Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải chất hữu cơ và ức chế vibrio từ mẫu trầm tích biển thu thập tại thanh hóa quảng bình quảng trị

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CHẤT HỮU CƠ VÀ ỨC CHẾ VIBRIO TỪ MẪU TRẦM TÍCH BIỂN THU THẬP TẠI THANH HĨA – QUẢNG BÌNH – QUẢNG TRỊ Giáo viên hướng dẫn : TS LÊ THỊ HỒNG MINH Giáo viên hướng dẫn : TS VŨ THỊ QUYÊN Sinh viên thực : NGUYỄN THỊ THÚY NGÂN Lớp : 13-01 Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, chúng em xin gửi lời cám ơn tới toàn ban giám hiệu Viện Đại học Mở Hà Nội, đặc biệt thầy cô khoa Công nghệ Sinh học dạy dỗ chúng em suốt năm học trường, trang bị cho chúng em tảng kiến thức khoa học tạo điều kiện tốt cho chúng em làm báo cáo tốt nghiệp Chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Lê Thị Hồng Minh, Trưởng phòng Cơng nghệ sinh học – Viện Hố sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, TS Vũ Thị Quyên ThS Nguyễn Mai Anh, người truyền cho chúng em phương pháp học tập nghiên cứu khoa học, tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ chúng em suốt trình nghiên cứu vừa qua Đồng thời, chúng em gửi lời cám ơn tới cô chú, anh chị, bạn Phòng Cơng nghệ sinh học – Viện Hoá sinh biển giúp đỡ chúng em nhiều thời gian thực tập Cuối cùng, chúng em xin gửi tới gia đình, người thân, bạn bè lời cám ơn sâu sắc ln giúp đỡ, động viên chúng em suốt thời gian học tập Hà Nội, ngày 23 tháng 04 năm2017 Sinh viên Nguyễn Thị Thúy Ngân MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1Tình hình nghiên cứu nước giới .3 1.1.1.Tình hình nghiên cứu giới .3 1.1.2.Tình hình nghiên cứu nước 1.2 Xạ khuẩn 1.2.1 Vị trí vai trò xạ khuẩn vi sinh vật 1.2.2 Cấu tạo xạ khuẩn 1.2.3 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 10 1.3 Sự phân giải số chất hữu 12 1.3.1 Phân giải Protein (casein) .12 3.3.2 Phân giải Cellulose 13 1.4 Tổng quan Vibrio nuôi trồng thủy sản 14 1.5 Ứng dụng vi sinh vật nuôi trồng thủy sản 16 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu hóa chất 19 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 19 2.1.2 Hóa chất, thiết bị .19 2.1.2.1 Hóa chất 19 2.1.2.2 Thiết bị 20 2.1.3 Môi trường 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Thu thập mẫu trầm tích 22 2.2.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn 22 2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật khuyếch tán đĩa thạch 23 2.2.4 Phương pháp xác định khả sinh enzyme chủng nghiên cứu 24 2.2.4.1 Khả thủy phân tinh bột tan 24 2.2.4.2 Khả thủy phân casein 24 2.2.4.3 Khả thủy phân cellulose (CMC) 25 2.2.5 Phương pháp định danh xạ khuẩn kỹ thuật SHPT 25 2.2.5.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 25 2.2.5.2 Phương pháp PCR 26 2.2.5.3 Phương pháp giải trình tự 28 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết thu thập mẫu 29 4.2 Phân lập xạ khuẩn từ trầm tích 30 4.3 Thử hoạt tính kháng số lồi vi khuẩn Vibrio chủng nghiên cứu 32 4.4 Khả sinh enzyme chủng nghiên cứu 34 4.4.1 Khả thủy phân tinh bột tan 34 4.5.2 Khả thủy phân protein (casein) 35 4.5.3 Khả thủy phân CMC 36 4.6 Định danh xạ khuẩn sinh học phân tử 36 4.6.1 Tách ADN genom từ xạ khuẩn 36 4.6.3 Kết giải trình tự gene 16S ba chủng xạ khuẩn 38 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú thích AND Axit deoxyribonucleotit Agar Agarose ARN Axit ribonucleotit BLAST Basic Local Alignment Search Tool CMC Carboxymethyl cellulose EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid G(-) Gram âm G(+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh LB Lauria Betani PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulfate VSV Vi sinh vật VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định XK Xạ khuẩn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 : Hình ảnh cấu tạo phân lập xạ khuẩn Hình 4.1: Một số hình ảnh nơi lấy mẫu mẫu thu Hình 4.2 Một số hình ảnh phân lập xạ khuẩn Hình 4.3 Một số hình ảnh làm chủng xạ khuẩn Hình 4.4 Một số hình ảnh thử hoạt tính kháng số chủng vi khuẩn Vibrio Hình 4.5 Khả thủy phân tinh bột tan Hình 4.6 Khả phân giải casein Hình 4.7 Khả phân giải cellulose Hình 4.8 Kết điện di đồ AND tổng số chủng xạ khuẩn (Giếng 1-3 mẫu G290, G280, G278) Hình 4.9 Chu trình nhiệt phản ứng PCR Hình 4.10: Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S ADN riboxom chủng G290, G280, G279 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1 Danh sách tọa độ mẫu mẫu trầm tích thu thập Thanh Hóa – Quảng Bình – Quảng Trị Bảng 4.2 Danh sách 15 chủng xạ khuẩn phân lập Bảng 4.3 Kết thử hoạt tính kháng số chủng vi khuẩn Vibrio chủng xạ khuẩn Viện Đại Học Mở Hà Nội MỞ ĐẦU Vùng biển Việt Nam có diện tích khoảng 1.000.000 km2 3.260 km bờ biển (khơng tính đảo), với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, tạo cho nước ta tính đa dạng cảnh quan tự nhiên nguồn lợi thuỷ sinh vật Với mong muốn khám phá, khai thác sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên phong phú biển, nhiều nghiên cứu khoa học gần đây, công nghệ sản xuất sinh học chuyển dần từ khai thác sang tìm hiểu, ứng dụng đưa vào sản xuất nguồn nguyên liệu từ vùng nước ngập mặn, biển xa bờ, chí đáy biển sâu để sinh trưởng bền vững dựa sở công nghệ Xạ khuẩn (Actinomycetes) nhóm vi khuẩn nhân thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi tự nhiên Xạ khuẩn quan tâm nghiên cứu nhiều có khả sản xuất sản phẩm trao đổi chất quan trọng Trong số 8000 chất kháng sinh biết giới có 80% có nguồn gốc từ xạ khuẩn chủ yếu từ chi Streptomyces Micromonospora Giai đoạn năm 1980 trở trước nhà nghiên cứu chủ yếu tập trung vào khám phá chủng xạ khuẩn mặt đất Từ vài thập kỷ trở lại nhà khoa học phát chủng xạ khuẩn biển có nhiều đặc tính q như: khả sản xuất kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế tế bào ung thư… có ý nghĩa ứng dụng y học ( Theo Tạp trí sinh học 2016, 38(1): 109-114) Nuôi trồng thủy sản lĩnh vực phát triển nhanh năm gần ngày mở rộng Việc sử dụng nhiều thức ăn thuốc kháng sinh dẫn đến môi trường nuôi bị ô nhiễm, tạo chủng vi khuẩn kháng thuốc cân hệ vi sinh vật đường ruột Đây thách thức lớn cho ngành thuỷ sản việc kiểm soát bệnh thủy động vật nâng cao suất, chất lượng sản phẩm Một nguồn nguy hiểm cho thuỷ sản nói chung cho ngành ni tơm nói riêng vi khuẩn Vibrio Vibrio gây bệnh tất giai đoạn sinh trưởng tôm xem nguồn gốc gây thiệt hại nghiêm trọng, tỉ lệ chết lên tới 100% Nguyễn Thị Thúy Ngân Page Viện Đại Học Mở Hà Nội Việc phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn từ trầm tích biển có khả đối kháng vi khuẩn gây bệnh Vibrio tiền đề quan trọng để để tạo sản phẩm sinh học tách chiết tinh chế chất có hoạt tính sinh học cao góp phần ngăn ngừa bệnh dịch cải thiện mơi trường Vì vậy, chúng tơi thực đề tài: “Phân lập tuyển chọn số chủng xạ khuẩn có khả phân giải chất hữu ức chế Vibrio từ mẫu trầm tích biển thu thập Thanh Hóa – Quảng Bình – Quảng Trị” Mục tiêu: Sàng lọc chủng xạ khuẩn từ mẫu trầm tích biển có hoạt tính phân giải chất hữu đối kháng số loài Vibrio để làm sở cho xử lý môi trường nuôi trồng thủy sản Định danh sinh học phân tử chủng lựa chọn Nội dung nghiên cứu: - Phân lập chủng xạ khuẩn từ mẫu trầm tích biển thu thập vùng biển Thanh hóa – Quảng Bình – Quảng Trị - Sàng lọc vi sinh vật có hoạt tính phân giải chất hữu đối kháng số loài Vibrio - Định danh tên khoa học gene 16S-rRNA số chủng có hoạt tính cao lựa chọn Nguyễn Thị Thúy Ngân Page Viện Đại Học Mở Hà Nội PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu nước giới 1.1.1 Tình hình nghiên cứu giới Sản lượng nuôi tôm giới bị suy giảm dịch bệnh, đặc biệt vi khuẩn Vibrio hay vi rút gây Kháng sinh sử dụng với khối lượng lớn nhằm kiểm soát dịch bệnh, nhiên, việc sử dụng nhiều trường hợp thường không mang lại hiệu làm tăng thêm mầm bệnh Ứng dụng chế phẩm sinh học ni trồng thủy sản chìa khóa giải vấn đề Theo dự báo Tổ chức Nông Lương Liên hợp quốc (FAO), ngành nuôi trồng thủy sản đáp ứng nửa nhu cầu sản phẩm thủy sản đến năm 2020 ngành khai thác bị khai thác mức, dẫn đến sản lượng khai thác suy giảm Nghề nuôi tôm mở rộng toàn giới, đặc biệt nước nhiệt đới nhu cầu sản phẩm ngày tăng Tuy nhiên, nghề nuôi tôm bị ảnh hưởng bệnh vi khuẩn vibrio vi rút gây Mật độ thả nuôi ao hồ bể chứa cao nguyên nhân tạo mầm bệnh việc sử dụng thức ăn giàu protein tạo môi trường thuận lợi cho vi khuẩn gây bệnh phát triển Vibrio nguyên nhân gây dịch bệnh tơm Để kiểm soát dịch bệnh vi khuẩn Vibrio gây ra, người ta sử dụng thuốc kháng sinh, nhiên, thời điểm này, hiệu việc sử dụng thuốc kháng sinh thấp Ở Philipines, bệnh vi khuẩn Vibrio gây tổn thất lớn sản lượng tôm gây thiệt hại kinh tế cho người nuôi tôm năm 1996 Vi khuẩn Vibrio kháng lại loại thuốc kháng sinh chloramphenicol, furazolidone, oxytetracycline, streptomycin nguy hiểm so với trước Tại Thái Lan, người nuôi sử dụng norfoxacin thức ăn, loại thuốc hiệu việc chống lại vi khuẩn Vibrio Tuy nhiên, điều trị khơng mang lại hiệu sau ngừng thuốc tồn tơm bị chết hai ngày Rõ ràng, dòng vi khuẩn Vibrio kháng thuốc Chlorine sử dụng rộng rãi trại giống ao nuôi; nhiên, việc sử dụng lại kích thích phát triển gen kháng thuốc vi khuẩn Một số người nuôi tôm Thái Lan cho biết chlorine sử dụng ao nuôi để diệt động vật phù du Nguyễn Thị Thúy Ngân Page Viện Đại Học Mở Hà Nội STT Các chủng vi khuẩn Vibrio D-d (mm) Tên chủng V alginolyticus V.cholera V.vulnificus V parahaemolyticus G280 13 10 - 13 G282 - - - G261 - - 15 - G246 - - - - G259 14 - - 15 G278 - 13 - 16 G290 13 - 15 14 G248 14 12 - - G276 - - 10 - 10 G265 - - - 11 G279 - - - 12 G302 - - - - 13 G299 - 10 - - 14 G268 - - - - 15 G264 Bảng 4.3 Kết thử hoạt tính kháng số chủng vi khuẩn Vibrio chủng xạ khuẩn Bảng 4.3 kết thử hoạt tính kháng số chủng vi khuẩn Vibrio chủng nghiên cứu cho thấy, hầu hết chủng phân lập có hoạt tính kháng chủng gây bệnh, khả kháng chủng khác Có chủng kháng ba tác nhân gây bệnh , có chủng kháng hai tác nhân, có chủng kháng tác nhân, có chủng khơng kháng tác nhân gây bệnh Chúng lựa chọn chủng: G270, G280, G290 có khả kháng 2-3 tác nhân gây bệnh Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 33 Viện Đại Học Mở Hà Nội A B C Hình 4.4 Một số hình ảnh thử hoạt tính kháng số chủng vi khuẩn Vibrio A: Kết thử hoạt tính kháng vi khuẩn V alginolyticus chủng G280(5) G290(8) B: Kết thử hoạt tính kháng vi khuẩn V vulnificus chủng G290(4) C: Kết thử hoạt tính kháng vi khuẩn V cholera chủng G280(11) Và G278(8) 4.4 Khả sinh enzyme chủng nghiên cứu 4.4.1 Khả thủy phân tinh bột tan Nuôi cấy xạ khuẩn môi trường có 2% tinh bột tan Sau 3-5 ngày ni cấy điều kiện thích hợp lấy nhỏ 1-2ml dung dịch lugol để thử Nếu xạ khuẩn có enzyme có khả phân hủy tinh bột chúng tạo vòng phân giải xung quanh vị trí xạ khuẩn phát triển, vòng phân giải có màu trong, bên ngồi màu xanh tím iot tác dụng với tinh bột tan Hình 4.5 Khả thủy phân tinh bột tan Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 34 Viện Đại Học Mở Hà Nội Kết thí nghiệm cho thấy chủng xạ khuẩn nghiên cứu G278, G280, G290 có khả sinh enzyme amylase Môi trường xung quanh chủng xạ khuẩn khơng màu, suốt, bên ngồi có màu xanh tím, đường kính vòng phân giải 15mm, 13mm 9mm Từ kết trên, ta thấy chủng chủng G278 có vòng phân giải rộng rõ (15 mm), điều chứng tỏ khả sinh enzyme amylase chủng tốt (hình 4.5) 4.5.2 Khả thủy phân protein (casein) Ni cấy xạ khuẩn mơi trường có 2% casein Sau 1-2 ngày ni cấy điều kiện thích hợp lấy nhỏ 1-2ml dung dịch lugol để thử Nếu xạ khuẩn có enzyme có khả phân hủy casein chúng tạo vòng phân giải xung quanh vị trí xạ khuẩn phát triển, vòng phân giải có màu trong, bên ngồi có màu nâu đỏ Hình 4.6 Khả phân giải casein Kết cho thấy ba chủng xạ khuẩn nghiên cứu có phản ứng dương tính: mơi trường xung quanh xạ khuẩn khơng màu, suốt Phía bên ngồi có màu nâu đỏ Ba chủng có khả sinh enzyme protease: G278, G280, G290 với đường kính vòng phân giải 25mm, 15mm,13mm Trong chủng chủng có vòng phân giải 25mm rộng rõ nhất, điều chứng tỏ khả sinh enzyme protease chủng G278 tốt (Hình 4.6) Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 35 Viện Đại Học Mở Hà Nội 4.5.3 Khả thủy phân CMC Ni cấy xạ khuẩn mơi trường có 2% CMC Sau 2-3 ngày ni cấy điều kiện thích hợp lấy nhỏ 1-2ml dung dịch lugol để thử Nếu xạ khuẩn có enzyme có khả phân hủy CMC chúng tạo vòng phân giải xung quanh vị trí xạ khuẩn phát triển, vòng phân giải có màu trong, bên ngồi có màu nâu đỏ Hình 4.7 Khả phân giải cellulose Kết thí nghiệm cho thấy chủng xạ khuẩn nghiên cứu có khả sinh enzyme cellulase: môi trường xung quanh xạ khuẩn khơng màu, bên ngồi màu nâu đỏ Đường kính vòng phân giải chủng : G278, G280, G290 23mm, 21mm, 14mm Trong chủng chủng G278 có vòng phân giải rộng rõ nhất, điều chứng tỏ khả sinh enzyme cellulose chủng G278 tốt (Hình 4.7) 4.6 Định danh xạ khuẩn sinh học phân tử 4.6.1 Tách ADN genom từ xạ khuẩn Từ 1,5ml dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn chọn, qua nhiều bước xử lý thu ADN genom Độ tinh sản phẩm kiểm tra phổ hấp thụ tử ngoại điện di gel agaroza 1% Hình ảnh điện di (Hình 4.8) cho thấy mẫu ADN sạch, bị đứt gẫy, sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 36 Viện Đại Học Mở Hà Nội Hình 4.8 Kết điện di đồ AND tổng số chủng xạ khuẩn (Giếng 1-3 mẫu G290, G280, G278) 4.6.2 Nhân gen 16S ADN riboxom Từ ADN genom chủng nghiên cứu, sử dụng cặp mồi 16SF,16SR, tiến hành PCR nhân đoạn gen 16S với chu trình nhiệt sau: 94oC – phút, 94oC – 30 giây, 56oC – 45 giây, 72oC – phút,(32 chu kỳ từ bước đến bước 4), 72oC – phút, kết thúc 4oC Hình 4.9 Chu trình nhiệt phản ứng PCR Với cặp mồi thiết kế dựa trình tự bảo thủ gen 16S ARN riboxom xạ khuẩn khn ADN genom theo lý thuyết sản phẩm PCR có độ dài xấp xỉ 1500 bp Kết điện di đồ sản phẩm PCR (hình 4.10) cho thấy sản phẩm PCR chủng xuất băng có kích thước khoảng 1000bp-2000bp Như chu trình phản ứng PCR thiết lập hồn tồn phù hợp với mục đích nhân dòng đoạn gen 16S chủng nghiên cứu Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 37 Viện Đại Học Mở Hà Nội 2000bp ~ 1500bp 1000bp Hình 4.10: Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S ADN riboxom chủng G290, G280, G279 Giếng 2,3,4: sản phẩm PCR chủng xạ khuẩn G290, G280, G278 Giếng : thang ADN chuẩn Để chắn khuyếch đại đoạn gen 16S ARN riboxom chủng xạ khuẩn có hoạt tính cao, chúng tơi tiến hành tinh lượng lớn sản phẩm PCR để tiến hành đọc trình tự nucleotit 4.6.3 Kết giải trình tự gene 16S ba chủng xạ khuẩn Trình tự gen xác định theo phương pháp Sanger&đtg Sau xử lý liệu thu qua chương trình GENE DOC, chúng tơi nhận trình tự hồn chỉnh gen 16S ARN riboxom chủng  Trình tự đoạn gen 16S ARN riboxom chủng G278 có độ dài 1447 bp Tỷ lệ: A(18% 266); T(24% 320); G(25% 376); C(33% 485) TGGGGGAACC TTCGGGTGTT TCACCGCAGC AGACCCCAAT CTCATTGTAC GACGTCGTCC CGAAGAGTTG CTCACGACAC CATCTCTGAT TTAAGCCACA GCGGCCGTAC TGTTGCCCAC TCGCTCCCCA CGGTGTTCCT CCGAACTCTA CCGACGCGAC CCTACGTATT CACTTTCGCT GGCGTCGCTG GAGTCTGGGC CGTCGCCTTG CCGCCGGAGC GTTTCCAGGG CACTAATCCC ATCCCGA CGTAGGGCAG ACCGACTTTC AATGCTGATC CCGAACTGAG CGGCCATTGT CCACCTTCCT CTGGCAACAC GAGCTGACGA GCTTTCCGGT TGCTCCGCCG TCCCCAGGCG ACCTAGTGCC CGCTTTCGCT CCTGATATCT GCCTGCCCGT AAGCCGCCTA ACCGCGGCTG TCTTCCCTGC CATCAGGCTT CGTGTCTCAG GTGAGCCATT TTTCGACCCG CTTGTCCCAG CACCCGAAGG Nguyễn Thị Thúy Ngân ATCCGTCTGC GTGACGTGAC TGCGATTACT ACCGGCTTTT AGCACGTGTG CCGAGTTGAC GGGACAAGGG CAGCCATGCA GTATGTCAAG CTTGTGCGGG GGGCACTTAA CACCGTTTAC CCTCAGCGTC GCGCATTTCA ATCGACTGCA CGAGCTCTTT CTGGCACGTA TGAAAGAGGT TCGCCCATTG TCCCAGTGTG ACCTCACCAA CCAAGATGCC AGTGCAGGGC TGGTTCATCG ATCCCTCCCA GGGCGGTGTG AGCGACTCCG TGAGATTCGC CAGCCCAAGA CCCGGCGGTC TTGCGCTCGT CCACCTGTAC CCTTGGTAAG CCCCCGTCAA TGCGTTAGCT GGCGTGGACT AGTATCGGCC CCGCTACACC GACCCGGGGT ACGCCCAATA GTTAGCCGGC TTACAACCCG TGCAATATTC GCCGGTCGCC CAAGCTGATA TTGGCAGGTC AGATTGCCCA TCGACTATCA CAGGGGGTTG TACAAGGCCC ACTTCATGGG TCCACCTTGC CATAAGGGGC TCCCGTGAGT TGCGGGACTT ACCGACCACA GTTCTTCGCG TTCCTTTGAG GCGGCACGGA ACCAGGGTAT CAGAGATCCG AGGAATTCCG TAAGCCCCGG ATTCCGGACA GCTTCTTCTG AAGGCCGTCA CCCACTGCTG CTCTCAGGCC GGCCGCGGGC AGTATCCGGT CGTGTTACTC CGAGCGGAGC GGCCACCGGC GGGAACGTAT GTCGAGTTGC GGTATCGCAG ATGATGACTT CCCCAACCTC AACCCAACAT AGGGGGGCAC TTGCGTCGAA TTTTAGCCTT CAACGTGGAA CTAATCCTGT CCTTCGCCAC ATCTCCCCTA GCTTTCACAA ACGCTTGCGC CAGGTACCGT TCCCTCACGC CCTCCCGTAG GGCTACCCGT TCATCCTGCA ATTAGACCCC ACCCGTTCGC AGGAACCCAC Page 38 Viện Đại Học Mở Hà Nội Sử dụng chương trình BLAST để so sánh trình tự đoạn gen chủng G278 với trình tự gen 16S ARN riboxom xạ khuẩn khác đăng ký Ngân hàng gen quốc tế Kết cho thấy đoạn gen có độ tương đồng cao (99%) so với gen 16S ARN riboxom chủng Streptomyces sp A01107 mã số KU382711, phân lập từ mẫu trầm tích biển Trung Quốc  Trình tự đoạn gen 16S ARN riboxom chủng G280 có độ dài 1448 bp Tỷ lệ: A(18% 271); T(24% 332); G(25% 366); C(33% 479) TGCAATAGGT GGCTTCGGGT TATTCACCGC TGCAGACCCC CAGCTCATTG CTTGACGTCG ACCCCGAAGG AACATCTCAC GGCACCATCT TCGAATTAAG GCCTTGCGGC TGGAATGTTG CCTGTTCGCT GCCACCGGTG CCCTACCGAA CACAACCGAC TGCGCCCTAC ACCGTCACTT CACGCGGCGT CGTAGGAGTC CCCGTCGTCG CTTCACCGCC ACCCCGTTTC TTCGCCACTA CAATCCAA TCAGTTGTCT GTTACCGACT AGCAATGCTG AATCCGAACT TACCGGCCAT TCCCCACCTT GCTTGCTGGC GACACGAGCT CTGATGCTTT CCACATGCTC CGTACTCCCC CCCACACCTA CCCCACGCTT TTCCTCCTGA CTCTAGCCTG GTGACAAGCC GTATTACCGC TCGCTTCTTC CGCTGCATCA TGGGCCGTGT CCTTGGTGAG GGAGCTTTCG CAGGGCTTGT ATCCCCACCC AACATATCAT TTCGTGACGT ATCTGCGATT GAGACCGGCT TGTAGCACGT CCTCCGAGTT AACACGGGAC GACGACAGCC CCGGTGTATG CGCCGCTTGT AGGCGGGGCA GTGCCCACCG TCGCTCCTCA TATCTGCGCA CCCGTATCGA GCCTACGAGC GGCTGCTGGC CCTGCTGAAA GGCTTTCGCC CTCAGTCCCA CCATTACCTC ACCCGCCAAG CCCAGAGTGA GAAGGTGGTT GTGCTACCTC GACGGGCGGT ACTAGCGACT TTTTGAGATT GTGCAGCCCA GACCCCGGCG AAGGGTTGCG ATGCACCACC TCAAGCCTTG GCGGGCCCCC CTTAATGCGT TTTACGGCGT GCGTCAGTAT TTTCACCGCT CTGCAGACCC TCTTTACGCC ACGTAGTTAG GAGGTTTACA CATTGTGCAA GTGTGGCCGG ACCAACAAGC ATGCCTTGGC AGGGCAGATT CATCGTTCGA CCACAAGGGG GTGTACAAGG CCGACTTCAT CGCTCCACCT AGACATAAGG GTCTCCCGTG CTCGTTGCGG TGTACACCGA GTAAGGTTCT GTCAATTCCT TAGCTGCGGC GGACTACCAG CGGCCCAGAG ACACCAGGAA GGGGTTAAGC CAATAATTCC CCGGCGCTTC ACCCGAAGGC TATTCCCCAC TCGCCCTCTC TGATAGGCCG AGGTCAGTAT GCCCACGTGT CTGCATTGTA TTGGGCCACC CCCGGGAACG GGGGTCGAGT TGCGGTATCG GGCATGATGA AGTCCCCAAC GACTTAACCC CCACAAGGGG TCGCGTTGCG TTGAGTTTTA ACGGACAACG GGTATCTAAT ATCCGCCTTC TTCCGATCTC CCCGGGCTTT GGACAACGCT TTCTGCAGGT CGTCATCCCT TGCTGCCTCC AGGCCGGCTA CGGGCTCATC CCGGTATTAG TACTCACCCG AGCATCACGC Kết so sánh trình tự đoạn gen chủng G280 với trình tự gen 16S ARN riboxom xạ khuẩn khác đăng ký Ngân hàng gen quốc tế cho thấy, đoạn gen có độ tương đồng cao (99%) so với gen 16S ARN riboxom chủng Streptomyces sp GS13 mã số JX465725 phân lập từ mẫu bùn từ nước thải Viện Hàn lâm Khoa học Trung Quốc công bố Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 39 Viện Đại Học Mở Hà Nội  Trình tự đoạn gen 16S ARN riboxom chủng G290 có độ dài 1441 bp Tỷ lệ: A(18% 251); T(23% 298); G(26% 349); C(33% 443) TGGGAGAAGG TCGGGTGTTA CACCGCAGCA GACCCCAATC TCATTGTACC ACGTCGTCCC CGAAGGGCTT TCTCACGACA CCATCTCTGA ATTAAGCCAC TGCGGCCGTA ATGTTGCCCA TTCGCTCCCC CCGGTGTTCC ACCGAACTCT ACCGACGTGA CCCTACGTAT TCACTTTCGC CGGCGTCGCT GGAGTCTGGG TCGTCGCCTT ACCGCCGGAG TAAGCACCCG ACAAGTCGGC CCGACTTTCG ATGCTGATCT CGAACTGAGA GGCCATTGTA CACCTTCCTC GCTGGCAACA CGAGCTGACG TGCTTTCCGG ATGCTCCGCC CTCCCCAGGC CACCTAGTGC ACGCTTTCGC TCCTGATATC AGCCTGCCCG CAAGCCGCCT TACCGCGGCT TTCTTCCCTG GCATCAGGCT CCGTGTCTCA GGTGAGCCAT CTTTCGACCC GCCAGAAGCC ATCCATGTGC TGACGTGACG GCGATTACTA CCGGCTTTTT GCACGTGTGC CGAGTTGACC CGGGACAAGG ACAGCCATGC TGTATGTCAA GCTTGTGCGG GGGGCACTTA CCACCGTTTA TCCTCAGCGT TGCGCATTTC TATCGACTGC ACGAGCTCTT GCTGGCACGT CTGAAAGAGG TTCGCCCATT GTCCCAGTGT TACCTCACCA GCCAAGATGC A TACTCCCACA GGCGGTGTGT GCGACTCCGA GAGATTCGCT AGCCCAAGAC CCGGCGGTCT GTTGCGCTCG ACCACCTGTA GCCTTGGTAA GCCCCCGTCA ATGCGTTAGC CGGCGTGGAC CAGTATCGGC ACCGCTACAC AGACCCGGGG TACGCCCAAT AGTTAGCCGG TTTACAACCC GTGCAATATT GGCCGGTCGC ACAAGCTGAT CTTGGCAGGT GGGGGAATGG ACAAGGCCCG CTTCATGGGG CCACCTTGCG ATAAGGGGCA CCCGTGAGTC TTGCGGGACT CACCGACCAC GGTTCTTCGC ATTCCTTTGA TGCGGCACGG TACCAGGGTA CCAGAGATCC CAGGAATTCC TTAAGCCCCG AATTCCGGAC CGCTTCTTCT GAAGGCCGTC CCCCACTGCT CCTCTCAGGC AGGCCGCGGG CAGTATCCGG GCCACCGGCT GGAACGTATT TCGAGTTGCA GTATCGCAGC TGATGACTTG CCCAACACCC TAACCCAACA AAGGGGGGCA GTTGCGTCGA GTTTTAGCCT ACAACGTGGA TCTAATCCTG GCCTTCGCCA GATCTCCCCT GGCTTTCACA AACGCTTGCG GCAGGTACCG ATCCCTCACG GCCTCCCGTA CGGCTACCCG CTCATCCTTC TATTAGATTG Kết so sánh trình tự đoạn gen chủng G290 với trình tự gen 16S ARN riboxom xạ khuẩn khác đăng ký Ngân hàng gen quốc tế cho thấy, đoạn gen có độ tương đồng cao (99%) so với gen 16S ARN riboxom chủng Streptomyces coelicoflavus KS-3, mã số KT895421 Đại học Công nghệ Hunan Trung Quốc.cơng bố Từ kết so sánh trình tự gene 16S ARN riboxom chủng phân lập Chúng kết luận chủng nghiên cứu G278, G280, G290 thuộc chi Streptomyces spp Streptomyces chi lớn ngành Actinobacteria chi thuộc nhánh Streptomycetaceae Streptomyces chứng minh sản xuất hợp chất ức chế chất chuyển hóa có liên quan đến suy giảm việc hình thành màng sinh học, hoạt động cảm biến chống lại tác nhân gây bệnh (You et al., 2007) hoạt động chống độc lực vi khuẩn Vibrio sp (Iwatsuki et al., 2008) Bên cạnh hiệu ứng ức chế vi khuẩn gây bệnh nuôi trồng thủy sản, Streptomyces ghi nhận Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 40 Viện Đại Học Mở Hà Nội có hoạt động chống virus, đặc biệt virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV; Jenifer et al, 2015) Bên cạnh tăng trưởng tốt tôm, tất thức ăn bổ sung Streptomyces cho thấy cải thiện hiệu suất tăng trưởng cá cảnh Xiphophorus helleri (cá đuôi kiếm đỏ) sau 50 ngày thử nghiệm cho ăn so với chế độ ăn đối chứng khơng có Streptomyces sp (Dharmaraj Dhevendaran, 2010) Hơn nữa, nghiên cứu tương tự cho thấy việc sản xuất hormone tăng trưởng, axit kích thích tố Streptomyces sp khiến tốc độ tăng trưởng tốt hơn, thể qua việc cho cá Xiphophorus helleri ăn thức ăn bổ sung Streptomyces (Dharmaraj Dhevendaran, 2010) Tại trang trại Viveros Negros, nơi bị thiệt hại nặng nề vi khuẩn Vibrio gây Các loại thuốc kháng sinh sử dụng thức ăn, nhiên hiệu mang lại khơng cao Sự có mặt vi khuẩn Vibrio ao ni vùng thường mức 103-104/ml vòng 2-3 tuần ao ni sinh sản Tuy nhiên, chế phẩm sinh học sử dụng khơng thấy xuất bệnh tỷ lệ sống cao (80-100%) có diện vi khuẩn Vibrio nước Như vậy, việc sử dụng chế phẩm sinh học dựa nguyên tắc cạnh tranh loại trừ phương pháp thay hữu hiệu việc phòng điều trị bệnh tôm, đồng thời hướng tới ngành nuôi tôm bền vững, thân thiện với môi trường mang đến sản phẩm chất lượng, an toàn cho người tiêu dùng.[44] Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 41 Viện Đại Học Mở Hà Nội PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận  Từ mẫu trầm tích biển thu Thanh Hóa – Quảng Bình – Quảng Trị, tuyển chọn 15 chủng xạ khuẩn thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định  Đã chọn chủng xạ khuẩn có khả kháng tốt số vi sinh vật kiểm định Chủng G280 có đường kính kháng vi khuẩn V alginolyticus 13mm, kháng vi khuẩn V cholera 10mm, kháng vi khuẩn V parahaemolyticus 13mm; chủng G290 có đường kính kháng vi khuẩn V alginolyticus 13mm, kháng vi khuẩn V vulnificus 15mm, kháng vi khuẩn V parahaemolyticus 14mm; chủng G278 có đường kính kháng vi khuẩn V cholera 13mm, kháng vi khuẩn V parahaemolyticus 16mm  Cả chủng có khả sinh enzyme với độ mạnh yếu khác nhau, nhiên chủng G278 có khả sinh amylase cao với vòng phân giải 15mm, chủng G278 có khả sinh protease cao với vòng phân giải 25mm chủng có khả sinh cellulase cao G278 với vòng phân giải 23mm  Từ số đặc điểm hình thái so sánh trình tự gene 16S ARN riboxom chủng phân lập Chúng tơi kết luận chủng nghiên cứu G290, G280, G278 thuộc chi Streptomyces spp 5.2 Kiến nghị  Cần có nghiên cứu thêm đặc điểm lý sinh hóa sinh đê khẳng định chủng nghiên cứu G278, G280, G290 thuộc lồi Streptomyces  Tối ưu hóa điều kiện trình lên men lựa chọn giá thể để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học đối kháng chủng Vibrio sp ba chủng: G278, G280, G290 Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 42 Viện Đại Học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 1, NXBKHKT Hà Nội, 1972 [2]Vi Thị Đoan Chính, Nghiên cứu khả nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces rimosus R77 Streptomyces hygroscopicus 5820 kỹ thuật dung hợp tế bào trần, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện công nghệ sinh học Hà Nội, 2000 [3]Chen M., Xiao X., Wang F, Arthrobacter ardleyensis sp nov isolated from Antarctic lake swdiment and deep-sea sedimen, Arch Microbiol, 183, pp 301-305, 2008 Norcardiopis alkalipila phân lập từ đất sa mạc Ai Cập sống pH 9,5-10 [4] ] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội [5] Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối rễ phân lập Việt Nam, Luận án phó tiến sĩ khoa học Sinh học, viện CNSH, Trung tâm KHTN CN Quốc Gia, Hà Nội [6] Nguyễn Trọng Nho , Tạ Khắc Cường , Lục Minh Diệp , Nguyễn Thi ̣ Xuyến (1997), Nghiên cứu cải tiến quy trình ni tơm sú thịt Khánh Hòa đạt hiệu kinh tế cao suất ổn định, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học, Nha Trang [7] Nguyễn Tác An (1998), Báo cáo đề tài “Điều tra trạng môi trường ven biển thành phố Nha Trang đề xuất giải pháp cải thiện phát triển môi trường”, Nha Trang [8] Lại Thúy Hi ền (1998), “Một số đặc điểm sinh lí, sinh hóa số chủng vi khuẩn khử sulphat phân lập từ mỏ dầu Bạch Hổ”, Tạp chí sinh học, 8, tr 37-38 [9] Võ Thị Thứ , La Thi ̣ Nga, Trương Ba Hùng , Nguyễn Minh Dương , Nguyễn Liêu Ba (2003), Nghiên cứu tạo chế phẩm Biochie đánh giá tác dụng chế Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 43 Viện Đại Học Mở Hà Nội phẩm đến môi trường nước nuôi tôm cá , Hội nghi ̣ Công nghê ̣ sinh học toàn quốc 12/2003 [10] Vũ Trung Tạng (2001), Cơ sở sinh thái học, Nhà xuất giáo dục, Hà Nội [11] Lê Văn Cát (2007), Xử lý nước giàu hợp chất nitơ photpho, Nhà xuất Khoa học tự nhên Công nghệ, Hà Nội [12] Nguyễn Hữu Thọ (2001), “Biến động sulfite, ammonia, nitrite, BOD, COD, chlo hữu môi trường nước ảnh hưởng đến khả xảy bệnh đốm trắng, bệnh đàu vàng tơm ni Khánh Hòa”, Tạp trí thủy sản, 43, Bộ Thủy sản-Trung tâm nghiên cứu thủy sản III, tr 5-15 [13] Võ Thị Thứ , La Thi ̣ Nga, Trương Ba Hùng , Nguyễn Minh Dương , Nguyễn Liêu Ba (2003), Nghiên cứu tạo chế phẩm Biochie đánh giá tác dụng chế phẩm đến môi trường nước nuôi tôm cá , Hội nghi ̣ Công nghê ̣ sinh học toàn quốc 12/2003 [14] Nguyễn Tác An (1996), Phương pháp quản lý chất lượng nước phục vụ ni trồng thủy hải sản, Giáo trình cao học, Đạ i học thủy sản Nha T rang [15] Văn Phú (2003), “Bio – niềm tin trọn vẹn người ni tơm ”, Tạp chí thủy sản, (12/2002, 1/2003) [16] Đỗ Thu Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh trống nấm phân lập đất Quảng Nam – Đà Nẵng, Luận án Tiến sĩ sinh học, Hà Nội, 2004 [17] Trịnh Ngọc Hồng, Nghiên cứu tính đối kháng xạ khuẩn với số vi sinh vật gây nhiễm trùng bệnh viện, Luận án Thạc sĩ Sinh học 2009 [18] BSTY Nguyễn Xuân Hòa - PGS TS Phạm Hồng Sơn Trường Đại Học Nông Lâm Huế- Khoa Chăn Nuôi –Thú Y-Bộ môn Ký sinh – Truyền nhiễm Tài liệu Tiếng Anh [19] Nor Ainy Mahyudin (2008), “Actinomycetes and Fungi associated with marine Invertebrates: A potential source of bioactive compounds”, Doctor of Philosophy in Microbiology at the University of Canterbury, New Zealand [20] Paul R Jensen, Dwight R., and Fenical W (1991), “Distribution of Actinomycetes in Near-Shore Tropical Marine Sediments”, Applied and Environmental Microbiology, Vol 57, No 4, 1102-1108 Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 44 Viện Đại Học Mở Hà Nội [21] Zhang JF, Liu JJ, Lu MQ, Yang Y, Li H, Xu C, Chen GH, Rapamycin in hibits cell growth by induction of apoptosis on hepatocellular carcinomacells in vitro, Tranpsl,2007 [22] Pasti M B., Pometto A P., Nuti M P., Crawford D L., Ligninsolubilizing abbility of actinomyces isolated from termite (Termitidae) gutt, Appl Environ Microbiol, pp.2213-2218, 1990 [23] Steger K, PhD Thesis: Compostion of microbial communities in compost A tool to assess process development and quality of thr final product Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, 2006 [24]Seong C N., Kimm Y S., Lee S D., Hah Y C., Kim S B., Goodfellow M, Mycolic acid-containning actinomycetes associated with actived sludge foam, J Microbiol, 37, pp.66-72, 1999 [25]Chen M., Xiao X., Wang F, Arthrobacter ardleyensis sp nov isolated from Antarctic lake swdiment and deep-sea sedimen, Arch Microbiol, 183, pp 301-305, 2008 Norcardiopis alkalipila phân lập từ đất sa mạc Ai Cập sống pH 9,5-10 [26] Hozzein W.N., Li W.J., Ali M.I.A, Hammouda O., Mousa A.S., Xu L.H., Jiang C.L., Nocardiopsis alkliphila sp now., a novel alkaliphilic actinomyces isolated from desert soil in Egypt, Int J Syst Evol Microbial, 54, pp.247-252, 2004 [27] Boyd C E and Tucker C S (1998), Pond aquaculture water quality Management, Kluwer Academic Publishers, London, pp )))))) [28] Artemia Internation LLC (2002), “Sprirulina superfood for ornamental fish”, Technical Information Shrimp Larval and Enrichment Feeds, Dec [29] Wang-Xiang-Hong, LiJun, JiWei-Shang, Xu-Huai-Shu (2002), Application of Probiotics in Aquaculture, Ocean University of Chindo, China, May 20, pp 145-147 [30] Hebe M Dionisi, Alice C Layton, Gerda Harms, Igrid R Gregory, Kevin G Robinson and Gray S Sayler (2002), “Quantification of Nitrosomonas oligotropha like Ammonia Oxidizing Bacteria & Nitrospira spp from Full-Scale Wastewater Treatment Plants by Competitive PRC”, Application and Evironmental Microbiology, pp 245-253 Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 45 Viện Đại Học Mở Hà Nội [31] Kakani (2003), “Probiotics: their role in aquaculture, Energee - American Standard Products”, Inc, Jan 10 [32] Austin B & Zhang X-H (2006) "Vibrio harveyi: a significant pathogen of marine vertebrates and invertebrates" Letters in Applied Microbiology 43 (2):119214 (10) [33] R Gupta, O.K Beg, P Lorenz, Bacterial alkaline protease: molecular approaches and industrial application, Appl Microbiol Biotrechol 59 (1), p.15, 2002 [34] Einar R, 2002 Good vs Bad bacteria The talk on fish health In: SEAFDEC Asian aquaculture, Xxiv (2): 3-20 [35] Ige BA, 2013 Probiotics use in intensive fish farming Africal J Microbiol Res., 7(22):2701-2711 [36] Kolndadacha OD, Adikwu IA, Okaeme AN, Atiribom RY, Mohammed A, and Musa YM, 2011 The role of probiotics in Aquaculture in Nigeria – a review Continental J Fisheries and Aquatic Science, (1): – 15 [37] Kolndadacha OD, Adikwu IA, Okaeme AN, Atiribom RY, Mohammed A, and Musa YM, 2011 The role of probiotics in Aquaculture in Nigeria – a review Continental J Fisheries and Aquatic Science, (1): – 15 [38] Merrifield DL, Dimitroglou A, Foey A, Davies SJ, Baker RMT, Bogwald J, Castex M, Ringo E, 2010b The current status and future focus of probiotic and prebiotic applications for salmonids Aquaculture, 302:1-18 [39] Rico A, Phu T, Satapornvanit K, Min J, Shahabuddin A M, Henriksson P J G, Muray FJ, Little DC, Dalsgaard A, Van den Brink P, 2013 Use of veterinary medicines, feed additives and probiotics in four major internationally traded aquaculture species farmed in Asia Aquaculture, 412–413 [40] Soccol CR, de Souza Vandenberghe LP, Spier MR, Medeiros ABP, Yamaguishi CT, Lindner JDD, Pandey A and Thomas-Soccol V, 2010 The potential of probiotics: a review Food Technol Biotechnol., 48(4):413-434 [41] Moriaty DJW, 1998 Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture ponds Aquaculture, 164:351-358 Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 46 Viện Đại Học Mở Hà Nội Các trang web tham khảo [42] http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan01.htm [43]http://www.vnua.edu.vn:85/tc_khktnn/Upload%5C2102014tc%20so%205%204.pdf [44] https://www.chungvisinh.com/che-pham-sinh-hoc-trong-nuoi-trong-thuy-sangiup-kiem-soat-dich-benh.html/ [45]http://text.123doc.org/document/2440965-nghien-cuu-muc-do-nhiem-vi-khuanvibrio-spp-gay-benh-tren-tom-su-penaeus-monodon-fabricius-1798-nuoi-thamcanh-trong-he-thong-nuoi-da-cap-tai-hai-phong.htm [46] http://iebr.ac.vn/database/HNTQ5/982.pdf [47]https://voer.edu.vn/c/kha-nang-cua-vi-sinh-vat-phan-huy-mot-so-nhomchat/f65b4f19/3e9bcf9e Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 47 ... tài: Phân lập tuyển chọn số chủng xạ khuẩn có khả phân giải chất hữu ức chế Vibrio từ mẫu trầm tích biển thu thập Thanh Hóa – Quảng Bình – Quảng Trị Mục tiêu: Sàng lọc chủng xạ khuẩn từ mẫu trầm. .. sách tọa độ mẫu mẫu trầm tích thu thập Thanh Hóa – Quảng Bình – Quảng Trị Bảng 4.2 Danh sách 15 chủng xạ khuẩn phân lập Bảng 4.3 Kết thử hoạt tính kháng số chủng vi khuẩn Vibrio chủng xạ khuẩn Viện... cứu: - Phân lập chủng xạ khuẩn từ mẫu trầm tích biển thu thập vùng biển Thanh hóa – Quảng Bình – Quảng Trị - Sàng lọc vi sinh vật có hoạt tính phân giải chất hữu đối kháng số loài Vibrio - Định