Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang

Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật. Ngoài ra, người ta còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật (VSV).

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Đồ án này Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS. Vũ Ngọc Bội - Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Xin cám ơn: PGS. TS. Ngô Đăng Nghĩa - Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, ThS. Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng. Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, Phòng thí nghiệm CNSH đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua. i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i 11. William MF, Catherine TK, (1990), “Microbial enzymes and biotechnology”. Elsevier Science Publishing CO, INC, p. 1-70 .37 26. John RW (2002), “Handbook of Enzymology”. Marcel Dekker Inc, p. 707-718, 761- 789, 879-915, 993-1018 39 DANH MỤC BẢNG LỜI CẢM ƠN i 11. William MF, Catherine TK, (1990), “Microbial enzymes and biotechnology”. Elsevier Science Publishing CO, INC, p. 1-70 .37 26. John RW (2002), “Handbook of Enzymology”. Marcel Dekker Inc, p. 707-718, 761- 789, 879-915, 993-1018 39 ii DANH MỤC HÌNH LỜI CẢM ƠN i 11. William MF, Catherine TK, (1990), “Microbial enzymes and biotechnology”. Elsevier Science Publishing CO, INC, p. 1-70 .37 26. John RW (2002), “Handbook of Enzymology”. Marcel Dekker Inc, p. 707-718, 761- 789, 879-915, 993-1018 39 iii MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: công nghiệp, chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Các enzyme đang được sử dụng phổ biến protease, amylase, pectinase, glucooxydase, … Cellulase là một trong số các enzyme được ứng dụng phổ biến trong công nghệ thực phẩm, công nghiệp dệt, bia - rượu, bột giặt, sản xuất phân bón hữu cơ, y tế, xử lý môi trường, . Đặc biệt hiện nay cellulase được toàn thế giới quan tâm nghiên cứu và phát triển nhằm ứng dụng trong công nghệ chế tạo nhiên liệu sinh học. Đây là nguồn nhiên liệu thân thiện với môi trường và có thể giải quyết được vấn đề thiếu nhiên liệu khi các nguồn nhiên liệu truyền thống đang ngày càng cạn kiệt. Tuy vậy, hiện nay enzyme cellulase được sử dụng trong các ngành công nghiệp ở Việt Nam chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao. Nước ta là một nước sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme cellulase là rất phong phú. Vì thế, việc nghiên cứu sản xuất ra các enzyme từ vi sinh vật phân lập từ tự nhiên tại Việt Nam hiện nay đang là một đòi hỏi cấp thiết. Việc tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sản xuất enzyme nhất là cellulase từ tự nhiên không những giúp tận dụng các nguồn gen quý hiếm có sẵn từ tự nhiên mà còn góp phần bảo tồn gen, cải tạo các chủng vi sinh vật công nghiệp đã bị thoái hóa giống sau một thời gian sử dụng. Xuất phát từ lý do trên và tình hình nghiên cứu tại Việt nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng- Nha Trang” với mục tiêu: thu thập các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phân rong giấy với họat tính cao làm cơ sở cho việc sản xuất enzyme cellulase, ứng dụng trong sản xuất cồn từ rong biển - một hướng đang được toàn thế giới quan tâm. Nội dung của đề tài: 1 1) Phân lập và tuyển chọn được chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase cao từ rong giấy thu tại Hòn Chồng-Nha Trang; 2) Sơ bộ phân loại các chủng vi sinh vật sinh cellulase cao phân lập được; 3) Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng vi sinh tuyển chọn được. Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo không thể tránh được các hạn chế. Em rất mong nhận được các ý kiến góp ý của những ai quan tâm đến vấn đề này, để cho báo cáo thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cám ơn. 2 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ CELLULASE 1.1.1. Giới thiệu về cellulose Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật. Ngoài ra, người ta còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật (VSV). Ở tế bào thực vật và một số tế bào vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi. Hình 1.1. Cấu trúc không gian của phân tử cellulose Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose. Các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bằng liên kết α-1,4 glucoside. Các gốc glucose trong cellulose thường lệch nhau một góc 180 o và có dạng như một chiếc ghế bành. Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường và được cấu tạo như hình 1.1 và hình 1.2. Hình 1.2. Cấu trúc phân tử celulose Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy. Người và hầu hết động vật không có khả năng phân hủy cellulose. Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ. Tuy nhiên nhiều chủng VSV bao gồm nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn có khả năng phân 3 hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007). Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân cellulose tạo thành các phân tử đường β- glucose. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, cellulose bị phân hủy dưới tác dụng hiệp đồng của phức hệ cellulase bao gồm ba enzyme là Exo-β-(1,4)-glucananse hay enzyme C 1 , Endo-β- glucananse hay endocellulase còn gọi là enzyme CMC-ase hay C x và β-(1,4)-glucosidase hay cellobioase: • Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydrolase, C1 EC 3.2.1.91) giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC nhưng tác dụng mạnh lên cellulose vô định hình hoặc cellulose đã bị phân giải một phần. Tác dụng lên cellulose kết tinh không rõ nhưng khi có mặt endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt. • Endo-1,4-glucanase (hay CMC-ase, Cx, EC 3.2.1.4) thủy phân liên kết ß-1,4- glucoside và tác động vào chuỗi cellulose một cách tùy tiện, sản phẩm của quá trình thủy phân là cellobiose và glucose. Do thủy phân CMC hoặc cellulose theo kiểu tùy tiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi cellulose và tăng chậm các nhóm khử, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose. • ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiose và các cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase, còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. Chức năng của ß-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng của cellulase. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thành cellobiose và cuối cùng thành glucose. Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo 3 giai đoạn chủ yếu sau: 4 Trong giai đoạn thứ nhất, dưới tác dụng của tác nhân C 1 , cellulose bị thủy phân thành cellulose hòa tan. Trong giai đoạn thứ hai, cellulose hòa tan sẽ bị thủy phân dưới tác dụng xúc tác của hệ enzyme C x tạo thành đường cellobiose. Ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzyme ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose. Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm. 1.1.2. VSV sinh tổng hợp cellulase Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi VSV cả trong điều kiện hiếu khí và yếm khí. Các loài VSV thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose. Số lượng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp enzyme có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia quá trình phân giải này. Bảng 1.1 dưới đây là một số loại VSV được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ nhất. 5 Bảng 1.1. Một số VSV sản xuất cellulase Nấm sợi Xạ khuẩn Vi khuẩn Aspergillus niger A.oryzae A.terreus A.syndovii A. flavus Fusarium culmorum Fusarium oxysporum Mucor pusilus Pen. notatum Penicillium spp Trichoderma lignorum Trichoderma reesei Trichoderma viride Trichoderma konongi Actinomyces aureus Act.cellulose Act.diastaticus Act. roseus Act.griseus Act.melamocylas Act.coelicolor Act.candidus Act.chromogenes Act. hygroscopicus Act.griseofulvin Act.ochroleucus Act.thermofulcus Act.xanthostrums Thermonospora curvata Preudomonas Fluorescens B.megaterium B.mensenteroides Clostridium sp. Acetobacter xylinum Vi khuẩn dạ cỏ Ruminoccus albus Ruminobacter parum Bacteroides Amylophillus sp. Clos.butiricum Clos.locheheadil Cellulosemonas 1.2. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE Hiện nay, enzyme cellulase được ứng dụng mạnh mẽ trong các ngành công nghiệp khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất bia rượu, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp dệt, sản xuất bột giặt, sản xuất giấy, trong nông nghiệp . Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật, đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ em. Một số nước đã dùng cellulase để xử lý các loại rau quả như bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo, mỳ… hay xử lý chè 6 và các loại tảo biển… Hay trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, cellulase cùng với hemicellulase được ứng dụng nhằm làm tăng khả năng hấp thu các chất từ thức ăn. Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và quá trình đường hóa. Trong sản xuất agar-agar, sử dụng cellulase xúc tác để xử lý rong thu agar-agar có chất lượng cao hơn so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào. Mặt khác khi sử dụng cellulase để xử lý rong thu agar-agar lại giúp hạn chế ô nhiễm môi trường so với phương pháp sử dụng acid vốn gây ô nhiễm môi trường. Cellulase ứng dụng trong xử lý môi trường: enzyme cellulase đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc phân hủy cellulose có trong chất thải, sự có mặt của enzyme cellulase sẽ giúp cho sự phân hủy cellulose trong tự nhiên dễ dàng và hiệu quả hơn. Hiện nay enzyme cellulase là thành phần quan trọng của chế phẩm sinh học (các chế phẩm EM) trong xử lý ô nhiễm môi trường. Trong nông nghiệp, cellulase được dùng để phân hủy cellulose từ các phế phụ phẩm để sản xuất phân bón hữu cơ thay thế cho các loại phân bón hóa học truyền thống làm giảm ô nhiễm môi trường cũng như sự thoái hóa đất. Trong ngành công nghệ sản xuất bột giặt enzyme cellulase được sử dụng như một tác nhân nhằm làm hoàn thiện cho bột giặt (tẩy sạch vết bẩn, vải rờ mịn tay, sợi vải sáng bóng hơn và không làm hại da tay). Cellulase được ứng dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Sự phá vỡ màng tế bào là một việc đòi hỏi các kỹ thuật công phu và tốn kém. Người ta có thể thu nhận các tế bào trần bằng phương pháp xử lý qua enzyme cellulase. Khi đó ta sẽ thu được tế bào trần của thực vật (protoplast) và tế bào trần nấm men (spheroplast). Chế phẩm cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền. Trong kỹ thuật tạo tế bào trần (protoplas), người ta thường dùng chế phẩm cellulase tinh khiết để phá vỡ thành tế bào thực vật. Ứng dụng cellulase phá vỡ thành tế bào thực vật 7 [...]... một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang là cần thiết nhằm thu thập các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phân rong giấy với họat tính cao làm cơ sở cho vi c sản xuất enzyme cellulase ứng dụng trong sản xuất cồn từ rong biển - một hướng đang được toàn thế giới quan tâm 10 CHƯƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP... cellulase từ chủng penicillium sp DTQ - HK1 (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007) Nghiên cứu phân loại và xác định hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt XKS2 (Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự, 2006) Từ các phân tích ở trên cho thấy hiện ở Vi t Nam chưa có công trình nào công bố về vi c phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh enzyme celluase từ rong giấy Vì thế vi c Phân lập và tuyển chọn một số chủng. .. VSV có khả năng sinh enzyme cellulase cao là những chủng có khả năng phân giải tốt cơ chất cellulose Vì thế các chủng VSV sinh enzyme cellulase cao thường hiện diện ở những nơi giàu nguồn cellulose như: rơm rạ mục, lá cây mục, gỗ mục, mùn cưa mục hay hiện diện trên thân rong Vì thế chúng tôi tiến hành phân lập và tuyển chọn những VSV sinh enzyme cellulase trên rong giấy và tuyển chọn các chủng sinh cellulase. .. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VSV SINH CELLULASE CAO TỪ RONG GIẤY Để tuyển chọn các chủng VSV có khả năng sinh enzyme cellulase thủy phân cellulose, chúng tôi tiến hành phân lập VSV từ các mẫu rong giấy đã mục thu tại bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang Sử dụng môi trường thạch thường để phân lập vi khuẩn, môi trường Capek để phân lập nấm mốc và môi trường ISP 4 để phân lập xạ khuẩn Sơ tuyển VSV bằng phương pháp đặt... đã phân lập được 16 chủng VSV có khả năng sản xuất enzyme cellulase, trong đó có 14 chủng VSV có hoạt tính enzyme cellulase cao bao gồm 7 chủng vi khuẩn, 4 chủng nấm mốc và 4 chủng xạ khuẩn Từ những chủng có họat tính cellulase cao, chúng tôi chọn được bốn chủng VSV có 18 vòng thủy phân cellulose mạnh nhất gồm VK4, N3, N4 và XK4 Tiếp tục xác định hoạt độ enzyme cellulase theo phương pháp Miller để chọn. .. định họat tính cellulase, chúng tôi chọn được hai chủng nấm sợi N3 và N4 là hai chủng phân lập được từ rong giấy đã ủ mục tại bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang là những chủng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất (hình 3.1 và 3.2) Hai chủng này được đem bảo quản và phục vụ cho các thí nghiệm về sau Hình 3.1 Hình ảnh về hai chủng nấm sợi có khả năng sinh cellulase mạnh nhất (N3 và N4) được tuyển chọn ... Khánh và cộng sự, 2003; Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007; Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự, 2006) Những nghiên cứu này chủ yếu đề cập vấn đề phân lập các chủng vi sinh vật và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase như: tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp cellulase và tinh sạch, đánh giá tính chất hóa lý của cellulase. .. khả năng tổng hợp cellulase từ các loại nấm có tính đặc hiệu cao bao gồm phức hệ 3 enzyme: endoglucanase, cellobihydrolase và β-glucosidase thủy phân hoàn toàn cellulose Trong số những nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của vi khuẩn thì Bacillus là chủng có khả năng sản sinh cellulase ngoại bào với số lượng lớn, và được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả đặc biệt là: B.subtilis (Park và cộng sự, 1991),... PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1 Rong giấy: Mẫu rong giấy mục được lấy từ bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang Rong Giấy có tên khoa học là: Ulva retieulata, Thuộc ngành: Chlorophyta, lớp: Chlorophyceae, bộ: Ulvales 2.1.2 VSV sinh cellulase: Bao gồm cả nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn hiện diện trên rong giấy 2.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật * Môi trường phân lập VSV: các loại môi trường sử... lên men các loại đường và khả năng sinh hơi Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cần kiểm tra cấy vào mỗi ống nghiệm có chứa từng loại đường riêng biệt, để tủ ấm 37oC Sau 24 - 72 h lấy ra đọc kết quả: Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng và ngược lại; VSV có khả năng sinh hơi khi có bọt khí trong ống duhaml 2.2.6 Kiểm tra khả năng chịu muối Cấy vi sinh vật lên đĩa peptri chứa