Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phân huỷ rơm rạ thành phân hữu cơ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN LÊ THỊ THÙY DUNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY RƠM RẠ THÀNH PHÂN HỮU CƠ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

LÊ THỊ THÙY DUNG

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG

PHÂN HỦY RƠM RẠ THÀNH

PHÂN HỮU CƠ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài này, em nhận được sự giúp đỡ tận tình của thầy cô giáo, gia đình và bạn bè Khi hoàn thành khóa luận em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Phương Phú Công và PGS TS Đinh Thị Kim Nhung người đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận Em xin chân thành cảm ơn tất cả các thầy cô giáo và cán bộ trong tổ Thực vật - Vi sinh, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giúp đỡ em trong thời gian làm khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn trong nhóm vi sinh đã giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Lê Thị Thùy Dung

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài “Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật

có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ” là do tôi thực hiện, không

sao chép lại của ai Tất cả các số liệu đều thu thập từ thực nghiệm, qua xử lí thống kê, không có số liệu sao chép không trùng với kết quả của tác giả nào

đã công bố Trong đề tài tôi có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, tôi xin phép tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận tốt nghiệp của mình

Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Lê Thị Thùy Dung

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

3.1 Phân lập VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 2

3.2 Tuyển chọn tổ hợp VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 2

3.3 Thử nghiệm ủ rơm rạ quy mô PTN với các chủng VSV tuyển chọn 2

4 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài 2

4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

4.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

5 Điểm mới của đề tài 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Hệ vi sinh vật đất 3

1.1.1 Sự phân bố của vi sinh vật trong đất 3

1.1.2 Vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose 4

1.2 Thực trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam 7

1.2.1 Sử dụng rơm để trồng nấm rơm 8

1.2.2 Sử dụng rơm rạ để sản xuất phân hữu cơ vi sinh 9

1.2.3 Một số ứng dụng khác trong sử dụng rơm rạ ở nước ta 9

1.3 Sự phân bố và cấu trúc của cellulose trong tự nhiên 9

1.3.1 Sự phân bố của cellulose trong tự nhiên 9

1.3.2 Cellulose 10

1.3.3 Hemicellulose 11

1.3.4 Lignin 12

1.3.5 Cơ chế chuyển hóa lignocellulose 13

1.4 Các bước của quy trình chế tạo chế phẩm vi sinh phân hủy rác thải hữu cơ 16

1.5 Lịch sử phát triển phân bón vi sinh 17

1.5.1 Trên thế giới 17

1.5.2 Ở Việt Nam 17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Hóa chất, thiết bị 19

2.2.1 Hóa chất 19

2.3 Các loại môi trường nuôi cấy 19

2.3.1 Môi trường phân lập và giữ giống vi khuẩn MPA 19

2.3.2 Môi trường phân lập và giữ giống xạ khuẩn Gauze I 20

2.3.4 Môi trường phân lập và giữ giống nấm mốc Crapeckdox 20

2.3.5 Môi trường phân lập và giữ giống nấm men Hansen 20

2.3.6 Môi trường thử hoạt tính sinh tổng hợp enzyme của các chủng VSV 20

2.4 Phương pháp nghiên cứu 21

2.4.1 Phương pháp vi sinh học 21

2.4.2 Phương pháp toán học trong thống kê và xử lý số liệu 24

2.6 Địa điểm thực hiện đề tài 25

2.7 Thời gian thực hiện đề tài 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Phân lập VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 26

3.1.1 Kết quả lấy mẫu 26

3.1.2 Thí nghiệm với khối ủ mẫu lớn 29

3.1.3 Kết quả phân lập 31

3.2 Tuyển chọn tổ hợp vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 33

3.3 Thử nghiệm ủ rơm rạ quy mô PTN với các chủng VSV tuyển chọn 41

3.3.1 Kết quả kiểm tra tính đối kháng của các chủng VSV tuyển chọn 41

3.3.2 Kết quả xác định hàm lượng giống ban đầu bổ sung vào khối ủ 43

3.3.3 Thử nghiệm ủ rơm rạ quy mô phòng thí nghiệm 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

1 Kết luận 47

2 Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu trúc của phân tử cellulose 11

Hình 3.1 Thí nghiệm ủ mẫu khối lớn 30

Hình 3.2 Biểu đồ biểu diễn sự biến thiên nhiệt độ của U1 và U2 30

Hình 3.3 VSV phân lập trên môi trường thạch đĩa 32

Hình 3.4 Hoạt tính một số VSV tuyển chọn trên MT cơ chất bột giấy 38

Hình 3.5 Hoạt tính một số chủng VSV tuyển chọn trên MT cơ chất CMC 39

Hình 3.6 Hoạt tính một số chủng VSV tuyển chọn trên MT cơ chất xylan, RBBR 39

Hình 3.7 Khuẩn lạc các chủng VSV tuyển chọn trên môi trường thạch đĩa 40

Hình 3.8 Kết quả kiểm tra tính đối kháng của 10 chủng VSV tuyển chọn 42

Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn sự biến thiên nhiệt độ của các đống ủ 44

Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn độ giảm khối lượng của các đống ủ 46

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Môi trường thử hoạt tính 20

Bảng 3.1 Kết quả lấy mẫu 26

Bảng 3.2 Hàm lượng nitơ bổ sung 27

Bảng 3.3 Độ giảm trọng lượng cơ chất, m(g), sau 4 tuần ủ làm giàu ở nhiệt độ phòng 28

Bảng 3.4 Tỉ lệ phối trộn tiến hành thí nghiệm ủ mẫu 29

Bảng 3.5 Kết quả phân lập 32

Bảng 3.6 Theo dõi hoạt tính của các chủng có hoạt tính lignocelluase 34

Bảng 3.7 Hoạt tính enzyme ngoại bào của 10 chủng VSV tuyển chọn 37

Bảng 3.8 Hàm lượng vi khuẩn bổ sung 43

Bảng 3.9 Hàm lượng xạ khuẩn, nấm mốc bổ sung 43

Bảng 3.10 Tỉ lệ phối trộn các thành phần ủ rơm rạ 44

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Hàng năm, tại vùng nông thôn miền Bắc sau thu hoạch lúa sinh ra một lượng rơm rạ khổng lồ Với phế phẩm giàu cellulose này, một lượng rất ít được sử dụng để trồng nấm hay làm thức ăn gia súc, phần lớn được xử lý theo phương pháp truyền thống là đốt trực tiếp trên đồng ruộng, điều này gây ra nhiều hậu quả như góp phần làm ô nhiễm không khí, phá hủy hệ sinh thái đất

và đất ngày càng bạc màu Người dân đốt rơm tại ruộng và ngay cả trên đường, không những gây lãng phí mà còn gây khói bụi, gây ô nhiễm môi trường do khói đốt rơm rạ có tỉ lệ tro bụi cao, các khí CO, CO2, NO2, SO2… gây ảnh hưởng tới sức khỏe của người dân xung quanh Việc đốt rơm rạ trong những ngày nắng nóng còn gây nguy cơ cháy nổ cao và gây nguy cơ tai nạn giao thông khi khói bụi trở nên mù mịt Trong khi đó lượng rơm rạ thải ra sau mỗi vụ thu hoạch rất lớn Trước thực trạng đó, một giải pháp hữu hiệu để xử

lý các phụ phẩm nông nghiệp nhằm tận thu nguồn nguyên liệu này là sử dụng những phế phẩm bỏ đi trong nông nghiệp như rơm rạ để ủ phân hữu cơ Việc này giúp cho bà con nông dân không những tiết kiệm chi phí mua phân hóa học mà còn giúp cải tạo đất, đảm bảo sức khỏe cho người sử dụng và hạn chế tác động xấu đến môi trường Phân hữu cơ có thể đem bón cho đất trước khi gieo trồng làm tăng lượng dinh dưỡng hữu cơ bổ sung cho đất, nâng cao độ phì nhiêu của đất, làm cho đất tơi, xốp, tăng lượng oxy hòa tan trong đất Ngoài ra, phân hữu cơ sau khi ủ có thể tiêu diệt được các nguồn bệnh tàn dư trong nguyên liệu ủ nên không mang tác nhân gây bệnh cho cây trồng

Từ những yêu cầu thực tiễn của ngành nông nghiệp, tôi tiến hành đề tài:

“Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ”

2 Mục tiêu của đề tài

Phân lập, tuyển chọn được tổ hợp vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm

rạ thành phân hữu cơ

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Phân lập VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 3.2 Tuyển chọn tổ hợp VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ

3.3 Thử nghiệm ủ rơm rạ quy mô PTN với các chủng VSV tuyển chọn

4 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Đề tài nhằm phân lập tuyển chọn được các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phân giải lignocellulose Góp một phần nhỏ bổ sung cho các nghiên cứu về chế phẩm vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân bón nói riêng và ứng dụng trong đời sống nói chung phù hợp với điều kiện kinh tế Việt Nam

4.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Tận dụng nguồn nguyên liệu rơm rạ sau mỗi vụ thu hoạch, tuyển chọn được tổ hợp vi sinh vật hữu hiệu để ủ phân hữu cơ góp phần làm giảm lượng rác thải nông nghiệp tránh ô nhiễm môi trường, nâng cao hiệu quả canh tác nông nghiệp

5 Điểm mới của đề tài

Đây là những kết quả nghiên cứu đầu tiên khảo sát sự có mặt của một

số chủng VSV có khả năng sinh enzyme lignocellulase trong đất tại 3 địa điểm: Khu vực đất nông nghiệp huyện Mê Linh (Hà Nội), VQG Ba Vì (Hà Nội), VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hệ vi sinh vật đất

1.1.1 Sự phân bố của vi sinh vật trong đất

Vi sinh vật phân bố ở khắp mọi nơi trên trái đất, nhưng phân bố nhiều nhất là ở trong môi trường đất Sự phân bố của vi sinh vật trong đất còn gọi là

hệ sinh vật đất Bởi vì trong môi trường đất nói chung và trong đất trồng nói riêng cung cấp một nguồn thức ăn phong phú cho vi sinh vật Các chất vô cơ

có trong đất là nguồn thức ăn cho nhóm vi sinh vật tự dưỡng, chúng chuyển hóa các hợp chất này, ví dụ chuyển hóa các hợp chất của S, P, Fe… Các chất hữu cơ là nguồn thức ăn cho vi sinh vật tự dưỡng, ví dụ vi sinh vật phân giải cellulose, vi sinh vật phân giải protein…

Các chất dinh dưỡng phân bố không đồng đều trong đất, cho nên ở các tầng đất khác nhau, sự phân bố của vi sinh vật cũng khác nhau vì nó phụ thuộc vào hàm lượng chất dinh dưỡng Mức độ thoáng khí của đất cũng là một điều kiện ảnh hưởng đến sự phân bố của vi sinh vật Các nhóm hiếu khí phát triển nhiều ở những nơi có nồng độ oxi cao, hàm lượng oxi thấp hơn thường phân bố nhiều loại vi sinh vật kị khí Độ ẩm và nhiệt độ trong đất cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật đất Đại đa số các loài vi khuẩn có ích đều phát triển mạnh mẽ ở độ ẩm từ 60% ÷ 80% Độ ẩm quá thấp hoặc quá cao đều ức chế vi sinh vật Chỉ có nấm mốc và xạ khuẩn là phát triển được ở những điều kiện khô Nếu độ ẩm thấp dưới 20% vi khuẩn phát triển kém nhưng xạ khuẩn lại phát triển mạnh Đất vùng nhiệt đới có độ ẩm 70% ÷ 80% và nhiệt độ 20 ÷ 300C, đó là điều kiện thích hợp với đa số vi sinh vật Bởi vậy trong mỗi gram đất trồng thường có hàng triệu đến hàng tỉ tế bào

vi sinh vật bao gồm nhiều nhóm khác nhau về vị trí phân loại cũng như hoạt tính sinh lý, sinh hóa

Các nhóm vi sinh vật chính trong đất là: Vi khuẩn, vi nấm, vi tảo, động vật nguyên sinh trong đó vi khuẩn là nhóm chiếm nhiều nhất về số lượng Trung bình trong đất vi khuẩn chiếm khoảng 90% tổng số, xạ khuẩn 8%, vi nấm 1% còn lại 1% là tảo và động vật nguyên sinh Tỉ lệ này thay đổi tùy theo loại đất khác nhau cũng như khu vực địa lý khác nhau, tầng đất, thời vụ, chế

độ canh tác… Ở những nơi có đầy đủ chất dinh dưỡng, độ thoáng khí tốt, nhiệt độ, độ ẩm và pH thích hợp thì vi sinh vật phát triển nhiều về số lượng

và thành phần sự phát triển của vi sinh vật lại chính là nhân tố làm cho đất thêm phì nhiêu [3]

1.1.2 Vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose

1.1.2.1 Vi sinh vật phân hủy cellulose

Trong tự nhiên, khu hệ vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose vô

cùng phong phú bao gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn

a) Nấm sợi

Trong rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulase thì nấm sợi thuộc nhóm có khả năng tổng hợp cellulase mạnh nhất Chúng là những vi sinh vật thuộc nhóm hạ đẳng, không có diệp lục, chúng chủ yếu sống hoại sinh ở trong đất và tiết ra môi trường một lượng lớn enzyme chuyển hoá các tàn dư của thực vật thành những chất dinh dưỡng cung cấp cho cây và làm cho đất trở nên màu mỡ hơn [9]

Trong thực tế không có một loại nấm hay vi sinh vật nào có khả năng sinh tổng hợp đầy đủ cả một phức hệ enzyme cần cho quá trình chuyển hoá cellulose đến sản phẩm cuối cùng mà mỗi loài chỉ có thể sinh tổng hợp một

vài loại enzyme Các loại nấm đáng chú ý nhất là: Alternaria tenuis,

Aspergillus wentii, Aspergillus fumigatus, Trichoderma reesei, Fusarium solani, Penicillium pinophinum,, Aspergillus niger [8]

Các nấm ưa nhiệt cũng được chú ý vì chúng có thể tổng hợp các enzyme bền nhiệt hơn, chúng sinh trưởng và phân giải nhanh cellulose nhưng hoạt tính cellulase của dịch lọc lại thấp Nấm có khả năng sinh trưởng và sản xuất cellulase cực đại ở phạm vi pH bằng 3,5 - 6,6 [9]

b) Vi khuẩn

Từ thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã nghiên cứu và nhận thấy một số vi sinh vật kị khí có khả năng phân giải cellulose Những năm đầu thế kỷ XX (1903) G.Van Iterson phân lập được các vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng này Trong các vi khuẩn hiếu khí phân giải cellulose, niêm vi khuẩn chiếm một vị trí quan trọng, chúng thường có hình que nhỏ bé hơi uốn cong, có thành tế bào mỏng, bắt màu thuốc nhuộm kém, chủ yếu ở các giống

Cytophaga, Sporocytophaga và Sorangium Niêm vi khuẩn nhận năng lượng

khi oxy hoá các sản phẩm của sự phân giải cellulose thành CO2 và H2O [9]

Ngoài ra còn thấy các loài thuộc giống Cellvibrio cũng có khả năng

phân huỷ cellulose Trong điều kiện kị khí, các loài ưa ấm hoặc ưa nhiệt thuộc

giống Clostridium và Bacillus tiến hành phân giải cellulose Chúng phát triển

yếu trên môi trường chứa đường đơn Khi phân giải cellulose thành glucose

và xenlobiose, chúng sử dụng các đường này như nguồn năng lượng và nguồn cacbon cũng thường kèm theo việc tạo thành các axit hữu cơ CO2 và H2O

Trong dạ cỏ của các động vật ăn cỏ có một hệ vi sinh vật đặc biệt Chúng có khả năng phân giải cellulose thành các sản phẩm Các vi sinh vật đó

thường là: Ruminococcus albus, Ruminococcus flavofaciens, Butyrivibrio

fibrisolvens, Cillobacterium cellulosolvens, Bacteroides amylophillus, Bacteroides ruminicola, Clostridium perfringens, Clostridium butycium [9]

c) Xạ khuẩn

Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn đặc biệt, tế bào đặc trưng bởi sự phân nhánh, đa số sống trong đất gram dương và hiếu khí Dựa vào đặc điểm về nhiệt độ sinh trưởng, người ta chia xạ khuẩn thành hai dạng:

Xạ khuẩn ưa ấm : phát triển tốt ở nhiệt độ 25 – 300

Hungater phân lập được loài Micromonospora có khả năng thuỷ phân

cellulose Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dưỡng Nhiều nhóm đòi hỏi nguồn dinh dưỡng cao Các môi trường có dịch chiết nấm men, pepton, dịch thuỷ phân cazêin thường thuận lợi cho sinh trưởng Xạ khuẩn thường sinh sản bằng cách đứt đoạn hay phân chia tế bào bình thường Bào tử của xạ khuẩn thường có hình cầu hay hình bầu dục chứa axitdipicolinic, canxi và một số ít magiê là chất quyết định tính kháng nhiệt của chúng Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dưỡng Việc hình thành cuống bào tử diễn ra mạnh hơn khi thêm các nguyên tố vi lượng [9]

Veigia và cộng sự đã phân lập được 36 chủng xạ khuẩn từ bùn ở vịnh Lacoruva (Tây Ban Nha), trong đó có 19 chủng có khả năng tổng hợp cellulose và sinh trưởng tốt trong môi trường chứa 3,5% NaCl Mandels và cộng tác viên nghiên cứu khả năng tổng hợp enzyme cellulase của hai chủng

Streptomyces antibioticus và Streptomyces sp với cơ chất là CMC, nhiệt độ

tối thích là 370C và pH tối thích là 5,9 [9]

1.1.2.2 Vi sinh vật phân hủy hemicellulose

Hemicellulase là enzyme ít người nghiên cứu ngoại trừ xylanase vì xylan là một loại hemicellulose phổ biến trong tự nhiên Các tác giả cho rằng

nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp cả cellulase đồng thời tổng hợp cả

hemicellulase Khả năng này thường thấy ở vi khuẩn dạ cỏ như Bacillus,

Bacteriodes, Butyvibrio và các loại thuộc chi Clostridium

Ngoài vi khuẩn thì nhiều loại nấm sợi cũng có khả năng tổng hợp

xylanase Các loại nấm này bao gồm: Mycothecium verrucaria, Aspergillus

oryzae, A.niger, A.wentti, Aspergillus terreus, T.reesei, Chaetomium trilaterates, Penicilium [11]

1.1.2.3 Vi sinh vật phân hủy lignin

Đối với lignin, là loại có chất khó chuyển hoá nhất thời gian phân huỷ rất chậm kéo dài hàng tháng đến hàng năm Các vi sinh vật phân giải lignin

thường là các loại nấm mục xốp như: Paocylimyces, Allescheria, Pseussis,

Chaetomium, Stachybotrys, Lemzites… Ngoài ra còn có các loại nấm trắng

như: Corrolus versicolor, Polyrus anceps, Phanerochaeter chrysosporium,

Sporotrichum pulverulentum, Aspergillus fumigatus [12]

1.2 Thực trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam

Ở nước ta sản xuất lúa hàng năm đã tạo ra hàng chục triệu tấn rơm rạ Riêng tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long mỗi năm cũng có tới 15 triệu tấn rơm Tuy nhiên, loại phế thải nông nghiệp này thường được nông dân đốt gây lãng phí và làm ô nhiễm môi trường Hiện nay, cùng với việc ứng dụng các tiến bộ khoa học vào sản xuất, nhiều loại máy móc được đưa vào gặt và tuốt lúa Sau khi gặt xong nông dân đã tuốt lúa ngay tại đồng ruộng nên giảm được nhiều công sức trong việc vận chuyển lúa chưa tuốt về nhà tuốt Vì thế, rơm rạ phần lớn để lại ngoài đồng ruộng chỉ một phần nhỏ được nông dân đưa

về nhà để làm thức ăn cho gia súc về mùa đông Phần rơm rạ ngoài đồng lại được người dân đốt thành tro Đây là một việc làm gây hại cho môi trường và ảnh hưởng trực tiếp tới sức khoẻ của người dân Theo các chuyên gia y tế, mù bụi ro đốt rơm rạ (đã từng xảy ra vào tháng 6/2009 tại Hà Nội) gây ô nhiễm

không khí rất có hại đối với sức khỏe con người, nhất là đối với trẻ em, người già và người mắc bệnh đường hô hấp

Việc đốt rơm rạ là điều nên tránh và đã có khuyến nghị bà con sử dụng rơm rạ cho việc trồng nấm rơm, dự trữ làm thức ăn gia súc, ủ gốc trồng màu… Trong trường hợp khó vận chuyển và cất giữ có thể vận động tập thể mua máy đóng bánh rơm của một số xí nghiệp đã khuyến cáo rất có hiệu quả trong việc ép rơm rạ thành bánh giúp cho việc vận chuyển và bảo quản rơm rạ được dễ dàng Từ đó có thể sử dụng rơm rạ cho nhiều mục đích khác Máy ép rơm đã được sản xuất và đưa vào sử dụng ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Thành phố Hồ Chí Minh Việc dùng rơm rạ cho mục đích làm giấy, sản xuất ethanol được áp dụng rất ít ở nước ta

1.2.1 Sử dụng rơm để trồng nấm rơm

Nấm rơm là thực phẩm rất được người dân các nước châu Á ưa chuộng

và được trồng phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở Việt Nam, nấm rơm được trồng trên nhiều loại nguyên liệu khác nhau như lục bình, bã mía, rơm rạ,… Nhưng nguyên liệu phổ biến nhất hiện nay mà người trồng nấm sử dụng vẫn là rơm rạ Các địa phương phía Nam phát triển nấm rơm nhiều nhất là Phú Yên, ở đây đã trồng nấm rơm theo quy trình mới, hiệu quả kinh tế cao của Trung tâm Công nghệ sinh học Việt Nam lần đầu tiên được triển khai đại trà tại huyện Sơn Hòa bước đầu đã được nông dân đón nhận

rơm như: xã Nghĩa Thái, huyện Nghĩa Hưng (Nam Ðịnh), xã Khánh Trung, huyện Yên Khánh (Ninh Bình), với sự hỗ trợ của Trung tâm Công nghệ Sinh học thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam UBND tỉnh Ninh Bình

đã có quyết định số 1297, phê duyệt dự án "Xây dựng trung tâm sản xuất giống và chế biến nấm xuất khẩu Hương Nam…”

1.2.2 Sử dụng rơm rạ để sản xuất phân hữu cơ vi sinh

Hiện nay tại nhiều tỉnh thành trong cả nước đã ứng dụng công nghệ vi sinh phân hủy rơm rạ để làm phân bón Chẳng hạn, tại tỉnh Quảng Nam, người dân đã ứng dụng công nghệ vi sinh phân hủy rơm rạ để làm phân bón ở Hội An Kết quả sử dụng phân hữu cơ vi sinh từ phế phẩm nông nghiệp đã cho thấy cây phát triển tốt hơn so với mẫu đối chứng về mật độ gieo trồng, bộ

lá xanh, mượt, cây cao, chắc khoẻ và đặc biệt là đã hạn chế được nấm bệnh cho cây trồng

Hàng năm, nông dân đổ xuống đồng ruộng lượng lớn phân hoá học, thuốc bảo vệ thực vật làm cho cấu trúc đất bị thay đổi Nếu cứ tiếp tục như vậy, đồng ruộng sẽ mất dần độ phì nhiêu, môi trường ô nhiễm, sức khoẻ con người bị ảnh hưởng Do vậy, việc sử dụng rơm, rạ làm phân bón hữu cơ có ý nghĩa rất lớn về mặt kinh tế, xã hội

1.2.3 Một số ứng dụng khác trong sử dụng rơm rạ ở nước ta

Ngoài dùng rơm rạ trồng nấm rơm, sản xuất phân bón hữu cơ, rơm rạ cũng có thể được sử dụng để làm vật liệu xây dựng, đệm lót, tránh va đập cho các sản phẩm nông nghiệp và gốm sứ… trong quá trình vận chuyển Tại xã

Mỹ Yên, Long Hiệp (huyện Bến Lức, Long An), rơm đang được các chủ vựa thu mua từ những cánh đồng lúa mùa ở các xã Long Khê, Long Định, Phước

Lý, Phước Toàn, Phước Vân… (thuộc các huyện Bến Lức, Cần Đước, Cần Giuộc) để cung cấp cho các vựa dưa, trái cây, xí nghiệp thuỷ tinh, các trang trại nuôi bò, xuất khẩu…

1.3 Sự phân bố và cấu trúc của cellulose trong tự nhiên

1.3.1 Sự phân bố của cellulose trong tự nhiên

Sinh khối thực vật của trái đất ước tính khoảng 1,8.1012

tấn Trong đó cellulose chiếm khoảng 4.1010 tấn Sản lượng cellulose được tổng hợp hàng năm trong tự nhiên lớn hơn bất kỳ chất hữu cơ nào khác

Dưới dạng phế thải, cellulose có trong các phế liệu nông nghiệp chăn nuôi, công nghiệp, đồ hộp, công nghiệp chế biến gỗ, trong chất thải sinh hoạt

từ nhà bếp, đường phố Sự phân bố đa dạng với khối lượng lớn ở khắp nơi của cellulose có trong rác thải là một khó khăn và trở ngại cho việc bảo vệ môi trường, do đó để thu gom và xử lý triệt để lượng chất thải hữu cơ này đòi hỏi phải có những biện pháp và công nghệ phù hợp với từng khu vực, từng vùng [6], [7], [9], [11]

1.3.2 Cellulose

Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật Thông thường, cellulose của tế bào thực vật chiếm 50% tổng số hydratcacbon có trên trái đất của chúng ta Người ta nhận thấy rằng trong thiên nhiên hầu như không gặp cellulose ở dạng tinh khiết mà nó thường tồn tại ở dạng kết hợp với những chất khác như hemicellulose, lignin, pectin các chất này liên kết với nhau tạo nên màng tế bào thực vật và có tên gọi chung là lignocellulose Trong đó, cellulose và hemicellulose chiếm tỉ lệ cao nhất Hai chất này được bao bọc bởi một lượng lignin Các thành phần này thường có tỉ lệ khác nhau trong các loại cây khác nhau tạo ra các đặc tính hoá lý riêng cho từng loại thực vật

Về mặt cấu tạo hoá học, cellulose là một polime mạch thẳng, có thành phần cấu trúc cơ bản là các D-glucopiranose Các gốc này nối với nhau nhờ liên kết β-1,4-glucozit Mức độ polime hoá của phân tử cellulose thay đổi nhiều (từ vài trăm đến 15000) trung bình là 3000

Các đơn phân glucoza trong cellulose thì có cấu trúc dạng ghế bành (hình 1.1) Trong công thức phối cảnh, biểu diễn glucoza số chẵn, quay góc

180o so với glucose số lẻ và các nhóm hydroxyl đều nằm trên mặt phẳng nằm ngang [9], [11]

Hình 1.1 Cấu trúc của phân tử cellulose

Dùng phương pháp phân tích của Rơngen, người ta đã chứng minh được rằng phân tử cellulose có dạng sợi Các sợi này của cellulose lại gắn với nhau nhờ liên kết hydro tạo thành từng bó nhỏ gọi là các microfibrin Microfibrin có cấu trúc không đồng nhất và thường có hai vùng β Vùng kết tinh có cấu trúc trật tự rất cao vì thế nó rất bền vững với tác động bên ngoài Vùng vô định hình có cấu trúc trật tự không chặt do đó kém bền vững hơn

Do có cấu trúc như thế, vùng vô định hình của cellulose có thể hấp thụ nước và trương lên Trong khi đó vùng kết tinh, mạng lưới liên kết hydrogen ngăn cản sự trương này Ở vùng kết tinh, enzyme chỉ tác dụng lên bề mặt các sợi [7]

Cellulose là một hợp chất cao phân tử có cấu trúc rất bền vững Nó không tan trong nước, không được tiêu hoá trong đường tiêu hoá của người và động vật có dạ dày một túi Tuy nhiên, trong dạ dày của động vật nhai lại và trong đất có tồn tại rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh cellulase, là enzyme thuỷ phân cellulose [9]

cellulose Thông thường chúng chỉ có 150 gốc đường Các gốc đường được nối với nhau bằng liên kết β-1.4, β-1.5, β-1.6 glucozit Chúng tạo thành mạch ngắn và phân nhánh

Do đó, so với cellulose thì hemicellulose có cấu trúc không chặt chẽ bằng, chúng dễ dàng bị phân giải khi bị axit loãng tác dụng Đôi khi hemicellulose còn bị phân giải trong nước nóng và chúng dễ dàng bị phân giải bởi enzyme hemicellulase

Hemicellulose tồn tại chủ yếu ở các phần như hạt, bẹ ngô, cám, rơm, rạ, trấu Trong các loại hemicellulose thì xylan là loại có nhiều trong tự nhiên Trong đó nhiều nhất là ở rơm rạ (chiếm hơn 30%), kế đến là cây lá rộng (20 - 30%) ở cây lá kim, xylan ít hơn nhiều (7 - 17%) [7], [8], [11]

1.3.4 Lignin

Lignin là hợp chất cao phân tử ngưng tụ từ ba loại rượu chủ yếu: rượu trans-P-cumarylic, trans-conyferylic và trans-cynapylic Tuy nhiên, tỉ lệ ba loại rượu nói trên trong lignin của các loại thực vật khác nhau không giống nhau Trong lignin các đơn phân này thường liên kết với nhau bằng liên kết C-O và C-C Trong đó kiểu liên kết aryl-glyxecol, aryl-aryl hoặc diaryl ete là phổ biến [7]

Lignin của cây gỗ gồm 8% conyferylic, 14% cumarylic và 6% cynapylic Trong thực vật, lignin tập trung ở các mô hoá gỗ và vai trò như chất liên kết tế bào, do đó mà làm tăng độ bền cơ học, tăng khả năng chống thấm, ngăn chặn các chất độc gây bệnh và các vi sinh vật gây bệnh cũng như các tác dụng khác từ bên ngoài Lignin không hoà tan trong nước, trong các dung môi hữu cơ đậm đặc kể cả axit Chỉ có tác dụng với kiềm bisunfit natri

và axit sunfurơ, lignin mới mới lại bị phân giải từng phần Lignin rất bền đối với tác dụng của các enzyme Do đó trong cây lignin chỉ được tạo ra mà không tham gia vào sự trao đổi chất

Ba cấu tử cellulose, hemicellulose, lignin tạo nên lignocellulose Thành phần lignin, cellulose, hemicellulose trong các loại thực vật có sự khác biệt lớn Điều này quyết định sự khác nhau giữa các loại thực vật về tính chất vật

lý và thành phần hoá học Chính vì thế đòi hỏi phải có biện pháp, tác nhân xử

lý khác nhau đối với các loại thực vật khác nhau [7], [11]

1.3.5 Cơ chế chuyển hóa lignocellulose

Lignocellulose là một tập hợp thành phần phức tạp, có mức độ polime cao, khó tan trong nước, do đó rất khó bị thuỷ phân bởi enzyme Các cấu phần hợp thành nên lignocellulose được liên kết chặt chẽ với nhau và liên kết với các thành phần khác tạo ra một cấu trúc hết sức chặt chẽ

Do thành phần cấu tạo của lignocellulose rất đa dạng và phức tạp nên

để có thể thuỷ phân được chúng một cách triệt để cần phải có một phức hệ enzyme tương ứng Một loại vi sinh vật riêng rẽ không đủ khả năng để có thể sinh tổng hợp một phức hệ enzyme phong phú và đa dạng như vậy Muốn chuyển hoá được lignocellulose cần phải có sự phối hợp của các loại vi sinh vật khác nhau

1.3.5.1 Enzyme và cơ chế thủy phân lignocellulose

a) Enzyme thuỷ phân cellulose: Cellulase

Cellulase ở vi sinh vật và cơ chế tác dụng của chúng gần đây đã được một số tác giả tổng kết khá chi tiết Đây là phức hệ enzyme thuỷ phân cellulose tạo ra các đường đủ nhỏ để đi qua vách tế bào thực vât Nhiều tác giả cho rằng phức hệ enzyme cellulase bao gồm ba enzyme chủ yếu sau:

Exo-β(1,4)-glucanase hay xenlobiohydrolase: Enzyme này phân cắt

chuỗi cellulose từ đầu không khử và giải phóng ra xenlobioza Enzyme này không thuỷ phân cellulose kết tinh cũng như cellulose hoà tan (caboxymetyl cellulose) nhưng có thể thuỷ phân được cellulose đã bị cắt ngắn mạch Có lẽ

vai trò chính của enzyme này là giúp cho enzyme endocellulase tác động lên được cellulose kết tinh

Endoglucanase hay Endocellulase (1,4 β-D-glucano-hydrolaza):

Enzyme này có nhiệm vụ cắt đứt các liên kết ò 1,4-glucozit trong phân tử cellulose một cách ngẫu nhiên để giải phóng ra xenlodextrin, xenlobiose và glucose Enzyme này phân giải mạnh mẽ các cellulose vô định hình nhưng lại tác dụng yếu trên cellulose kết tinh và không phân giải được xenlobiose Chính nhờ sự phân cắt trước của endocellulase, đã tạo ra các đầu không khử làm dễ dàng enzyme xenlobio-hydrolase, do đó mà thuỷ phân được cellulose kết tinh

Enzyme β-1,4-glucozidase hay xenlobiase: Đây là những enzyme rất

đặc hiệu β-glucozidase làm thuỷ phân xenlobiose và các xenlooligo-sacarit mạch ngắn thành glucose Vận tốc chung của phản ứng thuỷ phân cellulose phụ thuộc chặt chẽ vào quá trình hoạt động của xenlobiase Tuy nhiên theo một số tác giả cơ chế thuỷ phân cellulose bởi phức hệ enzyme trên diễn ra theo một trật tự khác nhau

b) Cơ chế thuỷ phân cellulose

Theo Reese và các đồng sự thì C1 là enzyme “tiền tố thuỷ phân” hay là không đặc hiệu Các enzyme này chỉ có tác dụng làm trương cellulose tự nhiên Các cellulose tự nhiên sẽ được chuyển thành các cellulose hoạt động trương nở có mạch ngắn hơn Các chuỗi này sẽ được enzyme Cx tiếp tục phân cắt tạo thành đường tan (xenlobiose) và sau cùng thành glucose [9]

Tuy nhiên Erikson và các đồng sự lại cho rằng: Đầu tiên enzyme endoglucanase tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt các liên kết β-1,4 glucozit và tạo ra các đầu mạch tự do Sau đó exoglucanose sẽ cắt ra tạo thành những đoạn xenlobiose Kết quả tạo thành xenlo-oligosacarit

mạch ngắn, xelobiose, glucose Cuối cùng enzyme xenlobiase thuỷ phân tiếp theo tạo thành glucose

Dựa trên kết quả trên mà Reese đã hiệu chỉnh quan niệm của mình về enzyme C1 và Cx Theo ông thì C1 có tác dụng làm trương nở cellulose kết tinh, phá vỡ liên kết đồng hoá trị tạo ra cellulose biến tính Sau đó enzyme endoglucanase tác động lên chuỗi và tạo ra xenlobiose Ông cho rằng sự thuỷ phân cellulose là kết quả của sự tác động cùng một lúc của cả endoglucanase, enxoglucanase và xenlobiase

Mặc dù có rất nhiều kết quả nghiên cứu về quá trình thuỷ phân cellulose nhưng cho đến này thì cơ chế thuỷ phân cellulose vẫn chưa hoàn toàn thống nhất

1.3.5.2 Enzyme và cơ chế thủy phân hemicellulose

Khi nghiên cứu hemicellulose, người ta nhận thấy có nhiều điểm giống nhau giữa hai thành phần này Chính vì vậy mà nhiều tác giả cho rằng enzyme hemicellulase cũng có nhiều điểm tương đồng với cellulase ví dụ như cơ chế tác động Tuy nhiên, giữa hemicellulase và cellulase vẫn còn nhiều điểm khác biệt:

Hemicellulose có phân tử nhỏ hơn, cấu trúc phân tử đơn giản và kém bền hơn so với cellulose Hemicellulose là cơ chất dễ đồng hoá hơn cellulose

do đó hemicellulase thường được tạo thành sớm hơn trong quá trình nuôi cấy

vi sinh vật

Mặc dù vậy thì quá trình phân giải hemicellulose thường diễn ra song song với quá trình phân giải cellulose [7]

1.3.5.3 Enzyme và cơ chế thủy phân lignin

Có nhiều quan điểm trái ngược nhau về cơ chế phân giải lignin Một số tác giả cho rằng, lignin có tác dụng như một nguồn cảm ứng để tổng hợp ra ligninase Nhưng một số tác giả khác lại cho rằng quá trình phân giải lignin là

một quá trình trao đổi chất thứ cấp Chúng chỉ xảy ra khi môi trường thiếu các

nguồn dinh dưỡng cacbon dễ đồng hoá hoặc thiếu nguồn nitơ Nếu thêm nitơ

vào sẽ làm giảm nhanh quá trình phân giải lignin

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy có khoảng 15 loại enzyme tham

gia vào quá trình thuỷ phân lignin Ligninase không thuỷ phân lignin thành

các tiểu phần hoà tan như phân giải cellulose và hầu hết các polime khác, vì

lignin chứa một số lượng các liên kết có thể bị phân huỷ nhỏ Mặt khác

ligninase lại rất khó hoà tan, chúng sẽ liên kết theo một kiểu nào đó cho phép

tiếp xúc với lignin Quá trình thuỷ phân có thể diễn ra theo điều kiện phản

ứng hoá học sau:

- Cắt oxy hoá mạch bên của đơn vị phenylpropan

- Hình thành nhóm carboxyl thơm

- Tách nhóm methoxyl

- Hydroxyl hoá vòng thơm

1.4 Các bước của quy trình chế tạo chế phẩm vi sinh phân hủy rác thải

hữu cơ

Bước 1: Phân lập vi sinh vật phân hủy rác thải hữu cơ

Bước 2: Chọn chủng, nâng cao hoạt tính các chủng Chọn các chủng theo tiêu

chuẩn sau:

+ Hoạt tính enzyme cao

+ Có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào lớn

+ Có khả năng sinh trưởng, phát triển và sinh sản trên môi trường rác

thải hữu cơ tự nhiên

+ Có khả năng sống và giữ gìn hoạt tính trong chất mang dùng để

chế tạo chế phẩm

Bước 3: Thử nghiệm khả năng kết hợp giữa các chủng VSV

Bước 4: Chế tạo chế phẩm VSV phân hủy rác thải hữu cơ

Bước 5: Thử nghiệm sử dụng chế phẩm [4]

1.5 Lịch sử phát triển phân bón vi sinh

1.5.1 Trên thế giới

Phân bón vi sinh vật (tên thường gọi: phân hữu cơ vi sinh) là sản phẩm được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu hữu cơ khác nhau, nhằm cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng, cải tạo đất, chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống được tuyển chọ với mật độ đạt tiêu chuẩn quy định, góp phần nâng cao năng xuất, chất lượng nông sản Phân hữu cơ vi sinh vật không gây ảnh hưởng xấu đến con người, động vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản

Phân bón vi sinh do Noble Hiltner sản xuất đầu tiên tại Đức năm 1896 và được đặt tên là Nitragin Sau đó phát triển sản xuất tại một số nước khác như ở

Mỹ ( 1896), Canada (1905), Nga (1907), Anh (1910) và Thụy Điển (1914)

Nitragin là một loại phân được chế tạo bởi vi khuẩn Rhizibium do

Beijerink phân lập năm 1888 và được Ferd đặt tên vào năm 1889 dùng để bón cho các loại cây thích hợp họ Đậu Từ đó cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm ứng dụng và mở rộng việc sản xuất các loại phân bón

vi sinh cố đinh nitơ mà thành phần còn được phối hợp thêm một số vi sinh vật

có ích khác như một số xạ khuẩn cố đinh nitơ sống tự do Frankia spp ,

Azotobacter spp , các vi khuẩn cố định nitơ sống tự do Clostridium, Pasterium, Beijerinkia indica, các xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose,

hoặc một số chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các nguồn dự trữ photpho, kali ở dạng khó hòa tan với một số lượng lớn có trong đất mùn, than bùn, trong các quặng apatit, photpho,… chuyển chúng thành dạng dễ hòa tan, cây trồng có thể hấp thụ được

1.5.2 Ở Việt Nam

Phân vi sinh vật cố đinh đạm cây họ đậu và phân vi sinh vật phân giải lân đã được nghiên cứu từ năm 1960 Đến năm 1987, phân Nitragin nền chất mang than bùn mới được hoàn thiện Năm 1991 đã có hơn 10 đơn vị trong cả

nước tập trung nghiên cứu phân vi sinh vật Các nhà khoa học đã phân lập được nhiều chủng vi sinh vật cố định đạm và vi sinh vật phân giải lân [5]

Nhiều loại phân HCVS đã được nghiên cứu sản xuất và được ộ

N ng nghi p và Phát triển n ng th n công nhận là tiến bộ kỹ thuật Theo ước

tính của c r ng trọt, lượng phân HCVS sản xuất trong năm 2008 có trên

100 loại với khoảng 1,2 triệu tấn, bước đầu tham gia vào sản xuất nông nghiệp theo hướng hữu cơ Thị trường cho các sản phẩm dạng này đang dần được mở rộng, trong đó ứng dụng nhiều nhất là các vùng đất cơ giới nhẹ, các vùng trồng rau tập trung như Lâm Đồng, vùng ven Hà Nội và những vùng trồng các loại cây có giá trị kinh tế cao như cà phê, hồ tiêu, thanh long

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi sinh vật phân lập từ khu vực đất nông nghiệp Mê Linh (Hà Nội), VQG Ba Vì (Hà Nội) và VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc)

2.3 Các loại môi trường nuôi cấy

Để phân lập, nuôi cấy và giữ các giống VSV có khả năng sinh tổng hợp enzyme phân hủy lignocellulose tôi sử dụng các loại môi trường sau:

2.3.1 Môi trường phân lập và giữ giống vi khuẩn MPA

2.3.2 Môi trường phân lập và giữ giống xạ khuẩn Gauze I

2.3.6 Môi trường thử hoạt tính sinh tổng hợp enzyme của các chủng VSV

Bảng 2.1 Môi trường thử hoạt tính

Thạch agar : 20g Nước : 1000ml Môi trường bột giấy