẩn thành kiểu (Section) vào hình dạng cuống sinh bào tử: Section S: Type Spira = chuỗi bào tử xoắn Section SRA: Type Spira Retinaculum Apertum = Chuỗi bào tử xoắn có khoá, có móc Section SRF: Type Spira Rectus Flexbilis = Chuỗi bào tử xoắn, cong đến thẳng Section RA: Type Retinaculum Apertum = Chuỗi bào tư cã mãc, cã kho¸ Section RARF: Type “Retinaculum Apertum Rectus Flexbilis = Chuỗi bào tử có khoá, thẳng, lợn sóng Section RF : Type Rectus Flexbilis = Chuỗi bào tử thẳng đến lợn sóng Đại học s phạm H Nội 10 K31B Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học Qua bảng 3.4 cho thấy thời gian dài khả sinh enzym tốt Tôi nhận thấy màu sắc vòng phân giải biến đổi theo thời gian, từ tím đậm- tím nhạt- hồng nhạt- vàng nhạt cuối suốt Trong ngày đầu vòng phân giải có màu tím đậm, điều giải thích nguyên nhân sau: Ban đầu trình sinh trởng xạ khuẩn pha tiềm phát (pha lag), xạ khuẩn sinh trởng chậm, số lợng tế bào nhỏ nên lợng enzym tiết phân giải cellulose thành oligosaccarit có khối lợng phân tử lớn nên vòng phân giải bắt màu tím đậm Mặt khác dịch nuôi cấy chứa nhiều tinh bột tan cha đợc xạ khuẩn sử dụng hết Khi thử hoạt tính phân tử tinh bột tan thấm xung quanh lỗ thạch bắt màu đậm với thuốc thử lugol Từ kết thu đợc, xây dựng đồ thị so sánh hoạt lực cđa enzym C1 vµ Cx 30 D-d,mm 25 20 CMC 15 BG 10 5 Thời gian (ngày) Đồ thị 3.1 ảnh hởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh cellulase chủng Đ6.1 Đại học s phạm H Nội 30 K31B Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học 30 D-d,mm 25 20 CMC 15 BG 10 5 Thời gian (ngày) Đồ thị 3.2 ảnh hởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh cellulase chủng Đ6.4 3.2.3 ảnh hởng độ pH môi trờng Để nghiên cứu ảnh hởng độ pH môi trờng đến khả sinh enzym xạ khuẩn chi Micromonospora Tôi tiến hành nuôi cấy xạ khuẩn môi trờng Gause I dịch thể đợc ®iỊu chØnh pH ë c¸c møc: 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 dung dịch NaOH 1N HCl 1N Sau ngày nuôi cấy, đem li tâm lấy dịch enzym thô, kiểm tra hoạt lực enzym phơng pháp khuếch tán thạch Kết đợc thể bảng 3.5 Đại học s phạm H Nội 31 K31B Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học Bảng 3.5 ảnh hởng độ pH môi trờng đến khả sinh tổng hợp cellulase Micromonospora Đ6.1 Đ6.4 Tên chủng Độ pH 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 §6.4 §6.1 CMC BG CMC BG (D - d, mm) (D - d, mm) (D - d, mm) (D - d, mm) 19 20 18 20 Tím nhạt Tím nhạt Tím đậm tím đậm 20 21 21 19 Trong suèt Trong suèt tÝm nh¹t TÝm nh¹t 23 22 23 21 Trong suèt Trong suèt Trong suèt Trong suèt 24 22 25 21 Trong suèt Trong suèt Trong suèt Trong suèt 26 25 25 23 Trong suèt Trong suèt Trong suèt Trong suèt 25 23 24 20 Trong suèt Trong suèt Trong suèt Trong suèt 22 21 22 20 Trong suèt Trong suèt Trong suèt Trong suốt Qua bảng 3.5 thấy rằng: Hai chủng xạ khuẩn nghiên cứu tổng hợp cellulase yếu mức pH 5,0 ®Õn 5,5 ë ®iỊu kiƯn pH 6,0 ®Õn 7,5 khả sinh enzym chủng xạ khuẩn lµ tèt, enzym sinh nhiỊu nhÊt ë pH = 7,0 Khi độ pH tăng lên, môi Đại học s phạm H Nội 32 K31B Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học trờng trở nên kiềm tính khả sinh enzym chủng xạ khuẩn có xu hớng giảm dần Từ kết trên, xây dựng đợc đồ thị so sánh khả sinh enzym C1 Cx chủng xạ khuẩn nghiên cứu nh sau 30 D-d, mm 25 20 CMC 15 BG 10 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 pH Đồ thị 3.3 ảnh hởng độ pH môi trờng đến khả sinh cellulase cđa chđng §6.1 30 D-d,mm 25 20 CMC 15 BG 10 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 pH Đồ thị 3.4 ảnh hởng độ pH môi trờng đến khả sinh cellulase chủng §6.4 §¹i häc s− ph¹m Hμ Néi 33 K31B Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học 3.3 Thảo luận Xạ khuẩn chiếm 9%- 45% tổng số VSV đất, số lợng xạ khuẩn phân giải cellulose đất không phụ thuộc vào loại đất mà phụ thuộc vào mức độ canh tác, độ pH, độ ẩm nhìn chung tuân theo quy luật sau: Đất giàu dinh dỡng, chất hữu vùng có nguồn cellulose cao phân bố xạ khuẩn phân giải cellulose rộng rãi số lợng thành phần Xạ khuẩn nhóm VSV a trung tính kiềm Vì pH axit hay kiềm thờng có xạ khuẩn Mặt khác xạ khuẩn nhóm hiếu khí, a ẩm nên tầng đất bề mặt có xạ khuẩn lớp đất sâu xuống dới Vào mùa hè số lợng xạ khuẩn có nhiều mùa đông * Một số hình ảnh nghiên cứu: Hỡnh 3.2 Khu n l c x khu n Đại học s phạm H Nội 34 K31B Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học Hỡnh 3.3 Ho t tớnh phân gi i cellulose c a x khu n H×nh 3.4 ảnh số mẫu xạ khuẩn phân giải cellulose §¹i häc s− ph¹m Hμ Néi 35 K31B – Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học Hình 3.5 Mẫu thí nghiệm có vi khuẩn kị khí phân giải cellulose Hình 3.6 Mẫu thí nghiệm có vi khuẩn hiếu khí phân giải cellulose Đại học s phạm H Nội 36 K31B Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học KếT LUậN V kiến nghị Kết luận Từ mẫu đất lấy từ đất đồi Đại Lải phờng Đồng Xuân- Thị xã Phúc Yên- Tỉnh Vĩnh Phúc, tiến hành phân lập tuyển chọn xạ khuẩn thu đợc kết nh sau: * Số lợng xạ khuẩn trung bình 1g đất khô độ sâu khác khu vực đồi Đại Lải phụ thuộc vào loại đất, độ phì nhiêu, độ ẩm, độ pH mức độ canh tác đất Đất đồi Đại Lải có nhiều đặc điểm không thuận lợi cho xạ khuẩn sinh trởng phát triển tốt (độ ẩm thấp, pH thấp, nghèo dinh dỡng) nên số lợng xạ khuẩn thấp Thấp 2,27.105 * Trong số 11 mẫu xạ khuẩn phân lập đợc, có khả phân giải cellulose từ mẫu đất khác gồm loại màu: Màu trắng: mẫu chiếm 45,4% Màu hồng: mẫu chiếm 18,1% Mµu vµng: mÉu chiÕm 27,2% Mµu xanh: mẫu chiếm 9% * Các chủng xạ khuẩn phân lập đợc có khả sinh enzym ngoại bào tốt Đặc biệt khả phân giải cellulose mạnh với CMC bột giấy (BG) Đây u lớn xạ khuẩn Kiến nghị Qua trình nghiên cứu xin đa số kiến nghị sau: * Tiếp tục nghiên cứu khả phân giải cellulose tự nhiên chi xạ khuẩn nhằm ứng dụng vào việc chế biến thức ăn gia súc, phân bón vi sinh chất lợng cao xử lý rác thải * Tiếp tục nghiên cứu thành phần loài độ đa dạng xạ khuẩn chi Micromonospora nói riêng loài xạ khuẩn khác nói chung Đại häc s− ph¹m Hμ Néi 37 K31B – Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học * Nghiên cứu thêm khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn chi Micromonospora có đất đồi nhằm tìm loại kháng sinh quý nhóm xạ khuẩn Đại học s phạm H Nội 38 K31B Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học Ti liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998) "Vi sinh vật học", Nxb Giáo Dục, tr 17-19, 26-29, 38-41 Vơng Trọng Hào, 1986 "Nghiên cứu số chủng xạ khuẩn thuộc nhóm Hồng phân lËp ë ViƯt Nam", ln ¸n phã tiÕn sÜ sinh học, tr 23-54 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Huyền, Lê Đình Lơng, Đoàn Xuân Mợn, Phạm Văn Ty, (1997), "Một số phơng pháp nghiên cứu vi sinh vËt häc", Nxb KH-KT, tËp 3, tr 70-80 Trần Hữu Phong, (2004), "Bớc đầu nghiên cứu số chủng xạ khuẩn thuộc chi Micromonospora phân lập từ đất rừng ngập mặn Huyện Cần Giờ - Thành phố Hồ Chí Minh", luận văn tốt nghiệp, ĐHSP Hà Nội Nguyễn Thành Đạt, (1982), "Góp phần nghiên cứu phân bố nhóm loài xạ khuẩn (Streptomyces) tạo kháng sinh mẫu đất vùng Hà Nội", thông báo khoa học ĐHSP1, tr 97-105 Nguyễn Thành Đạt, (1999) “C¬ së vi sinh vËt häc”, tËp 1, Nxb Giáo Dục, tr 19-25, 67-69 Kiều Hữu ảnh, (1999) "Vi sinh vật học công nghiệp", Nxb KH-KT Hà Nội, tr 167-172 Biền Văn Minh, (2002), "Nghiên cứu khả sinh chất kháng sinh số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình trị Thiên", luận văn tiÕn sÜ sinh häc, tr 3-14, 32-52 NguyÔn Quang Ho, Vơng Trọng Ho, (2002) "Thực hành vi sinh vật học", Nxb Giáo Dục 10 Nguyễn Thành Đạt, Mai Thị H»ng, (2000) "Sinh häc vi sinh vËt", Nxb Gi¸o Dơc, tr 213-273 Đại học s phạm H Nội 39 K31B Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học Ti liệu tiếng Anh 11 Shirling E.B, D Gottileb, (1986), Coomperative description of type culture of Streptomyces II, Species description from first study, International journal of sytematic Bacteiriology Vol 18, No 2, p 69-189 12 Williams and Wilkins, (1989), Bergey’s maunual of systematic Bacterrilogy, vol 4, p 2451 – 2492 13 Mét sè trang web http: www.antibiotic http: www.pubmedc entral.nih.gov http: www.ozi Fungi.htm http: www.google.com.vn Đại học s phạm H Nội 40 K31B Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học Mục lục Trang mở đầu Ch−¬ng Tỉng quan tµi liƯu 1.1 Sơ lợc nhóm vi sinh vật có khả phân giải cellulose 1.2 Sơ lợc xạ khuẩn 1.3 Cellulose vµ Cellulase 13 Chơng Vật liệu phơng pháp 16 2.1 VËt liÖu 16 2.2 Phơng pháp nghiên cứu 18 Chơng Kết thảo luận 24 3.1 Kết phân lập xạ khuẩn 24 3.2 Kết nghiên cứu chđng x¹ khn tun chän 28 3.3 Th¶o luËn 34 KÕt luËn vµ ®Ị nghÞ 37 KÕt luËn 37 KiÕn nghÞ 37 Tµi liƯu tham kh¶o 39 Đại học s phạm H Nội 41 K31B Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học Các từ viết tắt VSV : Vi sinh vËt ISP : International Streptomyces Project N : Nit¬ C : Cacbon CFU : Colony Forming Unit VSV K§ : Vi sinh vật kiểm định MT : Môi trờng HSKS : HƯ sỵi khÝ sinh HSCC : HƯ sỵi chất Đại học s phạm H Nội 42 K31B Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học Danh mục bảng, hình luận văn BảNG Bảng Tên bảng Trang 3.1 Sự phân bố xạ khuẩn phân giải cellulose đất 25 đồi Đại Lải 3.2 Hoạt tính cellulose chủng xạ khuẩn chi 27 Micromonospora phân lập đợc 3.3 Kết phân nhóm xạ khuẩn chi Micromonospora phân 28 lập từ đất đồi Đại Lải 3.4 ảnh hởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh 29 tổng hợp cellulase Micromonospora Đ6.1 Đ6.4 3.5 ảnh hởng độ pH môi trờng đến khả sinh 32 tổng hợp cellulase Micromonospora Đ6.1 Đ6.4 HìNH Hình Tên hình Trang 1.1 CÊu tróc kh«ng gian lËp thĨ cđa cellulose 13 3.2 Khuẩn lạc xạ khuẩn 34 3.3 Hoạt tính phân giải cellulose sau 72h nuôi cấy 35 chủng Đ6.1 3.4 Một số mẫu xạ khuẩn phân giải cellulose 35 3.5 Mẫu thí nghiệm có vi khuẩn kỵ khí phân gi¶i cellulose 36 3.6 MÉu thÝ nghiƯm cã vi khn hiếu khí phân giải 36 cellulose Đại học s phạm H Nội 43 K31B Sinh Đinh Thị Mỹ ánh Khoá luận tốt nghiệp đại học Lời cảm ơn Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đinh Thị Kim Nhung đ tận tình bảo, hớng dẫn em suốt trình học tập thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn toàn thể thầy cô khoa đ bảo giúp đỡ để em hoàn thành đợc khoá luận tốt nghiệp Cuối em xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè ®∙ ®éng viªn gióp ®ì em st thêi gian qua Em xin chân thành cảm ơn! Xuân Hoà, tháng 05 năm 2009 Sinh viên Đinh Thị Mỹ ánh Đại häc s− ph¹m Hμ Néi 44 K31B – Sinh ... Khoá luận tốt nghiệp đại học riêng, chọn đề tài Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn có khả phân giải cellulose đất đồi Đại Lải Mục tiêu đề tài - Phân lập, khảo sát mật độ phân bố xạ khuẩn có khả phân giải. .. 105 Qua kÕt phân lập xạ khuẩn phân giải cellulose đất đồi Đại Lải đợc thống kê bảng 3.1 có thĨ rót mét sè nhËn xÐt sau: Sù ph©n bố số nhóm xạ khuẩn phân giải cellulose đất đồi Đại Lải rộng Số... triển xạ khuẩn đặc biệt xạ khuẩn phân giải cellulose Điều phù hợp với kết phân lập có khoảng 2,94.105 mầm xạ khuẩn 1g đất khô đất đồi Đại Lải tợng số lợng xạ khuẩn lớp đất thấp so với lớp đất dới,