Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại hòn chồng nha trang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG ***** ĐIỀN THỊ PHƢƠNG MSSV: 48134256 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME CELLULASE TỪ RONG GIẤY TẠI HÕN CHỒNG – NHA TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: TS. VŨ NGỌC BỘI Nha Trang, năm 2010 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Đồ án này Trƣớc hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng, Phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào đƣợc học tập tại trƣờng trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin đƣợc giành cho thầy: TS. Vũ Ngọc Bội - Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng - Trƣờng Đại học Nha Trang đã tận tình hƣớng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Xin cám ơn: PGS. TS. Ngô Đăng Nghĩa - Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng, ThS. Khúc Thị An - Quyền Trƣởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu đƣợc hoàn thành có chất lƣợng. Đặc biệt xin đƣợc ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng - Trƣờng Đại học Nha Trang, Phòng thí nghiệm CNSH đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, ngƣời thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vƣợt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua. ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ CELLULASE 3 1.1.1. Giới thiệu về cellulose 3 1.1.2. VSV sinh tổng hợp cellulase 5 1.2. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE 6 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME CELLULASE 8 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 8 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc 9 CHƢƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 10 2.1.1. Rong giấy 10 2.1.2. VSV sinh cellulase. 10 2.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật 10 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.2.1. Phƣơng pháp phân lập 11 2.2.2. Phƣơng pháp tuyển chọn chủng VSV sinh cellulase mạnh nhất 13 2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 13 2.2.4. Phƣơng pháp phân loại chủng vi sinh vật 14 2.2.5. Kiểm tra khả năng lên men các loại đƣờng và khả năng sinh hơi 15 2.2.6. Kiểm tra khả năng chịu muối 15 2.2.7. Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân khác 15 2.3. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 16 2.4. DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM 16 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 iii 3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VSV SINH CELLULASE CAO TỪ RONG GIẤY 17 3.2. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG N3 VÀ N4 TUYỂN CHỌN ĐƢỢC 19 3.2.1. Ảnh hƣởng của thời gian 19 3.2.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ 211 3.2.3. Ảnh hƣởng của nồng độ chất cảm ứng 23 3.2.4. Ảnh hƣởng của pH ban đầu 244 3.3. SƠ BỘ PHÂN LOẠI HAI CHỦNG NẤM N3 VÀ N4 266 3.4. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦA N3 VÀ N4 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 34 KẾT LUẬN 34 ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 TIẾNG VIỆT Error! Bookmark not defined. TIẾNG ANH Error! Bookmark not defined. PHỤ LỤC 40 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số VSV sản xuất cellulase 6 Bảng 3.1. Hoạt tính cellulase của một số chủng VSV phân lập 17 Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của 4 chủng đã qua sơ tuyển 18 Bảng 3.3. Khả năng lên men các loại đƣờng của hai chủng N3 và N4 30 Bảng 3.4. Khả năng chịu muối của hai chủng N3 và N4 311 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc không gian của phân tử cellulose 3 Hình 1.2. Cấu trúc phân tử celulose 3 Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase 5 Hình 2.1. Quá trình phân lập vi sinh vật sinh cellulase từ rong giấy 13 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 14 Hình 3.1. Hình ảnh về hai chủng nấm sợi có khả năng sinh cellulase mạnh nhất 19 Hình 3.2. Hoạt tính cellulase của hai chủng N3 và N4 trên CMC 19 Hình 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng N3 20 Hình 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng N4 20 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh cellulase của chủng N3 22 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh cellulase của chủng N4 22 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ chất cảm ứng đến khả năng sinh cellulase của chủng N323 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ chất cảm ứng đến khả năng sinh cellulase của chủng N4233 Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến khả năng sinh cellulase của chủng N3 25 Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến khả năng sinh cellulase của chủng N4 255 Hình 3.11. Hình thái khuẩn lạc của chủng N3 trên đĩa petri 266 Hình 3.12. Hệ sợi nấm N3 ở các độ phóng đại 10X; 40 X 27 Hình 3.13. Hệ sợi nấm N3 ở các độ phóng đại 40 X và 100X 277 Hình 3.14. Hình thái khuẩn lạc chủng N4 trên đĩa petri 277 Hình 3.15. Hệ sợi chủng N4 ở các độ phóng đại 40 X và 100X. 28 Hình 3.16. Cuống đính bào tử của chủng N4 ở độ phóng đại 100X 288 Hình 3.17. Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus theo Samson và cộng sự, (1995) 29 Hình 3.18. Một số hình ảnh về khả năng lên men đƣờng của hai chủng N3 và N4 31 Hình 3.19. Khả năng chịu muối của chủng N3 và N4 ở nồng độ 6% 32 Hình 3.20. Khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân của chủng N3 và N4 32 1 MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme đƣợc sản xuất càng nhiều và đƣợc sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực nhƣ: công nghiệp, chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Các enzyme đang đƣợc sử dụng phổ biến protease, amylase, pectinase, glucooxydase, … Cellulase là một trong số các enzyme đƣợc ứng dụng phổ biến trong công nghệ thực phẩm, công nghiệp dệt, bia - rƣợu, bột giặt, sản xuất phân bón hữu cơ, y tế, xử lý môi trƣờng, Đặc biệt hiện nay cellulase đƣợc toàn thế giới quan tâm nghiên cứu và phát triển nhằm ứng dụng trong công nghệ chế tạo nhiên liệu sinh học. Đây là nguồn nhiên liệu thân thiện với môi trƣờng và có thể giải quyết đƣợc vấn đề thiếu nhiên liệu khi các nguồn nhiên liệu truyền thống đang ngày càng cạn kiệt. Tuy vậy, hiện nay enzyme cellulase đƣợc sử dụng trong các ngành công nghiệp ở Việt Nam chủ yếu đƣợc nhập khẩu từ nƣớc ngoài với giá thành cao. Nƣớc ta là một nƣớc sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme cellulase là rất phong phú. Vì thế, việc nghiên cứu sản xuất ra các enzyme từ vi sinh vật phân lập từ tự nhiên tại Việt Nam hiện nay đang là một đòi hỏi cấp thiết. Việc tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sản xuất enzyme nhất là cellulase từ tự nhiên không những giúp tận dụng các nguồn gen quý hiếm có sẵn từ tự nhiên mà còn góp phần bảo tồn gen, cải tạo các chủng vi sinh vật công nghiệp đã bị thoái hóa giống sau một thời gian sử dụng. Xuất phát từ lý do trên và tình hình nghiên cứu tại Việt nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang” với mục tiêu: thu thập các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phân rong giấy với họat tính cao làm cơ sở cho việc sản xuất enzyme cellulase, ứng dụng trong sản xuất cồn từ rong biển - một hƣớng đang đƣợc toàn thế giới quan tâm. 2 Nội dung của đề tài: 1) Phân lập và tuyển chọn được chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase cao từ rong giấy thu tại Hòn Chồng-Nha Trang; 2) Sơ bộ phân loại các chủng vi sinh vật sinh cellulase cao phân lập được; 3) Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng vi sinh tuyển chọn được. Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo không thể tránh đƣợc các hạn chế. Em rất mong nhận đƣợc các ý kiến góp ý của những ai quan tâm đến vấn đề này, để cho báo cáo thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cám ơn. 3 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ CELLULASE 1.1.1. Giới thiệu về cellulose Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật. Ngoài ra, ngƣời ta còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật (VSV). Ở tế bào thực vật và một số tế bào vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi. Hình 1.1. Cấu trúc không gian của phân tử cellulose Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer mạch thẳng, đƣợc cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose. Các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bằng liên kết α-1,4 glucoside. Các gốc glucose trong cellulose thƣờng lệch nhau một góc 180 o và có dạng nhƣ một chiếc ghế bành. Cellulose thƣờng chứa 10.000-14.000 gốc đƣờng và đƣợc cấu tạo nhƣ hình 1.1 và hình 1.2. Hình 1.2. Cấu trúc phân tử celulose Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy. Ngƣời và hầu hết động vật không có khả năng phân hủy cellulose. Do đó, khi thực vật chết hoặc con ngƣời thải các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trƣờng lƣợng lớn rác thải hữu cơ. Tuy nhiên nhiều chủng VSV bao gồm nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn có khả 4 năng phân hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007). Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân cellulose tạo thành các phân tử đƣờng β-glucose. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, cellulose bị phân hủy dƣới tác dụng hiệp đồng của phức hệ cellulase bao gồm ba enzyme là Exo-β-(1,4)- glucananse hay enzyme C 1 , Endo-β- glucananse hay endocellulase còn gọi là enzyme CMC-ase hay C x và β-(1,4)-glucosidase hay cellobioase: Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydrolase, C1 EC 3.2.1.91) giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC nhƣng tác dụng mạnh lên cellulose vô định hình hoặc cellulose đã bị phân giải một phần. Tác dụng lên cellulose kết tinh không rõ nhƣng khi có mặt endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt. Endo-1,4-glucanase (hay CMC-ase, Cx, EC 3.2.1.4) thủy phân liên kết ß-1,4- glucoside và tác động vào chuỗi cellulose một cách tùy tiện, sản phẩm của quá trình thủy phân là cellobiose và glucose. Do thủy phân CMC hoặc cellulose theo kiểu tùy tiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi cellulose và tăng chậm các nhóm khử, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhƣng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose. ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiose và các cellodextrin khác hòa tan trong nƣớc sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase, còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. Chức năng của ß-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng của cellulase. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thành cellobiose và cuối cùng thành glucose. Sự phân giải cellulose dƣới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo 3 giai đoạn chủ yếu sau: [...]... và cộng sự, 2006) Từ các phân tích ở trên cho thấy hiện ở Vi t Nam chƣa có công trình nào công bố về vi c phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh enzyme celluase từ rong giấy Vì thế vi c Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng- Nha Trang là cần thiết nhằm thu thập các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase có. .. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VSV SINH CELLULASE CAO TỪ RONG GIẤY Để tuyển chọn các chủng VSV có khả năng sinh enzyme cellulase thủy phân cellulose, chúng tôi tiến hành phân lập VSV từ các mẫu rong giấy đã mục thu tại bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang Sử dụng môi trƣờng thạch thƣờng để phân lập vi khuẩn, môi trƣờng Capek để phân lập nấm mốc và môi trƣờng ISP4 để phân lập xạ khuẩn Sơ tuyển VSV bằng phƣơng pháp đặt... VSV có khả năng sinh enzyme cellulase cao là những chủng có khả năng phân giải tốt cơ chất cellulose Vì thế các chủng VSV sinh enzyme cellulase cao thƣờng hiện diện ở những nơi giàu nguồn cellulose nhƣ: rơm rạ mục, lá cây mục, gỗ mục, mùn cƣa mục hay hiện diện trên thân rong Vì thế chúng tôi tiến hành phân lập và tuyển chọn những VSV sinh enzyme cellulase trên rong giấy và tuyển chọn các chủng sinh cellulase. .. phân lập đƣợc 16 chủng VSV có khả năng sản xuất enzyme cellulase, trong đó có 14 chủng VSV có hoạt tính enzyme cellulase cao bao gồm 7 chủng vi khuẩn, 4 chủng nấm mốc và 4 chủng xạ khuẩn Từ những chủng có họat tính cellulase cao, chúng tôi chọn đƣợc bốn chủng VSV có vòng thủy phân cellulose mạnh nhất gồm VK4, N3, N4 và XK4 Tiếp tục xác định hoạt độ enzyme cellulase theo phƣơng pháp Miller để chọn chủng. .. họat tính cellulase, chúng tôi chọn đƣợc hai chủng nấm sợi N3 và N4 là hai chủng phân lập đƣợc từ rong giấy đã ủ mục tại bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang là những chủng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất (hình 3.1 và 3.2) Hai chủng này đƣợc đem bảo quản và phục vụ cho các thí nghiệm về sau 19 Hình 3.1 Hình ảnh về hai chủng nấm sợi có khả năng sinh cellulase mạnh nhất (N3 và N4) đƣợc tuyển chọn Hình 3.2... đề phân lập các chủng vi sinh vật và đánh giá ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase nhƣ: tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp cellulase và tinh sạch, đánh giá tính chất hóa lý của cellulase từ chủng penicillium sp DTQ - HK1 (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007) Nghiên cứu phân loại và xác định hoạt tính cellulase của chủng. .. khả năng sinh cellulase có thể thủy phân rong giấy với họat tính cao làm cơ sở cho vi c sản xuất enzyme cellulase ứng dụng trong sản xuất cồn từ rong biển - một hƣớng đang đƣợc toàn thế giới quan tâm 10 CHƢƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1 Rong giấy: Mẫu rong giấy mục đƣợc lấy từ bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang Rong Giấy có tên khoa học là: Ulva retieulata,... sau: - - Nha Trang các chủng VSV trên môi trƣờng thạch đặc trƣng - (chọn chủng VSV có vòng phân giải CMC lớn nhất là chủng có khả năng sinh cellulase cao nhất) 2.2.1 Phƣơng pháp phân lập Tiến hành phân lập các mẫu rong nhƣ sau: Lấy 10 g rong đã ủ mục cho vào bình tam giác chứa 90 ml nƣớc cất đã vô trùng, lắc đều rồi tiến hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau Pha loãng mẫu theo các nồng độ từ 10-1... thạch thƣờng để phân lập các chủng vi khuẩn, môi trƣờng Capek để phân lập các chủng nấm và môi trƣờng ISP4 để phân lập các chủng xạ khuẩn Các môi trƣờng đƣợc hấp khử trùng rồi phân phối vào các đĩa peptri Dùng pipet man hút 0.1 ml dịch đã pha loãng nhỏ vào đĩa thạch đã ghi tên mẫu, nồng độ và ngày phân lập Dùng que cấy tran trang đều dịch mẫu trên mặt thạch Sau đó cất và nuôi cấy mẫu phân lập ở 370C Sau... cho vi sinh vật Trƣớc khi sử dụng chủng thuần khiết cần đƣợc hoạt hóa 13 Hình 2.1 Quá trình phân lập vi sinh vật sinh cellulase từ rong giấy Lƣu ý: Mọi thao tác trên phải đƣợc thực hiện trong điều kiện vô trùng: Tay và bề mặt tiếp xúc trong tủ cấy đƣợc khử trùng bằng cồn Không khí trong tủ cấy đƣợc khử trùng bằng tia UV Dụng cụ phải đƣợc khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn 2.2.2 Phƣơng pháp tuyển chọn chủng . chƣa có công trình nào công bố về vi c phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh enzyme celluase từ rong giấy. Vì thế vi c Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh. Phân lập và tuyển chọn được chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase cao từ rong giấy thu tại Hòn Chồng-Nha Trang; 2) Sơ bộ phân loại các chủng vi sinh vật sinh cellulase cao phân. chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang với mục tiêu: thu thập các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase có thể