Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme cellulase trong đất trồng trọt khu vực xuân hoà, phúc yên, vĩnh phúc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ĐINH THỊ THOA PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME CELLULASE TRONG ĐẤT TRỒNG TRỌT KHU VỰC XUÂN HÒA,

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

ĐINH THỊ THOA

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG

XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME

CELLULASE TRONG ĐẤT TRỒNG TRỌT KHU VỰC

XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

HÀ NỘI, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

ĐINH THỊ THOA

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG

XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME

CELLULASE TRONG ĐẤT TRỒNG TRỌT KHU VỰC

XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Người hướng dẫn khoa học

PGS TS ĐINH THỊ KIM NHUNG

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung

đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh- KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giúp đỡ

Tôi chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành đề tài

Tôi xin cảm ơn thầy cô và bạn bè đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp

đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài

Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho gia đình và những người thân yêu đã động viên và giúp đỡ tôi

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2014

Sinh viên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong luận văn là trung thực và không trùng với công trình của các tác giả khác

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2014

Sinh viên

Đinh Thị Thoa

CÁC TỪ VIẾT TẮT

ADN : Acid DeoxyriboNucleic

ADP : Acid Diaminopimelic

ARN : Acid RiboNucleic

CMC : Cacboxyl Methyl Cellulose

CFU : Colony Forming Unit

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức hóa học của cellulose 15

Hình 1.2 Mô hình Fringed fibrillar và mô hình chuỗi gập 15

Hình 2.3 Bản đồ khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên,Vĩnh Phúc 22

Hình 3.4 Khuẩn lạc của một số VSV……….28

Hình 3.5 Khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 29

Hình 3.6 Một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 30

Hình 3.7 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ các chủng xạ khuẩn phân theo nhóm màu 33

Hình 3.8 Sắc tố tan của một số chủng xạ khuẩn phân lập 34

Hình 3.9 Hoạt tính cellulase của một số chủng xạ khuẩn phân lập 39

Hình 3.10 Đặc điểm màu sắc, sắc tố tan và hình dạng cuống sinh bào tử, bào

tử của chủng xạ khuẩn X3………42

Hình 3.11 Đặc điểm màu sắc, sắc tố tan và hình dạng cuống sinh bào tử, bào tử của chủng xạ khuẩn X5……….42

Hình 3.12 Đặc điểm màu sắc, sắc tố tan và hình dạng cuống sinh bào tử, bào tử của chủng xạ khuẩn X11………43

DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc……… 27

Bảng 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc của 20 chủng xạ khuẩn phân lập từ đất

trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 32

Bảng 3.4 Số lượng và sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu 33

Bảng 3.5 Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trường chứa CMC 36

Bảng 3.6 Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trường chứa BG 37

Bảng 3.7 Hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn đã phân lập 38

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

5 Phương pháp nghiên cứu 2

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn……… 3

7 Những đóng góp mới của đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn 4

1.1.1 Một số phương pháp trong phân loại xạ khuẩn 4

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy 5

1.1.1.2 Đặc điểm hóa phân loại( Chemotaxonomy) 6

1.1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 7

1.1.1.4 Phân loại số (Numerical taxonomy) 7

1.1.1.5 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces 8

1.1.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 9

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 9

1.1.2.2 Cấu tạo của xạ khuẩn 11

1.1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn 12

1.1.3 Vai trò của xạ khuẩn 14

1.2 Cellulose và cellulase 14

1.2.1 Cellulose 14

1.2.3 Cơ chế phân giải cellulose 17

1.3 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh cellulase ở Việt Nam và trên thế giới……… 18

1.3.1 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh cellulase trên thế giới………… 18

1.3.2 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh cellulase ở Việt Nam………….19

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… 20

2.1 Vật liệu và vi sinh vật 20

2.1.1 Vi sinh vật 20

2.1.2 Hóa chất , thiết bị 20

2.2 Môi trường 21

2.2.1 Môi trường phân lập xạ khuẩn 21

2.2.2 Môi trường bảo quản và giữ giống 21

2.2.3 Môi trường thử hoạt tính enzyme 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu 22

2.3.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski 23

2.3.3 Phương pháp bảo quản chủng giống 23

2.3.4 Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn 23

2.3.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn 24

2.3.6 Phương pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khuẩn 24

2.3.7 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn sinh enzyme cellulase từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 26

3.1.1 Phân lập xạ khuẩn từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 26

3.1.1.1 Đặc điểm khuẩn lạc 26

3.1.1.2 Đặc điểm hệ sợi 31 3.1.2 Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn sinh enzyme cellulase trong đất

trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc………35 3.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử, bào tử của các

chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn 40 3.2.1 Cuống sinh bào tử và bào tử của xạ khuẩn 40 3.2.2 Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử, bào tử của 3

chủng xạ khuẩn X3, X5, X11 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cellulose là thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào thực vật Đó là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp Việc phân huỷ cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hưởng đến tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp Enzyme cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết β-1,4-0-glycoside trong phân

tử cellulose, olygosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tương tự khác Hiện nay, việc sử dụng các enzyme như cellulase trong một số ngành công nghiệp như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, sản xuất dung môi hữu cơ và đặc biệt trong xử lý rác thải hữu cơ là vấn đề đang được con người đặc biệt quan tâm

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh được enzyme cellulase có nhiều khả năng và triển vọng giải quyết vấn đề nêu trên trong giám định và xử lý ô nhiễm môi trường Chúng có thể hoạt động trên chất thải khó xử lý, làm thay đổi đặc tính của chất thải và đưa chúng về dạng dễ xử lý hoặc chuyển thành các sản phẩm có giá trị hơn Enzyme cellulase được sinh tổng hợp bởi nhiều loài khác nhau như: các loài xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm mốc, nấm men và động vật nguyên sinh Ngoài ra, cellulase còn có ở các loài sinh vật khác như thực vật và động vật.Trong số các nhóm vi sinh vật nêu trên thì xạ khuẩn phân giải cellulose là một trong những đối tượng đã và đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm

Xạ khuẩn trong đất là một trong các nhóm sinh vật đất có số lượng lớn Chúng chiếm tới 10 - 70 % số tế bào vi sinh vật trong đất Ở môi trường trung tính xạ khuẩn phát triển mạnh nhất trong đất giàu hữu cơ và thông thoáng Xạ khuẩn có vai trò phân giải chất hữu cơ và nhất là phân giải đường tan trong nước, hemicellulose và cellulose Xạ khuẩn tham gia vào quá trình hình thành

các acid mùn Một vài loài xạ khuẩn có khả năng cố định nitơ tự do từ khí trời khi cộng sinh với thực vật thuộc bộ đậu Xạ khuẩn là vi sinh vật tạo ra kháng sinh chủ yếu (tới 80 % chất kháng sinh) vì thế trong đất có nhiều xạ khuẩn cây trồng ít bị bệnh hơn

Phường Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc có diện tích tự nhiên là 423,9

ha, trong đó đất diện tích đất trồng trọt khá lớn Do vậy, việc khảo sát các chủng xạ khuẩn trong đất trồng trọt có khả năng phân hủy cellulose cao là việc có ý nghĩa hết sức quan trọng trong việc cải tạo đất và bảo vệ môi

trường Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài: “Phân lập và

tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme cellulase trong đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc”

2 Mục đích nghiên cứu

Tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose cao góp phần tăng độ phì nhiêu của đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

3.1 Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn sinh enzyme cellulase từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc

3.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử, bào tử của các chủng

xạ khuẩn đã tuyển chọn

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong đất trồng trọt tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc

5 Phương pháp nghiên cứu

5.1 Phương pháp lấy mẫu

5.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski

5.4 Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn

5.5 Phương pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khuẩn

5.6 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase cao, ứng dụng các chủng xạ khuẩn này vào đời sống (trong chăn nuôi, môi trường) Từ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase cao này có thể tạo ra các chế phẩm vi sinh vật phục vụ cho việc xử lý rác thải (ủ rác sinh hoạt), chế biến thức ăn gia súc probiotin, chế biến phân bón vi sinh

7 Những đóng góp mới của đề tài

Qua nghiên cứu, chúng tôi đã tuyển chọn được 3 chủng xạ khuẩn X3, X5, X11 có khả năng sinh enzyme cellulase cao trong đất trồng trọt tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên Chúng

có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn, nấm mốc không phát triển được Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác của thảm thực vật

Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 – 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số VSV [22] Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường Chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc acid yếu 6,8 - 7,5 Xạ khuẩn có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc acid và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng xạ khuẩn cũng thay đổi theo thời gian trong năm

Xạ khuẩn tham gia tích cực vào quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất trong đất, nước, dùng để sản xuất nhiều enzyme như protease, amylase, cellulase… một số acid amin và acid hữu cơ Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật [5]

1.1.1 Một số phương pháp trong phân loại xạ khuẩn

Cùng với sự phát triển mạnh của sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh học … nên việc định tên một chủng xạ khuẩn được tiến hành tương đối nhanh chóng và chính xác với nhiều phương pháp như phân loại số, nghiên cứu chủng loại phát sinh… Song người ta vẫn chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin quan trọng để phân loại xạ khuẩn Để làm cho các chủng xạ khuẩn cần định loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình thái và nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình dạng và

bề mặt bào tử Dựa vào đặc điểm hình thái, người ta chia xạ khuẩn thành 4 nhóm chính:

Nhóm 1: Gồm các xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt, sinh sản bằng bào tử và phân

hóa thành HSKS và HSCC

Nhóm 2: Gồm các xạ khuẩn có bào tử nang, hệ sợi phân chia theo hướng

vuông góc với nhau tạo thành các cấu trúc tương tự nang bào tử

Nhóm 3: Gồm các xạ khuẩn có dạng Nocardia, sinh sản bằng cách phân đốt hệ

+ Kiểu S (Spira): chuỗi bào tử xoắn

+ Kiểu SRA (Spira Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử xoắn có dạng móc câu hay xoắn không hoàn toàn

+ Kiểu SRF (Spira Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử xoắn, cong đến thẳng + Kiểu RA (Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử có móc có khóa

+ Kiểu RA – RF (Rectinaculum Apertum - Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử có móc hay xoắn không hoàn toàn

+ Kiểu RF (Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử thẳng lượn sóng

Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là những dữ liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn Tuy nhiên, như ta đã biết xạ khuẩn rất không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xảy ra sự sắp xếp lại trong trong phân tử ADN Trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau về hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái Vì vậy, để phân loại được chính xác, ngày nay người ta cần nghiên cứu thêm các chỉ tiêu khác bổ sung như đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học hay sinh học phân tử [23]

1.1.1.2 Đặc điểm hóa phân loại( Chemotaxonomy)

Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng

20 năm trở lại đây Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào VSV

Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:

Type thành phần tế bào dựa trên cơ sở phân tích acid amin trong thành phần pettide và đường trong thành phần tế bào hay các polysaccaride gắn vào thành tế bào

Type peptidoglycan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu trúc của mạch tetrapeptide của PG cầu nối peptide và các liên kết giữa các mắt xích của PG

Acid mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi

Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium và Cornebacter Đây là đặc điểm

phân loại cơ bản cho các chi đó

Acid béo thường được sử dụng trong phân loại là acid béo bão hòa mạch thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso metyl hóa ở nguyên tử cacbon thứ 10 Sự có mặt của acid 10 – metylloctade canoit (acid tubereulostearinoic) là đặc điểm để phân loại đến chi [8]

Phospholipid có 5 type (PI, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặc trưng, có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn

Trong phân loại xạ khuẩn thì type thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất Khi muốn đưa một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó, người ta không thể nào không xác định thành tế bào

1.1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Để phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác nhau như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn

1.1.1.4 Phân loại số (Numerical taxonomy)

Để phát hiện những loài mới trên cơ sở sự khác nhau về đặc điểm sinh

lý, sinh hóa người ta còn sử dụng các kết quả dựa trên phân loại số Phương pháp này dưạ trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các VSV theo một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

Để so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau, người ta căn cứ vào hệ số giống nhau (hệ số S – Similarity) có 2 công thức tính hệ số S hay được sử dụng

Công thức của Sokal và Michener (S SM)

SSM (AB)= (Ns + + Ns-)* 100/ (Ns + + Ns- + Nd)

Trong đó : S SM (AB) : Mức độ giống nhau giữa hai cá thể A, B (%)

N s + : Số các tính trạng giống nhau

N d : Số các tính trạng khác nhau

N s- : Số các tính trạng đối lập nhau

Công thức của Jacard (SJ)

SJ(AB)= Ns * 100/ (Ns + Nd)

Trong đó: S J(AB) : mức độ giống nhau giữa hai chủng A, B (%)

N s : Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) của hai chủng so sánh

N d : Tổng số các đặc điểm khác nhau (tổng số các đặc điểm dương tính của chủng này và âm tính của chủng kia)

Kết quả của phân loại số là vẽ được sơ đồ phân nhánh (kiểu “rễ cây”) của các thông số Dựa vào sơ đồ này những chủng giống nhau nhiều nhất được xếp vào một nhóm Bằng phân loại số người ta chia xạ khuẩn chi

Streptomyces thành 2 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm với những đại diện

nhất định [24]

1.1.1.5 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces

Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Waksman và

Hernici đặt tên năm 1943 [22] Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất Các đại diện chi này có HSKS và HSCC phát triển phân nhánh Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 - 10 µm, khuẩn lạc thường không lớn có đường kính khoảng 1 – 5 mm Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất Bề mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi KTKS dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có kỵ nước

Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử, trên đầu sợi

khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử Cuống sinh bào tử có những hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng… Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình nhăn… tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy

Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucose, các bào tử biểu hiện các đặc điểm rất rõ Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng

rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi

khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau Vì vậy, Ủy ban Quốc tế về phân loại

xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trường và phương pháp chung để phân loại nhóm VSV này

Các loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn

Gr+, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ Nhiệt độ tối ưu thường là 25 - 30o

Axit béo: mạch thẳng bão hòa, đồng phân nhánh 15 - 17 C với số lượng ít và

số lượng lớn các axit phân nhánh 16 Ciso và 15 - 17 Canteiso

Dạng menaquinon: MK-9 (H6) hoặc MK-9 (H9)

Dạng photpholipit : PII

Không có axit mycolic [10]

Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các chất kháng sinh ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động

vật Cho đến nay để xác định cho thành phần loài của chi Streptomyces, các

nhà phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác nhau [22]

1.1.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

* Khuẩn lạc

Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử) Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng 0,2 – 1,0 µm đến 2,0 – 3,0 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [7],[10] Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy Kích thước của hệ sợi xạ khuẩn là một trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc

vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn, thay đổi từ 5 – 50 µm, dễ quan sát bằng mắt thường

Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ,

da cam, vàng, nâu, xám, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tùy vào loài và tùy vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Đường kính mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 – 2 nm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1 cm hoặc lớn hơn Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bền chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong

Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc tố, enzyme, vitamin, acid hữu cơ có thể được tích lũy trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường

* Khuẩn ty

Trên môi trường đặc biệt, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại cắm sâu vào trong môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng Một loại phát triển

trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty sinh khí aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản

Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi

Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi khí sinh Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh

sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng

1.1.2.2 Cấu tạo của xạ khuẩn

Xạ khuấn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gr+, toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập

Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 – 20 nm có tác dụng duy trì hình dạng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành tế bào gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng dày 60 - 120Ao, khi già có thể đạt tới 150 – 200Ao, lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50Ao, lớp trong dày khoảng 50Ao các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N – axetyl glucozamin liên kết với N – axetyl muramic bởi các liên kết glucoside Khi xử lý bằng lyzozyme, các liên kết 1,4 glucoside bị cắt đứt, thành tế bào bị phá hủy tạo thành thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá hủy khi xử lý tế bào hỗn hợp este chlorofom và các dung môi hòa tan lipid khác Nguyên nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipid (thành HSKS có nhiều lipid hơn so với HSCC) khác với nấm Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose và kittin nhưng chứa nhiều enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển các chất qua màng tế bào [19], [20]

Căn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành

4 nhóm chính [4], [6]

Nhóm I: thành phần chính của thành tế bào là acid L- 2,6 diaminopimelic (L –

ADP) và glyxin Chi Streptomyces thuộc nhóm này

Nhóm II: thành phần chính của thành tế bào là acid meso – 2,6 –

diaminopimelic (m – ADP) và glyxin

Nhóm III: thành phần chính của thành tế bào là acid meso – 2,6 –

diaminopimelic

Nhóm IV: thành phần chính của thành tế bào là acid meso – 2,6 –

diaminopimelic, arabinose và galactose

Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là phospholipid và protein Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn

Điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote ở chỗ chúng có tỷ lệ Gr+

C rất cao trong ADN, thường lớn hơn 55%, trong đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 – 45% [8]

Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gr+ nên ngoài yếu tố di truyền trong nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có thể tự nhân lên, được Lederberg gọi là plasmid Các plasmid đem lại cho tế bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển gene, sản xuất chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn [2]

Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng

là đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác Nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amon… Khả năng đồng hóa các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau là khác nhau

1.1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn

Xạ khuẩn là một nhóm cơ thể dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu,

Còn nitrat, nitrit, muối amon, ure, pepton, cao thịt… để làm nguồn nitơ Các loài khác nhau thì cách hấp thụ các hợp chất này là khác nhau Phần lớn xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển là

25 – 300C Đa số xạ khuẩn phát triển tốt trong môi trường có pH là 6,8 – 7, một số ít có khả năng phát triển tốt trong môi trường kiềm [17]

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gr+, đặc biệt khác với các sinh vật khác của nhóm nhân sơ có tỉ lệ (G+X) cao (trên 70%), trong khi đó vi khuẩn khá thấp (25 - 45%) Một trong những đặc điểm đáng lưu ý của xạ khuẩn là chúng không bền vững về mặt di truyền và thường xảy ra sự sắp xếp lại trong phân

tử ADN Điều này gây ra tính đa dạng của hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn (khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ, hoạt tính kháng sinh, tính kháng thuốc, khả năng phân giải cellulose…) [17]

Đặc điểm sinh lý của xạ khuẩn Streptomyces

Chi Streptomyces có số lượng loài mô tả lớn nhất, chi này có HSKS,

HSCC phát triển và phân nhánh, khuẩn lạc thường không lớn, đường kính khuẩn lạc từ 1 – 5 mm Khuẩn lạc chắc dạng da, mọc đâm sâu vào cơ chất, bề mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi HSKS dạng nhung, dày hơn HSCC và đôi khi không thấm nước Chuỗi bào tử được tạo thành trên cuống sinh bào tử, chúng có thể thẳng, lượn sóng hoặc xoắn Bề mặt bào tử có thể nhẵn, xù xì, có lông hoặc có gai Xạ khuẩn có khả năng tạo thành các loại sắc tố khác nhau, sắc tố này có thể nhuộm màu HSKS, HSCC, đôi khi nhuộm màu môi trường

Các loài thuộc chi Streptomyces có cấu tạo thành giống thành của vi khuẩn

Gr+, là vi sinh vật hiếu khí, dị dưỡng Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là từ 25 -

30oC, pH tối ưu là 6,5 – 8 Một số loài có thể sinh trưởng ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và xạ khuẩn ưa ẩm)

1.1.3 Vai trò của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành đất và tạo độ phì nhiêu cho đất Chúng đảm nhận nhiều chức năng khác nhau trong việc làm màu mỡ cho đất bằng cách tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa và phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp và bền vững như cellulose, mùn, kitin, keratin, lignin [10]

Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì

có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [8] Trong đó có trên 15% có nguồn gốc từ

các xạ khuẩn hiếm như Actinomadura, Micromonospora, Actinoplanes,,

Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học, thú y học, bảo vệ thực vật như gentamycin, tobramycin, vancomycin, rosamycin, tetraxycline Bên cạnh đó trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn có thể sản sinh ra nhiều chất hữu cơ Trong đó, điển hình là các enzyme ngoại bào (cellulase, protease ), vitamin nhóm B (B1, B2, B5,B6, B12), một số acid hữu cơ (acid lactate, acid acetate ) [10]

Ngày nay xạ khuẩn còn được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp lên men, chế tạo các sản phẩm enzyme, ứng dụng các chế phẩm này vào đời sống do một số xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều enzyme ngoại bào như protease, amylase, kitinase Một số khác còn có khả năng tạo thành chất kích thích sinh trưởng cho thực vật

1.2 Cellulose và cellulase

1.2.1 Cellulose

Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C6H10O5)n và là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liên kết với nhau, 4-O-(β-D-Glucopyranosyl)-D-glucopyranose (Hình 1.1) Cellulose cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng

hợp được khoảng 1011

tấn cellulose (trong gỗ, cellulose chiếm khoảng 50% và trong bông chiếm khoảng 90%)

Hình 1.1 Công thức hóa học của cellulose

Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết Van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt với nhau nên dễ bị tấn Có hai mô hình cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng tinh thể

và vô định hình như hình 1.2

Hình 1.2 Mô hình Fringed fibrillar và mô hình chuỗi gập

Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo thẳng và định hướng theo chiều sợi Vùng tinh thể có chiều dài 500 A0

và xếp xen kẽ với vùng vô định hình

Cellulose có cấu tạo tương tự carbohydrate phức tạp như tinh bột và glycogen Các polysaccharide này đều được cấu tạo từ các đơn phân là glucose Cellulose là glucan không phân nhánh, trong đó các gốc glucose kết hợp với nhau qua liên kết β-1 4-glycoside, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose và các phân tử carbohydrate phức tạp khác Giống như tinh bột, cellulose được cấu tạo thành chuỗi dài gồm ít nhất 500 phân tử glucose Các chuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm Mỗi chuỗi có nhiều nhóm OH tự do, vì vậy giữa các sợi

ở cạnh nhau kết hợp với nhau nhờ các liên kết hidro được tạo thành giữa các nhóm OH của chúng Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hay còn gọi là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những khoảng trống lớn Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose

Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thủy phân Người và động vật không có enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa được cellulose, vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trò điều hòa hoạt động của hệ thống tiêu hóa Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose Nấm đất cũng có thể phân hủy cellulose Vì vậy, chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn [20]

1.2.2 Hệ thống enzyme cellulase

Liên kết chủ yếu trong cấu trúc của cellulose là β-(14) glucoside Nói chung, để phá hủy hoàn toàn cấu trúc của polysaccharide này cần có các enzyme cellulase với những tác động đặc trưng riêng biệt Dựa theo nghiên

cứu về hệ enzyme cellulase của nấm Trichoderma reesei, hệ enzyme thủy

Endoglycanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase

Enzyme endoglycanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase là enzyme thủy phân nội bào liên kết 1,4-β-D-glucosidic trong phân tử cellulose bởi tác dụng ngẫu nhiên trong chuỗi polymer hình thành các đầu chuỗi khử tự

do và các chuỗi oligosaccharide ngắn Các endoglucanase không thể thủy phân cellulose tinh thể hiệu quả nhưng nó sẽ phá vỡ các liên kết tại khu vực

vô định hình tương đối dễ tiếp cận

Exoglucanase

Enzyme ngoại bào exoglucanase gồm cả 1,4-beta-D-glucan glucanohydrolase, giải phóng D-glucose từ β-glucan và cellodextrin và 1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase, giải phóng D-cellobiose Tỷ lệ thủy phân của enzyme cellobiohydrolase ngoại bào bị hạn chế bởi sự sẵn có các đầu chuỗi cellulose

β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase

β-glucosidase hay β-glucoside glucohydrolase giải phóng phân tử glucose từ đường cellodextrin hòa tan và một loạt các glucoside khác

D-1.2.3 Cơ chế phân giải cellulose

Erickson và cộng sự, 1973 lại có quan điểm như sau, thể hiện trên một

sơ đồ phức tạp về quá trình thủy phân cellulose

Đầu tiên, exoglucanase tấn công vào các vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt đứt các liên kết β-1,4-glucoside để tạ ra các mạch tự do Tiếp

đó, dưới tác dụng của endogluconase từ phía cực kín (phía không có tính khử), cellulose bị cắt thành các cellodextrin, sau đó cùng với sự hiệp trợ của exoglucanase phân cắt các cellulose tạo ra cellobiose và glucose Cuối cùng β-1,4-glucosidase thủy phân một phần cellodextrin và cellobiose thành glucose

Tổng hợp các yếu tố cấu trúc, sự hấp thụ của cellulase, sự kìm hãm của sản phẩm và sự vô hoạt của cellulase, tất cả đều có ảnh hưởng quan trọng đến vân tốc thủy phân cellulose Nói chung cho đến nay chưa có giả thuyết nào giải thích được đầy đủ và thỏa đáng về cơ chế tác động của cellulase Tuy nhiên, công nghệ và giải pháp thiết bị để chuyển hóa cellulose bằng con đường công nghệ sinh học thì hiện nay nhiều nước trên thế giới đã đưa vào triển khai ở quy mô công nghệ và đã thu được nhiều kết quả

1.3 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh cellulase ở Việt Nam và trên thế giới

1.3.1 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh cellulase trên thế giới

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của xạ khuẩn Ở Mỹ, năm 1983 PTN của quân đội Mỹ ở Natik và trường Đại học

Rutgers sử dụng chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất

cellulase đầu tiên Sau đó, gây biến chủng và chọn lọc được biến chủng QM9414 có khả năng sinh cellulose cao theo Rehm, 1983 Năm 1998, YU đã

nuôi cấy Trichoderma reesei Rut 30 trong môi trường chứa 5% bột cellulose

và 1% cám mì, thu được hoạt lực CMCase 232,4 IU/g Năm 2000, Sonia Couri khảo sát khả năng sinh tổng hợp các enzyme như polygalacturonase,

cellulase, xylanase và protease từ Aspergillus niger 3T5B8 trên nguồn phế

phụ liệu nông nghiệp khác nhau bằng phương pháp lên men bán rắn và ứng dụng enzyme trong việc tách chiết dầu thực vật Năm 2002, theo báo cáo gần

đây của CORAL dịch nuôi cấy Aspergillus niger trong môi trường Czapeck-

Dox chứa CMC 1% cho chạy điện di trên gel SDS-PAGE chứa 0,2% CMC phát hiện có 2 vạch có hoạt tính CMCase và trọng lượng phân tử lần lượt là 83.000 và 50.000 Dalton

1.3.2 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh cellulase ở Việt Nam

Ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về xạ khuẩn sinh cellulase và ứng dụng celluase trong thực tiễn ngày càng được phát triển Dùng cellulase trực tiếp trong phân giải phế thải của công nghệ thực phẩm bổ sung và thức ăn gia súc và trong công nghệ môi trường

Gần đây có nhiều công trình nghiên cứu về xạ khuẩn sinh enzyme đã tuyển chọn được nhiều chủng xạ khuẩn có tiềm năng để ứng dụng vào thực tế

Ví dụ, theo kết quả của Lương Thị Hương Giang ( 2011) đã tuyển chọn được

2 chủng có hoạt tính cao là HT12.7 và HT10.6, còn kết quả của Vũ Thị Thanh Thu (2012) đã tuyển chọn được 2 chủng có hoạt tính cellulose cao là T5 và T7 Một số công trình gần đây của Hà Thị Thu Hằng (2013) [13], Nguyễn Minh Nguyệt (2013) [16], đã tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose cao trong đất tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam việc ứng dụng các chủng xạ khuẩn sinh enzyme cellulase vào thực tế sản xuất vẫn còn hạn chế Vì vậy, chế phẩm enzyme vẫn thường phải nhập khẩu với giá thành cao