7. Những đóng góp mới của đề tài
2.2. Môi trƣờng
2.2.1. Môi trường phân lập xạ khuẩn
Môi trường Gause I
K2HPO4 0,5 g FeSO4 (dạng vết) 0,01 g
KNO3 1 g Thạch agar 20 g
MgSO4. 7H2O 0,5 g pH 7,2
NaCl 0,5 g Nƣớc cất 1000 ml
Môi trường Czapeck - tinh bột
Tinh bột tan 20 g CaCO3 3 g
KCl 0,5 g FeSO4 (dạng vết) 0,01 g
NaNO3 3 g Thạch agar 20 g
MgSO4. 7H2O 0,5 g pH 7,2
K2HPO4 1 g Nƣớc cất 1000 ml
Môi trường Czapeck - glucose
Glucose 20 g CaCO3 3 g
KCl 0,5 g FeSO4 (dạng vết) 0,01 g
NaNO3 3 g Thạch agar 20 g
MgSO4. 7H2O 0,5 g pH 7,0
K2HPO4 1 g Nƣớc cất 1000 ml
2.2.2. Môi trường bảo quản và giữ giống
Môi trường Gause I ( mục 2.2.1)
2.2.3. Môi trường thử hoạt tính enzyme
Thử hoạt tính: Thay nguồn cacbon bằng giấy lọc, CMC, các phế phụ phẩm nông nghiệp.
MT 1: 1% CMC
22 K2HPO4 0,5 g Thạch agar 20 g MgSO4.7H2O 0,5 g CMC 1% KCl 0,5 g H2O 1000 ml MT 2: 1% bột giấy NaNO3 1,5 g NaCl 1% KH2PO4 0,5 g Thạch agar 20 g MgSO4. 7H2O 0,5 g Bột giấy 1% KCl 0,5 g H2O 1000ml
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu
Dùng dao lấy khoảng 10 – 15 g đất theo các độ sâu: 0 cm, 5 cm, 10 cm, 15 cm, 20 cm, 25 cm, 30 cm ở 2 vị trí A, B (hình 2.3). Các mẫu đất đƣợc đựng vào túi nilon đã khử trùng, buộc kín miệng túi. Mỗi túi đựng một mẫu đất ở một độ sâu nhất định. Trên mỗi túi ghi rõ nơi lấy mẫu, loại đất, thời gian và độ sâu lấy mẫu. Sau đó, các mẫu đất đƣợc chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập ngay, có thể bảo quản trong tủ lạnh ở 40C tối đa 6 ngày.
23
2.3.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski
Cân 1 g đất cho vào bình nón 50 ml nƣớc cất vô trùng, lắc trên máy lắc 30 phút. Dùng pipet vô trùng hút 0,5 ml dịch đất sang ống nghiệm có chứa 4,5 ml nƣớc vô trùng và tiếp tục pha loãng đến 10-2
, 10-3, …. 10-10. Từ mỗi nồng độ pha loãng ở 10-5
đến 10-6 nhỏ 0,1 ml sang đĩa petri chứa môi trƣờng Gause I. Dùng que gạt vô trùng chang đều, sau đó nuôi trong tủ ấm từ 7 – 12 ngày. Trên mỗi mẫu đất khuẩn lạc của xạ khuẩn đƣợc cấy sang đĩa petri chứa môi trƣờng Gause I để làm sạch. Các khuẩn lạc đƣợc cấy truyền sang ống nghiệm chứa môi trƣờng thạch nghiêng Gause I, tiếp tục nuôi ở điều kiện trên trong 7 – 12 ngày [7]. Với mỗi mẫu đất ở các độ sâu khác nhau cấy lên 3 môi trƣờng: Gause I, Czapeck- tinh bột, Czapeck - glucose.
2.3.3. Phương pháp bảo quản chủng giống
Sau từ 7 - 12 ngày nuôi cấy mẫu trong tủ ấm 28 - 30ºC, chuyển sang để ở tủ lạnh nhiệt độ 2 - 4ºC. Cấy chuyển định kì 2 tháng 1 lần trên môi trƣờng Gause I. Trƣớc khi sử dụng giống cần hoạt hóa xạ khuẩn [7].
2.3.4. Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn Quan sát hình thái của hệ sợi khí sinh
Dựa theo tài liệu của ISP, Gause và cộng sự (1983), xác định màu sắc của HSKS dựa vào bảng màu của Tresner và Buckus. Căn cứ vào màu sắc HSKS của các chủng mới phân lập để phân thành 8 nhóm màu: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh, Blue (B) nhóm xanh da trời, Violet (V) nhóm tím, và nhóm màu không xác định (X).
Quan sát màu sắc của hệ sợi cơ chất
Màu sắc của HSCC đƣợc xác định qua quan sát trực tiếp trên môi trƣờng thạch đĩa hoặc thạch nghiêng và mô tả theo thang màu chuẩn của Bondarsev (1953), Tresner và cộng sự (1961).
24
Quan sát cuống sinh bào tử
Xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Gause I có găm lamen nghiêng 45ºC trên bề mặt môi trƣờng. Sau 7 – 9 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng lấy ra quan sát hình dạng chuỗi sinh bào tử trên lamen dƣới kính hiển vi quang học. Chuỗi sinh bào tử có dạng thẳng hay lƣợn sóng ký hiệu là RF (Rectus Flexibilis), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Rectinaculum Apertum) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spira) [24].
2.3.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn Khả năng sinh enzyme ngoại bào Khả năng sinh enzyme ngoại bào
Khả năng phân giải cellulose trên giấy lọc vô trùng trong môi trƣờng cellulose hoặc CMC. Hoạt tính đƣợc xác định bằng dung dịch Lugol sau 4 ngày nuôi cấy [6].
2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khuẩn Phương pháp khuếch tán trên thạch
Chuẩn bị môi trƣờng cơ chất + thạch (pH = 7,0 – 7,2) gồm 20 g thạch agar + 2 g CMC (hoặc 2 g bột cellulose) trong 1000 ml nƣớc. Thanh trùng ở 1atm trong 30 phút. Đổ môi trƣờng vào các hộp petri sao cho bề dày lớp thạch khoảng 3mm. Dùng khoan nút chai đục lỗ (d = 10 mm) trên lớp thạch cách nhau 40 mm. Nhỏ 0,2 ml dịch enzyme cần thử và 0,2 ml H2O làm đối chứng, để trong tủ lạnh 4ºC khoảng 4 giờ, sau đó đặt vào tủ ấm 30ºC trong 24 giờ. Hoạt tính enzyme đƣợc xác định bằng giá trị D – d (mm) sau khi nhuộm màu bằng thuốc thử lugol. Vùng CMC (hay cellulose) bị phân giải không bắt màu ở xung quanh lỗ thạch [7].
Phương pháp cấy chấm điểm
25
Dùng que cấy chấm nhẹ vào khuẩn lạc sau đó chấm nhẹ một điểm xuống bề mặt thạch đĩa.
Nuôi khuẩn lạc trong tủ ấm sau 4 ngày mang ra thử hoạt tính với thuốc thử Lugol I, đo kích thƣớc vòng phân giải.
2.3.7. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
Chúng tôi xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp nhƣ:
Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm:
Trung bình bình phƣơng các sai lệch: Sai số đại diện của trung bình cộng:
Trong đó: Xi : giá trị của mỗi lần do n : số lần thí nghiệm
26
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn sinh enzyme cellulase từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
3.1.1. Phân lập xạ khuẩn từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc Vĩnh Phúc
3.1.1.1. Đặc điểm khuẩn lạc
Tiến hành lấy mẫu đất ở các độ sâu khác nhau theo thứ tự 0cm, 5cm,10cm, 15cm, 20cm, 25cm, 30cm tại khu vực đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc. Bởi vì hệ vi sinh vật phong phú nhất so với trong khí quyển và trong nƣớc. Xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí nên trong đất ngập nƣớc nhƣ đất lúa nƣớc hàm lƣợng O2 thấp sẽ có ít xạ khuẩn. Đất trồng là đất tơi xốp, thoáng khí thích hợp cho xạ khuẩn phát triển. Mặt khác trên đất trồng có nhiều xác động thực vật: lá rụng, rễ chết, thân cành cây chết, xác các động vật nguyên sinh trong đất...cùng với các sản phẩm tiết của rễ cây sống làm cho hệ vi sinh vật đất phát triển phong phú trong đó có xạ khuẩn. Chuẩn bị 3 môi trƣờng phân lập: Gause I, Czepeck- tinh bột, Czepeck. Tiến hành phân lập theo phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn từ mẫu đất (mục 2.3.2 chƣơng 2). Chọn các hộp petri mà ở đó các khuẩn lạc mọc riêng rẽ, có thể tuyển chọn đƣợc, không thấy có nấm mốc, không xét các khuẩn lạc nhẵn, nhày, ƣớt, loại bỏ các hộp petri không có khuẩn lạc hoặc các khuẩn lạc phát triển dày khít nhau. Xạ khuẩn mới phân lập thƣờng có hoạt tính kháng sinh chống vi sinh vật kiểm định, nên có thể xung quanh khuẩn lạc sẽ có vòng vô khuẩn. Một số khuẩn lạc xạ khuẩn thƣờng có dạng tia phóng xạ. Quan sát sau 5 ngày chúng tôi thu đƣợc 20 khuẩn lạc xạ khuẩn. Các hộp lồng không xuất hiện khuẩn lạc hoặc các khuẩn lạc phát triển quá dày đƣợc đem đi hấp bẩn,
27
khử trùng, làm sạch, 20 khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập đƣợc đem đi thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả phân lập đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
STT Độ sâu Độ pha loãng
Môi trƣờng
Gause I Czapeck Czapeck- tinh bột 1 0 cm 10-5 10-6 X1 2 5 cm 10 -5 X2, X3 X4 10-6 3 10 cm 10 -5 X5, X6 X7 10-6 X8, X9 X10 4 15 cm 10 -5 X11, X12 10-6 X13, X14 X15 5 20 cm 10 -5 X16 10-6 X17 6 25 cm 10 -5 X18 X19 10-6 7 30 cm 10 -5 X20 10-6
Tiến hành phân lập xạ khuẩn trên môi trƣờng nuôi cấy để kiểm tra xạ khuẩn trong đất có khả năng phân giải cellulose, chúng tôi xác định đƣợc 20 chủng thuộc nhóm xạ khuẩn chi Streptomyces trong đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc có khả năng phân giải cellulose mạnh.
28
Trên 3 môi trƣờng Gause I, Czapeck- tinh bột, Czapeck cả xạ khuẩn và một số vi khuẩn đều mọc. Nguyên nhân là các loại VSV này đều có khả năng phân giải cellulose. Nhƣng có thể phân biệt rõ ràng các khuẩn lạc này dựa vào đặc điểm đƣợc đƣa ra ở bảng 3.2 và hình 3.4.
Bảng 3.2. Đặc điểm khuẩn lạc của một số VSV
STT Khuẩn lạc Đặc điểm
1 Vi khuẩn Nhầy, ƣớt nhẵn
2 Xạ khuẩn Bông xốp, khô rắn chắc, xù xì, dạng da, dạng nhung, dạng phấn, nhìn kĩ có dạng sợi nấm nhƣng đƣơng kính sợi bé hơn sợi nấm rất nhiều chi bằng 1 đến 2 phần 10 đƣờng kinh sợi nấm, nếu không có HSKS thì khuẩn lạc có dạng màng dẻo
A B Hình 3.4. Khuẩn lạc của một số VSV A. Khuẩn lạc vi khuẩn B. Khuẩn lạc xạ khuẩn
Sau 3 ngày phát triển khuẩn lạc xạ khuẩn có kích thƣớc khoảng 0.5 – 2.0mm. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn theo tiêu chuẩn sau: có sợi bông, xốp, khô, màu đặc trƣng, nhìn kỹ có dạng sợi nấm, có thể có dạng phóng xạ,
29
có thể có vòng vô khuẩn bao quanh, khuẩn lạc to. Kết quả phân lập trong môi trƣờng thạch trên hộp Petri đƣợc biểu diễn trên hình 3.5.
Hình 3.5. Khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
Qua bảng 3.1 ta thấy phân lập xạ khuẩn từ đất trồng trọt tại Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc thu đƣợc kết quả sau:
Ở độ sâu 5cm, 10cm, 15 cm phân lập đƣợc nhiều chủng xạ khuẩn nhất. Ở độ sâu 5cm phân lập đƣợc 3 chủng X2, X3, X4. Ở độ sâu 10cm phân lập đƣợc 6 chủng X5, X6, X7, X8, X9, X10. Ở độ sâu 15cm phân lập đƣợc 5 chủng X11, X12, X13, X14, X15.
Môi trƣờng Gause I phân lập đƣợc nhiều xạ khuẩn nhất với 14 chủng X1, X2, X3, X5, X6, X8, X9, X11, X12, X13, X14, X16, X18, X20.
Xạ khuẩn là loại VSV hoại sinh, hiếu khí, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trƣởng là 25- 300C, độ ẩm thích hợp từ 40-50%, độ pH trung tính hoặc kiềm nhẹ. Ở độ sâu 5cm, 10 cm, 15cm có những điều kiện tối ƣu về độ ẩm, nhiệt độ, độ pH...cho sự sinh trƣởng và phát triển của xạ khuẩn nên ta phân lập đƣợc nhiều xạ khuẩn ở 3 độ sâu này.
Môi trƣờng Gause I có thành phần môi trƣờng thích hợp nhất với sự phát triển của xạ khuẩn nên khuẩn lạc xạ khuẩn mọc trên môi trƣờng này
30
nhiều hơn 2 môi trƣờng Czapeck và Czapeck- tinh bột, vì thế ta phân lập đƣợc nhiều xạ khuẩn từ môi trƣờng này.
Các chủng xạ khuẩn tuyển chọn có khuẩn lạc dạng tròn, dày, bông, xốp, có màu sắc đa dạng. Phần lồi ra khỏi bề mặt môi trƣờng chính là phần HSKS, phần này có những cuống sinh bào tử nên làm cho khuẩn lạc bông, xốp. Phần bám chặt vào môi trƣờng thạch chính là phần HSCC, phần này rất khó tách ra. Khi sử dụng que cấy để cấy truyền sang môi trƣờng thạch nghiêng thì chỉ lấy đƣợc phần HSKS còn phần HSCC vẫn nằm trong môi trƣờng thạch.
Hình 3.6. Một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
X2 X12 X13 X10 X6 X5 X2 X3 X8 X4 X5 X19 X18 X10
31
Xác định được 20 chủng thuộc nhóm xạ khuẩn chi Streptomyces trong đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc có khả năng phân giải cellulose mạnh.
3.1.1.2. Đặc điểm hệ sợi
Tiến hành nghiên cứu đặc điểm HSKS, HSCC của 20 chủng xạ khuẩn đã phân lập đƣợc (bảng 3.3). Nuôi cấy các chủng này trên môi trƣờng Gause I, sau 3 – 5 ngày đem quan sát. Khuẩn lạc xạ khuẩn dạng tròn, dày, bông, xốp. Phần lồi ra khỏi bề mặt môi trƣờng chính là phần HSKS có những cuống sinh bào tử làm cho khuẩn lạc bông, xốp; phần bám chặt vào môi trƣờng thạch chính là HSCC rất khó tách ra. Khi sử dụng que cấy để cấy truyền khuẩn lạc sang ống thạch nghiêng thì chỉ lấy đƣợc phần HSKS còn phần HSCC vẫn nằm trên môi trƣờng thạch. Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn với hƣớng sinh trƣởng trong môi trƣờng tạo ra HSCC và mặt ngoài môi trƣờng tạo ra HSKS. Màu sắc của HSKS và HSCC rất đa dạng và phong phú: vàng, trắng, xám, đỏ, xanh ... đây là một trong những đặc điểm để tiến hành định loại xạ khuẩn. Từ 20 chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc, chúng tôi nhận thấy màu sắc HSKS rất đa dạng. Có 6 nhóm màu xuất hiện với số lƣợng và tỷ lệ khác nhau, đƣợc thể hiện trên bảng 3.4, hình 3.7.
Từ kết quả trên bảng 3.4 và hình 3.7 cho thấy, nhƣ thƣờng lệ, xạ khuẩn thuộc 2 nhóm trắng và xám vẫn chiếm ƣu thế. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn thuộc nhóm trắng chiếm 25%, tiếp đó là nhóm xám chiếm 20%, các nhóm đỏ, vàng, xanh chiếm 15%, nhóm hồng chiếm 10%. Cũng theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác nhƣ Vi Thị Đoan Chính [4], Đặng Văn Tiến, Nguyễn Đình Tuấn, Ngô Đình Quang Bính (2009), lại nhận thấy xạ khuẩn thuộc nhóm màu trắng chiếm ƣu thế hơn sau đó mới đến nhóm màu xám và các nhóm màu khác. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của một số tác giả nhƣ Nguyễn Minh Nguyệt [16], Nguyễn Thị Thúy Bạch [1], Nguyễn Lân Dũng [6], Lê Gia Hy
32
[14], khi phân lập xạ khuẩn cũng đã nhận thấy nhóm màu xám là chiếm ƣu thế. Nhƣ vậy, theo nhiều kết quả nghiên cứu chƣa thể tìm ra một quy luật chung cho sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu, nhƣng các kết quả nghiên cứu phân lập xạ khuẩn ở nhiều địa điểm khác nhau trong nƣớc đều nhận thấy là xạ khuẩn thuộc hai nhóm màu xám và trắng luôn có tần xuất xuất hiện cao hơn so với các nhóm màu khác.
Bảng 3.3. Đặc điểm khuẩn lạc của 20 chủng xạ khuẩn phân lập từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
STT Chủng xạ khuẩn Màu sắc khuẩn lạc HSKS HSCC 1 X1 Trắng Nâu xám 2 X2 Hồng Hồng nhạt 3 X3 Vàng Vàng nâu 4 X4 Xanh Xanh xám 5 X5 Đỏ Hồng đậm 6 X6 Trắng Vàng ôliu 7 X7 Đỏ Xám 8 X8 Xám Vàng
9 X9 Xanh da trời Xanh đậm 10 X10 Trắng Không có 11 X11 Hồng Đỏ gạch 12 X12 Trắng Vàng 13 X13 Vàng Vàng xám 14 X14 Xám Xám Xanh 15 X15 Đỏ Xanh 16 X16 Xám Vàng xỉn 17 X17 Xám Xám 18 X18 Vàng Vàng xỉn 19 X19 Trắng Xanh 20 X20 Xanh Xanh nhạt
33
Bảng 3.4. Số lƣợng và sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu
Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ các chủng xạ khuẩn phân theo nhóm màu
Việc nghiên cứu sắc tố tan giúp ta thêm cơ sở để phân loại xạ khuẩn. Mỗi loại xạ khuẩn đều có sắc tố tan khác nhau và đặc trƣng cho mỗi loài. Ngoài ra các sắc tố tan còn liên quan tới khả năng sinh kháng sinh, sinh enzyme của xạ
STT Nhóm màu Số lƣợng chủng phân lập Tỷ lệ (%) 1 Trắng (White) 5 25 ±2 2 Xám (Gray) 4 20 ±2 3 Vàng (Yellow) 3 15 ±2 4 Đỏ (Red) 3 15±2 5 Xanh (Blue) 3 15 ±2 6 Hồng (Pink) 2 10 ±2 7 Tổng 20 100
34
khuẩn, nếu các sắc tố tan mạnh chứng tỏ rằng xạ khuẩn sinh trƣởng tốt, từ đó khả năng sinh kháng sinh và enzyme đặc biệt là cellulase sẽ cao. Từ nghiên cứu ta nhận thấy trong các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc có 16 chủng có khả năng hình thành sắc tố tan, còn lại 4 chủng không sinh sắc tố tan đó là: X2 ,