7. Những đóng góp mới của đề tài
2.3.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn
Khả năng sinh enzyme ngoại bào
Khả năng phân giải cellulose trên giấy lọc vô trùng trong môi trƣờng cellulose hoặc CMC. Hoạt tính đƣợc xác định bằng dung dịch Lugol sau 4 ngày nuôi cấy [6].
2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khuẩn Phương pháp khuếch tán trên thạch
Chuẩn bị môi trƣờng cơ chất + thạch (pH = 7,0 – 7,2) gồm 20 g thạch agar + 2 g CMC (hoặc 2 g bột cellulose) trong 1000 ml nƣớc. Thanh trùng ở 1atm trong 30 phút. Đổ môi trƣờng vào các hộp petri sao cho bề dày lớp thạch khoảng 3mm. Dùng khoan nút chai đục lỗ (d = 10 mm) trên lớp thạch cách nhau 40 mm. Nhỏ 0,2 ml dịch enzyme cần thử và 0,2 ml H2O làm đối chứng, để trong tủ lạnh 4ºC khoảng 4 giờ, sau đó đặt vào tủ ấm 30ºC trong 24 giờ. Hoạt tính enzyme đƣợc xác định bằng giá trị D – d (mm) sau khi nhuộm màu bằng thuốc thử lugol. Vùng CMC (hay cellulose) bị phân giải không bắt màu ở xung quanh lỗ thạch [7].
Phương pháp cấy chấm điểm
25
Dùng que cấy chấm nhẹ vào khuẩn lạc sau đó chấm nhẹ một điểm xuống bề mặt thạch đĩa.
Nuôi khuẩn lạc trong tủ ấm sau 4 ngày mang ra thử hoạt tính với thuốc thử Lugol I, đo kích thƣớc vòng phân giải.
2.3.7. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
Chúng tôi xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp nhƣ:
Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm:
Trung bình bình phƣơng các sai lệch: Sai số đại diện của trung bình cộng:
Trong đó: Xi : giá trị của mỗi lần do n : số lần thí nghiệm
26
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn sinh enzyme cellulase từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
3.1.1. Phân lập xạ khuẩn từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc Vĩnh Phúc
3.1.1.1. Đặc điểm khuẩn lạc
Tiến hành lấy mẫu đất ở các độ sâu khác nhau theo thứ tự 0cm, 5cm,10cm, 15cm, 20cm, 25cm, 30cm tại khu vực đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc. Bởi vì hệ vi sinh vật phong phú nhất so với trong khí quyển và trong nƣớc. Xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí nên trong đất ngập nƣớc nhƣ đất lúa nƣớc hàm lƣợng O2 thấp sẽ có ít xạ khuẩn. Đất trồng là đất tơi xốp, thoáng khí thích hợp cho xạ khuẩn phát triển. Mặt khác trên đất trồng có nhiều xác động thực vật: lá rụng, rễ chết, thân cành cây chết, xác các động vật nguyên sinh trong đất...cùng với các sản phẩm tiết của rễ cây sống làm cho hệ vi sinh vật đất phát triển phong phú trong đó có xạ khuẩn. Chuẩn bị 3 môi trƣờng phân lập: Gause I, Czepeck- tinh bột, Czepeck. Tiến hành phân lập theo phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn từ mẫu đất (mục 2.3.2 chƣơng 2). Chọn các hộp petri mà ở đó các khuẩn lạc mọc riêng rẽ, có thể tuyển chọn đƣợc, không thấy có nấm mốc, không xét các khuẩn lạc nhẵn, nhày, ƣớt, loại bỏ các hộp petri không có khuẩn lạc hoặc các khuẩn lạc phát triển dày khít nhau. Xạ khuẩn mới phân lập thƣờng có hoạt tính kháng sinh chống vi sinh vật kiểm định, nên có thể xung quanh khuẩn lạc sẽ có vòng vô khuẩn. Một số khuẩn lạc xạ khuẩn thƣờng có dạng tia phóng xạ. Quan sát sau 5 ngày chúng tôi thu đƣợc 20 khuẩn lạc xạ khuẩn. Các hộp lồng không xuất hiện khuẩn lạc hoặc các khuẩn lạc phát triển quá dày đƣợc đem đi hấp bẩn,
27
khử trùng, làm sạch, 20 khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập đƣợc đem đi thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả phân lập đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
STT Độ sâu Độ pha loãng
Môi trƣờng
Gause I Czapeck Czapeck- tinh bột 1 0 cm 10-5 10-6 X1 2 5 cm 10 -5 X2, X3 X4 10-6 3 10 cm 10 -5 X5, X6 X7 10-6 X8, X9 X10 4 15 cm 10 -5 X11, X12 10-6 X13, X14 X15 5 20 cm 10 -5 X16 10-6 X17 6 25 cm 10 -5 X18 X19 10-6 7 30 cm 10 -5 X20 10-6
Tiến hành phân lập xạ khuẩn trên môi trƣờng nuôi cấy để kiểm tra xạ khuẩn trong đất có khả năng phân giải cellulose, chúng tôi xác định đƣợc 20 chủng thuộc nhóm xạ khuẩn chi Streptomyces trong đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc có khả năng phân giải cellulose mạnh.
28
Trên 3 môi trƣờng Gause I, Czapeck- tinh bột, Czapeck cả xạ khuẩn và một số vi khuẩn đều mọc. Nguyên nhân là các loại VSV này đều có khả năng phân giải cellulose. Nhƣng có thể phân biệt rõ ràng các khuẩn lạc này dựa vào đặc điểm đƣợc đƣa ra ở bảng 3.2 và hình 3.4.
Bảng 3.2. Đặc điểm khuẩn lạc của một số VSV
STT Khuẩn lạc Đặc điểm
1 Vi khuẩn Nhầy, ƣớt nhẵn
2 Xạ khuẩn Bông xốp, khô rắn chắc, xù xì, dạng da, dạng nhung, dạng phấn, nhìn kĩ có dạng sợi nấm nhƣng đƣơng kính sợi bé hơn sợi nấm rất nhiều chi bằng 1 đến 2 phần 10 đƣờng kinh sợi nấm, nếu không có HSKS thì khuẩn lạc có dạng màng dẻo
A B Hình 3.4. Khuẩn lạc của một số VSV A. Khuẩn lạc vi khuẩn B. Khuẩn lạc xạ khuẩn
Sau 3 ngày phát triển khuẩn lạc xạ khuẩn có kích thƣớc khoảng 0.5 – 2.0mm. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn theo tiêu chuẩn sau: có sợi bông, xốp, khô, màu đặc trƣng, nhìn kỹ có dạng sợi nấm, có thể có dạng phóng xạ,
29
có thể có vòng vô khuẩn bao quanh, khuẩn lạc to. Kết quả phân lập trong môi trƣờng thạch trên hộp Petri đƣợc biểu diễn trên hình 3.5.
Hình 3.5. Khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
Qua bảng 3.1 ta thấy phân lập xạ khuẩn từ đất trồng trọt tại Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc thu đƣợc kết quả sau:
Ở độ sâu 5cm, 10cm, 15 cm phân lập đƣợc nhiều chủng xạ khuẩn nhất. Ở độ sâu 5cm phân lập đƣợc 3 chủng X2, X3, X4. Ở độ sâu 10cm phân lập đƣợc 6 chủng X5, X6, X7, X8, X9, X10. Ở độ sâu 15cm phân lập đƣợc 5 chủng X11, X12, X13, X14, X15.
Môi trƣờng Gause I phân lập đƣợc nhiều xạ khuẩn nhất với 14 chủng X1, X2, X3, X5, X6, X8, X9, X11, X12, X13, X14, X16, X18, X20.
Xạ khuẩn là loại VSV hoại sinh, hiếu khí, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trƣởng là 25- 300C, độ ẩm thích hợp từ 40-50%, độ pH trung tính hoặc kiềm nhẹ. Ở độ sâu 5cm, 10 cm, 15cm có những điều kiện tối ƣu về độ ẩm, nhiệt độ, độ pH...cho sự sinh trƣởng và phát triển của xạ khuẩn nên ta phân lập đƣợc nhiều xạ khuẩn ở 3 độ sâu này.
Môi trƣờng Gause I có thành phần môi trƣờng thích hợp nhất với sự phát triển của xạ khuẩn nên khuẩn lạc xạ khuẩn mọc trên môi trƣờng này
30
nhiều hơn 2 môi trƣờng Czapeck và Czapeck- tinh bột, vì thế ta phân lập đƣợc nhiều xạ khuẩn từ môi trƣờng này.
Các chủng xạ khuẩn tuyển chọn có khuẩn lạc dạng tròn, dày, bông, xốp, có màu sắc đa dạng. Phần lồi ra khỏi bề mặt môi trƣờng chính là phần HSKS, phần này có những cuống sinh bào tử nên làm cho khuẩn lạc bông, xốp. Phần bám chặt vào môi trƣờng thạch chính là phần HSCC, phần này rất khó tách ra. Khi sử dụng que cấy để cấy truyền sang môi trƣờng thạch nghiêng thì chỉ lấy đƣợc phần HSKS còn phần HSCC vẫn nằm trong môi trƣờng thạch.
Hình 3.6. Một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
X2 X12 X13 X10 X6 X5 X2 X3 X8 X4 X5 X19 X18 X10
31
Xác định được 20 chủng thuộc nhóm xạ khuẩn chi Streptomyces trong đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc có khả năng phân giải cellulose mạnh.
3.1.1.2. Đặc điểm hệ sợi
Tiến hành nghiên cứu đặc điểm HSKS, HSCC của 20 chủng xạ khuẩn đã phân lập đƣợc (bảng 3.3). Nuôi cấy các chủng này trên môi trƣờng Gause I, sau 3 – 5 ngày đem quan sát. Khuẩn lạc xạ khuẩn dạng tròn, dày, bông, xốp. Phần lồi ra khỏi bề mặt môi trƣờng chính là phần HSKS có những cuống sinh bào tử làm cho khuẩn lạc bông, xốp; phần bám chặt vào môi trƣờng thạch chính là HSCC rất khó tách ra. Khi sử dụng que cấy để cấy truyền khuẩn lạc sang ống thạch nghiêng thì chỉ lấy đƣợc phần HSKS còn phần HSCC vẫn nằm trên môi trƣờng thạch. Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn với hƣớng sinh trƣởng trong môi trƣờng tạo ra HSCC và mặt ngoài môi trƣờng tạo ra HSKS. Màu sắc của HSKS và HSCC rất đa dạng và phong phú: vàng, trắng, xám, đỏ, xanh ... đây là một trong những đặc điểm để tiến hành định loại xạ khuẩn. Từ 20 chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc, chúng tôi nhận thấy màu sắc HSKS rất đa dạng. Có 6 nhóm màu xuất hiện với số lƣợng và tỷ lệ khác nhau, đƣợc thể hiện trên bảng 3.4, hình 3.7.
Từ kết quả trên bảng 3.4 và hình 3.7 cho thấy, nhƣ thƣờng lệ, xạ khuẩn thuộc 2 nhóm trắng và xám vẫn chiếm ƣu thế. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn thuộc nhóm trắng chiếm 25%, tiếp đó là nhóm xám chiếm 20%, các nhóm đỏ, vàng, xanh chiếm 15%, nhóm hồng chiếm 10%. Cũng theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác nhƣ Vi Thị Đoan Chính [4], Đặng Văn Tiến, Nguyễn Đình Tuấn, Ngô Đình Quang Bính (2009), lại nhận thấy xạ khuẩn thuộc nhóm màu trắng chiếm ƣu thế hơn sau đó mới đến nhóm màu xám và các nhóm màu khác. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của một số tác giả nhƣ Nguyễn Minh Nguyệt [16], Nguyễn Thị Thúy Bạch [1], Nguyễn Lân Dũng [6], Lê Gia Hy
32
[14], khi phân lập xạ khuẩn cũng đã nhận thấy nhóm màu xám là chiếm ƣu thế. Nhƣ vậy, theo nhiều kết quả nghiên cứu chƣa thể tìm ra một quy luật chung cho sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu, nhƣng các kết quả nghiên cứu phân lập xạ khuẩn ở nhiều địa điểm khác nhau trong nƣớc đều nhận thấy là xạ khuẩn thuộc hai nhóm màu xám và trắng luôn có tần xuất xuất hiện cao hơn so với các nhóm màu khác.
Bảng 3.3. Đặc điểm khuẩn lạc của 20 chủng xạ khuẩn phân lập từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
STT Chủng xạ khuẩn Màu sắc khuẩn lạc HSKS HSCC 1 X1 Trắng Nâu xám 2 X2 Hồng Hồng nhạt 3 X3 Vàng Vàng nâu 4 X4 Xanh Xanh xám 5 X5 Đỏ Hồng đậm 6 X6 Trắng Vàng ôliu 7 X7 Đỏ Xám 8 X8 Xám Vàng
9 X9 Xanh da trời Xanh đậm 10 X10 Trắng Không có 11 X11 Hồng Đỏ gạch 12 X12 Trắng Vàng 13 X13 Vàng Vàng xám 14 X14 Xám Xám Xanh 15 X15 Đỏ Xanh 16 X16 Xám Vàng xỉn 17 X17 Xám Xám 18 X18 Vàng Vàng xỉn 19 X19 Trắng Xanh 20 X20 Xanh Xanh nhạt
33
Bảng 3.4. Số lƣợng và sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu
Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ các chủng xạ khuẩn phân theo nhóm màu
Việc nghiên cứu sắc tố tan giúp ta thêm cơ sở để phân loại xạ khuẩn. Mỗi loại xạ khuẩn đều có sắc tố tan khác nhau và đặc trƣng cho mỗi loài. Ngoài ra các sắc tố tan còn liên quan tới khả năng sinh kháng sinh, sinh enzyme của xạ
STT Nhóm màu Số lƣợng chủng phân lập Tỷ lệ (%) 1 Trắng (White) 5 25 ±2 2 Xám (Gray) 4 20 ±2 3 Vàng (Yellow) 3 15 ±2 4 Đỏ (Red) 3 15±2 5 Xanh (Blue) 3 15 ±2 6 Hồng (Pink) 2 10 ±2 7 Tổng 20 100
34
khuẩn, nếu các sắc tố tan mạnh chứng tỏ rằng xạ khuẩn sinh trƣởng tốt, từ đó khả năng sinh kháng sinh và enzyme đặc biệt là cellulase sẽ cao. Từ nghiên cứu ta nhận thấy trong các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc có 16 chủng có khả năng hình thành sắc tố tan, còn lại 4 chủng không sinh sắc tố tan đó là: X2 , X12, X19, X20. Kết quả nghiên cứu sắc tố tan đƣợc biểu diễn ở hình 3.8.
Hình 3.8. Sắc tố tan của một số chủng xạ khuẩn phân lập
Sự khác biệt về màu sắc của hệ khuẩn ty có thể do nhiều nguyên nhân
nhƣ: điều kiện tự nhiên (khí hậu, nhiệt độ, độ ẩm), tính chất của đất, chất dinh dƣỡng, pH, ... Chính vì vậy, trƣớc đây màu sắc hệ khuẩn ty xạ khuẩn đƣợc coi là những chỉ tiêu cơ bản để phân loại xạ khuẩn, nhƣng do xạ khuẩn có tính biến dị cao nên đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy thƣờng không ổn định,
X5 X3
35
rất dễ bị thay đổi, trong đó có đặc điểm về màu sắc hệ khuẩn ty. Vì vậy, các đặc điểm về hình thái và tính chất nuôi cấy chỉ đƣợc coi là tiêu chí đầu tiên để phân loại [7].
Căn cứ vào kết quả thu đƣợc chúng tôi đƣa ra một số nhận xét sau: Đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc là môi trƣờng tốt cho xạ khuẩn phát triển, cùng một loại đất ở các độ sâu khác nhau sự phân bố của xạ khuẩn là khác nhau và chƣa thể đƣa ra một quy luật chung nào cho sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu. Nhƣng nhiều nghiên cứu về xạ khuẩn ở các vùng khác nhau trên cả nƣớc đã cho thấy xạ khuẩn thuộc nhóm màu xám và nhóm trắng thƣờng chiếm tỷ lệ cao hơn.
Qua nghiên cứu về đặc điểm của khuẩn lạc và hệ sợi, có thể phân 20 chủng xạ khuẩn phân lập được thành 6 nhóm theo màu sắc của HSKS, cụ thể: nhóm trắng chiếm 25%, nhóm xám chiếm 20%, nhóm đỏ 15%, vàng chiếm 15%, nhóm xanh chiếm 15% và nhóm hồng chiếm 10%.
3.1.2. Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn sinh enzyme cellulase trong đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
Từ các chủng xạ khuẩn phân lập đem đi thử hoạt tính enzyme cellulase trên môi trƣờng chứa 1% CMC và 1% bột giấy. Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 3.5, 3.6, 3.7 và hình 3.9.
Qua bảng 3.5, ta thấy 20 chủng phân lập đƣợc đều có hoạt tính cellulase trên môi trƣờng chứa CMC, nhƣng chủng X3, X5, X11 là có hoạt tính cao nhất mức độ hoạt tính lớn hơn 20 mm.
36
Bảng 3.5. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trƣờng chứa CMC
STT Chủng xạ khuẩn Đƣờng kính lỗ khoan d (mm) Đƣờng kính vòng phân giải D (mm) Hoạt tính D – d (mm) 1 X1 10 21,24 ± 0,57 11,24 ± 0,57 2 X2 10 26,15 ± 0,39 16,15 ± 0,39 3 X3 10 32,10 ± 0,45 22,10 ± 0,45 4 X4 10 25,23 ± 0,91 15,23 ± 0,91 5 X5 10 34,05 ± 0,13 24,05 ± 0,13 6 X6 10 22,87 ± 0,27 12,87 ± 0,27 7 X7 10 23,11 ± 0,34 13,11 ± 0,38 8 X8 10 25,83 ± 0,66 15,83 ± 0,66 9 X9 10 20,40 ± 0,23 10,40 ± 0,23 10 X10 10 20,72 ± 0,12 10,72 ± 0,12 11 X11 10 31,52 ± 0,35 21,52 ± 0,35 12 X12 10 23,36 ± 0,15 13,36 ± 0,15 13 X13 10 27,86 ± 0,63 17,86 ± 0,63 14 X14 10 22,15 ± 0,53 12,15 ± 0,53 15 X15 10 26,13 ± 0,34 16,13 ± 0,34 16 X16 10 23,39 ± 0,31 13,39 ± 0,31 17 X17 10 19,74 ± 0,53 9,74 ± 0,53 18 X18 10 24,12 ± 0,19 14,12 ± 0,19 19 X19 10 19,23 ± 0,58 9,23 ± 0,58 20 X20 10 25,67 ± 0,34 15,67 ± 0,34
37
Bảng 3.6. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trƣờng chứa BG
STT Chủng xạ khuẩn Đƣờng kính lỗ khoan d (mm) Đƣờng kính vòng phân giải D (mm) Hoạt tính D – d (mm) 1 X1 10 20,15 ± 0,21 10,15 ± 0,21 2 X2 10 18,80 ± 0,25 8,80 ± 0,25 3 X3 10 32,47 ± 0,28 22,47 ± 0,28 4 X4 10 22,58 ± 0,17 12,58 ± 0,17 5 X5 10 31,11 ± 0,37 21,11 ± 0,37 6 X6 10 19,95 ± 0,28 9,95 ± 0,28 7 X7 10 22,45 ± 0,49 12,45 ± 0,49 8 X8 10 20,82 ± 0,10 10,82 ± 0,10 9 X9 10 22,89 ± 0,36 12,89 ± 0,36 10 X10 10 21,65 ± 0,28 11,65 ± 0,28 11 X11 10 30,82 ± 0,30 20,82 ± 0,30