Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang

Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật. Ngoài ra, người ta còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật (VSV).

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Đồ án này

Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua.

Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS Vũ Ngọc Bội Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này.

-Xin cám ơn: PGS TS Ngô Đăng Nghĩa - Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, ThS Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu

để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng.

Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường

- Trường Đại học Nha Trang, Phòng thí nghiệm CNSH đã giúp đỡ nhiệt tình

và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua.

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ CELLULASE 3

1.1.1 Giới thiệu về cellulose 3

1.1.2 VSV sinh tổng hợp cellulase 5

1.2 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE 6

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME CELLULASE 8

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 8

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 9

CHƯƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 10

2.1.1.Rong giấy 10

2.1.2 VSV sinh cellulase 10

2.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 10

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.2.1 Phương pháp phân lập 11

2.2.2 Phương pháp tuyển chọn chủng VSV sinh cellulase mạnh nhất 13

2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 13

2.2.4 Phương pháp phân loại chủng vi sinh vật 14

2.2.5 Kiểm tra khả năng lên men các loại đường và khả năng sinh hơi 15

2.2.6 Kiểm tra khả năng chịu muối 15

2.2.7 Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân khác 15

2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 16

2.4 DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM 16

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VSV SINH CELLULASE

CAO TỪ RONG GIẤY 17

3.2 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG N3 VÀ N4 TUYỂN CHỌN ĐƯỢC 19

3.2.1 Ảnh hưởng của thời gian 19

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 21 3.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng 23

3.2.4 Ảnh hưởng của pH ban đầu 24 3.3 SƠ BỘ PHÂN LOẠI HAI CHỦNG NẤM N3 VÀ N4 26 3.4 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦA N3 VÀ N4 30

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 34

KẾT LUẬN 34

ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

TIẾNG VIỆT 36

TIẾNG ANH 37

PHỤ LỤC 40

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số VSV sản xuất cellulase 6

Bảng 3.1 Hoạt tính cellulase của một số chủng VSV phân lập 17

Bảng 3.2 Hoạt tính cellulase của 4 chủng đã qua sơ tuyển 18

Bảng 3.3 Khả năng lên men các loại đường của hai chủng N3 và N4 30

Bảng 3.4 Khả năng chịu muối của hai chủng N3 và N4 31

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc không gian của phân tử cellulose 3

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử celulose 3

Hình 1.3 Cơ chế tác dụng của cellulase 5

Hình 2.1 Quá trình phân lập vi sinh vật sinh cellulase từ rong giấy 13

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 14

Hình 3.1 Hình ảnh về hai chủng nấm sợi có khả năng sinh cellulase mạnh nhất .19

Hình 3.2 Hoạt tính cellulase của hai chủng N3 và N4 trên CMC 19

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng N3 20

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng N4 20

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh cellulase của chủng N3 22

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh cellulase của chủng N4 22

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng đến khả năng sinh cellulase của chủng N3 23

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng đến khả năng sinh cellulase của chủng N4 23

Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh cellulase của chủng N3 25

Hình 3.10 Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh cellulase của chủng N4 25

Hình 3.11 Hình thái khuẩn lạc của chủng N3 trên đĩa petri 26

Hình 3.12 Hệ sợi nấm N3 ở các độ phóng đại 10X; 40 X 27

Hình 3.13 Hệ sợi nấm N3 ở các độ phóng đại 40 X và 100X 27

Hình 3.14 Hình thái khuẩn lạc chủng N4 trên đĩa petri 27

Hình 3.15 Hệ sợi chủng N4 ở các độ phóng đại 40 X và 100X 28

Hình 3.16 Cuống đính bào tử của chủng N4 ở độ phóng đại 100X 28

Hình 3.17 Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus theo Samson và cộng sự, (1995) 29

Hình 3.18 Một số hình ảnh về khả năng lên men đường của hai chủng N3 và N4 31

Hình 3.19 Khả năng chịu muối của chủng N3 và N4 ở nồng độ 6% 32

Hình 3.20 Khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân của chủng N3 và N4 32

MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chếphẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong cáclĩnh vực như: công nghiệp, chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế…Các enzyme đang được sử dụng phổ biến protease, amylase, pectinase,glucooxydase, …

Cellulase là một trong số các enzyme được ứng dụng phổ biến trong côngnghệ thực phẩm, công nghiệp dệt, bia - rượu, bột giặt, sản xuất phân bón hữu cơ, y

tế, xử lý môi trường, Đặc biệt hiện nay cellulase được toàn thế giới quan tâmnghiên cứu và phát triển nhằm ứng dụng trong công nghệ chế tạo nhiên liệu sinhhọc Đây là nguồn nhiên liệu thân thiện với môi trường và có thể giải quyết đượcvấn đề thiếu nhiên liệu khi các nguồn nhiên liệu truyền thống đang ngày càng cạnkiệt

Tuy vậy, hiện nay enzyme cellulase được sử dụng trong các ngành côngnghiệp ở Việt Nam chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao.Nước ta là một nước sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản

enzyme từ vi sinh vật phân lập từ tự nhiên tại Việt Nam hiện nay đang là một đòihỏi cấp thiết Việc tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sản xuất enzyme nhất làcellulase từ tự nhiên không những giúp tận dụng các nguồn gen quý hiếm có sẵn từ

tự nhiên mà còn góp phần bảo tồn gen, cải tạo các chủng vi sinh vật công nghiệp

đã bị thoái hóa giống sau một thời gian sử dụng Xuất phát từ lý do trên và tình

hình nghiên cứu tại Việt nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập

và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang” với mục tiêu: thu thập các chủng vi sinh vật chịu

mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phân rong giấy với họat tính cao làm cơ

sở cho việc sản xuất enzyme cellulase, ứng dụng trong sản xuất cồn từ rong biển một hướng đang được toàn thế giới quan tâm

-Nội dung của đề tài:

1) Phân lập và tuyển chọn được chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase cao từ rong giấy thu tại Hòn Chồng-Nha Trang;

2) Sơ bộ phân loại các chủng vi sinh vật sinh cellulase cao phân lập được; 3) Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng vi sinh tuyển chọn được.

Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo không thể tránh được các hạn chế

Em rất mong nhận được các ý kiến góp ý của những ai quan tâm đến vấn đề này, đểcho báo cáo thêm hoàn thiện Em xin chân thành cám ơn

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CELLULASE

1.1.1 Giới thiệu về cellulose

Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật Ngoài ra, người ta còn thấy chúng

có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật (VSV) Ở tế bào thực vật và một số tế bào

vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi

Hình 1.1 Cấu trúc không gian của phân tử cellulose

Cellulose không có trong tế bào động vật Chúng là một homopolimer mạchthẳng, được cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose Các thành phần này liên kết vớinhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bằng liên kết α-1,4

dạng như một chiếc ghế bành Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường vàđược cấu tạo như hình 1.1 và hình 1.2

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử celulose

Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy Người và hầu hết động vật không cókhả năng phân hủy cellulose Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sảnphẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thảihữu cơ Tuy nhiên nhiều chủng VSV bao gồm nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn có khả

năng phân hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase(Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007)

Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân cellulose tạo thành các phân tử đườngβ-glucose Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, cellulose bị phân hủy dướitác dụng hiệp đồng của phức hệ cellulase bao gồm ba enzyme là Exo-β-(1,4)-glucananse hay enzyme C1, Endo-β- glucananse hay endocellulase còn gọi là

Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydrolase, C1 EC 3.2.1.91) giải phóngcellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMCnhưng tác dụng mạnh lên cellulose vô định hình hoặc cellulose đã bị phân giải mộtphần Tác dụng lên cellulose kết tinh không rõ nhưng khi có mặt endoglucanase thì

có tác dụng hiệp đồng rõ rệt

ß-1,4-glucoside và tác động vào chuỗi cellulose một cách tùy tiện, sản phẩm của quá trìnhthủy phân là cellobiose và glucose Do thủy phân CMC hoặc cellulose theo kiểu tùytiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi cellulose và tăng chậmcác nhóm khử, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin Enzyme này hoạt độngmạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose

cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase,còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên Chứcnăng của ß-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng củacellulase

Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase

Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thànhcellobiose và cuối cùng thành glucose

Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo 3giai đoạn chủ yếu sau:

Trong giai đoạn thứ nhất, dưới tác dụng của tác nhân C1, cellulose bị thủy phânthành cellulose hòa tan Trong giai đoạn thứ hai, cellulose hòa tan sẽ bị thủy phân

Ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzyme ß-1,4-glucosidase (haycellobiase, EC 3.2.1.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose

Hình 1.3 Cơ chế tác dụng của cellulase

Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tựnhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên cóloài phát triển rất mạnh, có loài phát triển yếu Chính vì thế, việc phân hủy cellulosetrong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm

1.1.2 VSV sinh tổng hợp cellulase

Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi VSV cả trong điều kiệnhiếu khí và yếm khí Các loài VSV thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sảnphẩm cuối cùng là glucose Số lượng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp enzyme

có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn

và trong một số trường hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham giaquá trình phân giải này Bảng 1.1 dưới đây là một số loại VSV được các nhà khoahọc nghiên cứu kỹ nhất

Act.diastaticus Act roseus Act.griseus Act.melamocylas Act.coelicolor Act.candidus Act.chromogenes Act hygroscopicus Act.griseofulvin Act.ochroleucus Act.thermofulcus Act.xanthostrums Thermonospora curvata

Preudomonas Fluorescens B.megaterium B.mensenteroides Clostridium sp.

Acetobacter xylinum

Vi khuẩn dạ cỏ Ruminoccus albus Ruminobacter parum Bacteroides

Amylophillus sp.

Clos.butiricum Clos.locheheadil Cellulosemonas

1.2 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE

Hiện nay, enzyme cellulase được ứng dụng mạnh mẽ trong các ngành côngnghiệp khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất bia rượu,công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp dệt, sản xuất bột giặt, sản xuấtgiấy, trong nông nghiệp

Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là tăng độ hấpthu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật, đặc biệt

là đối với thức ăn cho trẻ em Một số nước đã dùng cellulase để xử lý các loại rauquả như bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo, mỳ… hay xử lýchè và các loại tảo biển… Hay trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, cellulase

cùng với hemicellulase được ứng dụng nhằm làm tăng khả năng hấp thu các chất từthức ăn.

Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó cócellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác độngcủa protease và quá trình đường hóa

Trong sản xuất agar, sử dụng cellulase xúc tác để xử lý rong thu agar có chất lượng cao hơn so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào.Mặt khác khi sử dụng cellulase để xử lý rong thu agar-agar lại giúp hạn chế ô nhiễmmôi trường so với phương pháp sử dụng acid vốn gây ô nhiễm môi trường

agar-Cellulase ứng dụng trong xử lý môi trường: enzyme cellulase đóng một vai trò

vô cùng quan trọng trong việc phân hủy cellulose có trong chất thải, sự có mặt củaenzyme cellulase sẽ giúp cho sự phân hủy cellulose trong tự nhiên dễ dàng và hiệuquả hơn Hiện nay enzyme cellulase là thành phần quan trọng của chế phẩm sinhhọc (các chế phẩm EM) trong xử lý ô nhiễm môi trường

Trong nông nghiệp, cellulase được dùng để phân hủy cellulose từ các phế phụphẩm để sản xuất phân bón hữu cơ thay thế cho các loại phân bón hóa học truyềnthống làm giảm ô nhiễm môi trường cũng như sự thoái hóa đất

Trong ngành công nghệ sản xuất bột giặt enzyme cellulase được sử dụng nhưmột tác nhân nhằm làm hoàn thiện cho bột giặt (tẩy sạch vết bẩn, vải rờ mịn tay, sợivải sáng bóng hơn và không làm hại da tay)

Cellulase được ứng dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Sự phá vỡ màng

tế bào là một việc đòi hỏi các kỹ thuật công phu và tốn kém Người ta có thể thunhận các tế bào trần bằng phương pháp xử lý qua enzyme cellulase Khi đó ta sẽ thuđược tế bào trần của thực vật (protoplast) và tế bào trần nấm men (spheroplast).Chế phẩm cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền Trong

kỹ thuật tạo tế bào trần (protoplas), người ta thường dùng chế phẩm cellulase tinh

khiết để phá vỡ thành tế bào thực vật Ứng dụng cellulase phá vỡ thành tế bào thựcvật không làm tổn thương các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn cácnhân tố di truyền

Ngoài ra, việc sản xuất enzyme cellulase có hoạt độ cao để phân hủy cellulosethành các nguồn nhiên liệu sinh học đang được quan tâm đặc biệt trong ngành côngnghiệp năng lượng sạch của toàn thế giới.

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME CELLULASE

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Nghiên cứu và ứng dụng của cellulase bắt đầu từ những năm 1950 Cuối thế

kỷ XIX đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulase từ cácloại vi sinh vật Một số nghiên cứu về cellulase từ nấm của một sồ tác giả như :

Trichoderma reseii (Ogawa và cộng sự, 1991), Aspergillus sp (Lusta và cộng sự,

1999), Schizophillum commune (Wilick & Seligy, 1985), Fusarium lini, Penicillium

funiculosum (Fogarty & Kelly, 1990) Năm 2000, Mawadza và cộng sự đã nghiên

cứu về khả năng tổng hợp cellulase từ các loại nấm có tính đặc hiệu cao bao gồmphức hệ 3 enzyme: endoglucanase, cellobihydrolase và β-glucosidase thủy phânhoàn toàn cellulose

Trong số những nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của vi khuẩn thì

Bacillus là chủng có khả năng sản sinh cellulase ngoại bào với số lượng lớn, và

được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả đặc biệt là: B.subtilis (Park và cộng sự, 1991), B.polymxa, B.cereus (Robson & Chambliss, 1989), B.pumilus (Christakopoulos và cộng sự, 1999), Bacillus sp KMS-330 (Ozaki & Ito, 1991) và

KMS-635 (Ito và cộng sự, 1989)

Do cellulase có nhiều ứng dụng, cho nên rất nhiều nghiên cứu về enzymecellulase như: nghiên cứu về các tính chất hóa lý của chúng như xác định khốilượng phân tử của Macarrón và cộng sự (1993); Sang và cộng sự (1995);Henriksson và cộng sự (1999); Karisson và cộng sự (2001); Coral và cộng sự(2002); Hiroshi và cộng sự (2005), xác định nhiệt độ tối ưu của Isabel và cộng sự(1992); Macarrón và cộng sự (1993); Coral và cộng sự (2002), xác định pH tối ưu(Macarrón và cộng sự, 1993; Coral và cộng sự, 2002), xác định ảnh hưởng của ionkim loại (Sang và cộng sự, 1995)

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong những năm gần đây ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về vi sinh vậtphân hủy cellulose và cellulase (Đặng Minh Hằng, 1999; Hoàng Quốc Khánh vàcộng sự, 2003; Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007; Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự,2006) Những nghiên cứu này chủ yếu đề cập vấn đề phân lập các chủng vi sinh vật

và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợpcellulase như: tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khảnăng sinh tổng hợp cellulase và tinh sạch, đánh giá tính chất hóa lý của cellulase từ

chủng penicillium sp DTQ - HK1 (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007) Nghiên cứu

phân loại và xác định hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt XKS2

(Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự, 2006)

Từ các phân tích ở trên cho thấy hiện ở Việt Nam chưa có công trình nào công

bố về việc phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh enzyme celluase từ rong

giấy Vì thế việc “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng

sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang” là cần thiết nhằm

thu thập các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phânrong giấy với họat tính cao làm cơ sở cho việc sản xuất enzyme cellulase ứng dụngtrong sản xuất cồn từ rong biển - một hướng đang được toàn thế giới quan tâm

CHƯƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Rong giấy:

Mẫu rong giấy mục được lấy từ bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang Rong Giấy

có tên khoa học là: Ulva retieulata, Thuộc ngành: Chlorophyta, lớp:

Chlorophyceae, bộ: Ulvales.

2.1.2 VSV sinh cellulase:

Bao gồm cả nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn hiện diện trên rong giấy

2.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

* Môi trường phân lập VSV: các loại môi trường sử dụng: thạch thường,

lactose) đều của Merck - Đức cung cấp

* Môi trường ISP - 4 (g/l):

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VSV có khả năng sinh enzyme cellulase cao là những chủng có khả năng phângiải tốt cơ chất cellulose Vì thế các chủng VSV sinh enzyme cellulase cao thườnghiện diện ở những nơi giàu nguồn cellulose như: rơm rạ mục, lá cây mục, gỗ mục,mùn cưa mục hay hiện diện trên thân rong… Vì thế chúng tôi tiến hành phân lập vàtuyển chọn những VSV sinh enzyme cellulase trên rong giấy và tuyển chọn cácchủng sinh cellulase cao theo các bước sau:

- Thu rong giấy đã ủ mục tại bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang

- Phân lập và tuyển chọn các chủng VSV trên môi trường thạch đặc trưng(chọn chủng VSV có vòng phân giải CMC lớn nhất là chủng có khả năng sinhcellulase cao nhất)

- Sơ bộ phân loại các chủng VSV được tuyển chọn bằng phương pháp truyềnthống

- Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase củachủng VSV được tuyển chọn

2.2.1 Phương pháp phân lập

Tiến hành phân lập các mẫu rong như sau:

Lấy 10 g rong đã ủ mục cho vào bình tam giác chứa 90 ml nước cất đã vôtrùng, lắc đều rồi tiến hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau Pha loãng mẫu theo

nghiệm thứ nhất chứa 90 ml nước cất, lắc đều rồi lại lấy 1 ml cho vào ống nghiệmthứ hai, cứ làm như vậy cho đến khi được nồng độ thí nghiệm (để có số khuẩn lạc

trên đĩa phù hợp, mẫu thường được pha loãng Do hiếm khi biết trước được nồng độVSV trong mẫu, người ta dùng nhiều nồng độ khác nhau) Tùy vào số lượng VSVnhiều hay ít mà ta cho nồng độ cấy thích hợp (thường từ 10-3 – 10-8).

Dùng môi trường thạch thường để phân lập các chủng vi khuẩn, môi trường

khuẩn Các môi trường được hấp khử trùng rồi phân phối vào các đĩa peptri Dùngpipet man hút 0.1 ml dịch đã pha loãng nhỏ vào đĩa thạch đã ghi tên mẫu, nồng độ

và ngày phân lập Dùng que cấy tran trang đều dịch mẫu trên mặt thạch Sau đó cất

thạch tiến hành quan sát, tách và thuần khiết khuẩn lạc đối với vi khuẩn Sau 2 - 3ngày đối với nấm và 5 - 7 ngày đối với xạ khuẩn

+ Đối với vi khuẩn: bề mặt nhẵn, ướt, khi dùng que gạt không còn lại trongthạch

+ Đối với xạ khuẩn: bề mặt khô xù xì, có hình tròn

+ Đối với nấm: có hệ sợi

Tách và thuần khiết khuẩn lạc: Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa peptricấy rồi cấy vào ống nghiệm, mỗi khuẩn lạc cấy vào một ống (ghi kí hiệu đầy đủ để

thích hợp cấy ziczac ra đĩa petri để tinh sạch các chủng VSV, tiến hành tinh sạchnhiều lần Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy, kiểm tra

độ thuần chủng của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào dưới kính hiển vi Khi đượckhuẩn lạc thuần nhất và tách rời trên đĩa thạch thì cấy vào ống nghiệm giữ giống(hình 2.1)

Phương pháp giữ giống và cấy chuyền: Sau khi tinh sạch xong ta chọn khuẩnlạc mọc riêng rẽ cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng Tiến hành cấy ziczac trên ốngthạch nghiêng để được giống thuần khiết Giống thuần khiết được bảo quản trong tủ

định kì để đảm bảo dinh dưỡng cho vi sinh vật Trước khi sử dụng chủng thuầnkhiết cần được hoạt hóa

Hình 2.1 Quá trình phân lập vi sinh vật sinh cellulase từ rong giấy

Lưu ý: Mọi thao tác trên phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng:

2.2.2 Phương pháp tuyển chọn chủng VSV sinh cellulase mạnh nhất

VSV được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng, trong môi trườngdịch thể Sau 24 h đối với vi khuẩn, 36 - 48 h đối với nấm và 72 h đồi với xạ khuẩntiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút hoặc lọc thudịch enzyme rồi đem xác định hoạt tính cellulase theo phương pháp Miller (phụ lục02), (Miller, 1959)

2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp

* Phương pháp xác định thời gian nuôi cấy thích hợp

Nấm mốc được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở các khoảng thời gian: 6; 12; 18;24;30; 36; 42; 48; 54 và 60 h Sau đó lọc thu sinh khối và xác định hoạt độ enzyme

* Phương pháp xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp

Nấm mốc được nuôi cấy trên môi trường bán rắn ở các nhiệt độ: 25; 30; 35;

bi rồi cho vào đó một lượng nước gấp 4 - 5 lần khối lượng canh trường để hòa tan

protein-enzyme từ khối canh trường nấm sợi Sau đó đem xác định hoạt độ enzymecellulase bằng phương pháp đổ dịch.

* Phương pháp xác định nồng độ chất cảm ứng thích hợp

Nấm mốc được nuôi cấy lỏng lắc 200 vòng/phút trong môi trường có chứanồng độ chất cảm ứng (rơm và rong) ở các nồng độ từ 1% - 8% Sau 36 - 48 h thudịch lọc và xác định hoạt tính enzyme cellulase

* Phương pháp xác định pH môi trường nuôi cấy thích hợp

Nấm mốc được nuôi cấy lỏng lắc 200 vòng/phút trong môi trường có pH là :3,4,5,6,7,8 ở nhiệt độ phòng Sau 36 - 48 h đem xác định hoạt tính enzyme

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 2.2.4 Phương pháp phân loại chủng VSV (phân loại theo phương pháp truyền thống)

Phân loại theo phương pháp truyền thống là phương pháp phân loại chủngVSV dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Dựa vào đó người ta phân

loại chúng và các chi Đối với nấm sợi chúng tôi tiến hành phân loại bằng phươngpháp quan sát đặc điểm hình thái đặc trưng trên kính hiển vi.

Nguyên lý:

Nấm thường được nhận diện bằng các đặc điểm hình thái đặc trưng quan sátđược dưới kính hiển vi Tế bào nấm thường phát triển thành hệ sợi gọi là khuẩn tythể Sợi nấm có thể có hay không có vách ngăn Khuẩn ty mọc lên trên bề mặt cơchất thường là những cấu trúc mang bào tử Cuống mang bào tử có thể phân nhánhhay không phân nhánh Bào tử vô tính của nấm sợi thường tập trung trong hai nhóm

là bào tử kín và bào tử trần

- Quan sát hình thái khuẩn lạc, màu sắc sợi nấm trên đĩa petri.

- Lấy một miếng băng dính trong suốt, đặt mặt dính nhẹ lên khuẩn lạc nấm,

sau đó lấy ra và áp sát vào phiến kính sao cho băng dính dính chặt vào phiến kính

- Quan sát phiến kính dưới kính hiển vi.

2.2.5 Kiểm tra khả năng lên men các loại đường và khả năng sinh hơi

Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cần kiểm tra cấy vào mỗi ống nghiệm có

Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng và ngượclại; VSV có khả năng sinh hơi khi có bọt khí trong ống duhaml

2.2.6 Kiểm tra khả năng chịu muối

Cấy vi sinh vật lên đĩa peptri chứa môi trường đặc trưng với các nồng độ muối

VSV mọc được ta kết luận chúng có khả năng chịu muối và ngược lại

2.2.7 Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân khác (protease và amylase)

Nấm sợi được nuôi cấy trên môi trường capek lỏng, lắc 200 vòng/phút, sau 36– 48 h tiến hành thu dich lọc và xác định hoạt tính các enzyme theo phương phápkhuếch tán trên môi trường thạch chứa cơ chất đặc trưng (casein với protease và

tinh bột với amylase) Để tủ ấm 370C trong 24 h rồi đổ lugol và xác định hoạt tínhenzyme bằng cách đo vòng thủy phân

2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

Xử lý số liệu nghiên cứu theo phương pháp thống kê sinh học Mỗi thí nghiệmđều tiến hành 3 lần, mỗi lần 3 mẫu và kết quả là trung bình cộng của các lần thínghiệm

Số liệu được xử lý được vẽ trên phần mềm Ecxel với hệ số tương quan R ≥ 0,95

2.4 DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM

Sử dụng các thiết bị hiện đại có tại phòng thí nghiệm CNSH: thiết bị ly tâm(Eppendorf Centrifuge 5417R - Mỹ), máy vortex (máy trộn mẫu BE34), tủ lạnh(NANO Silver, Việt Nam), kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính (Motic

BA 300 - Mỹ), máy lắc (GFL 3005 - Đức), tủ cấy (Telstar AV 100 - Tây Ban Nha),

tủ sấy (Binder - Đức), tủ ấm Memmert - Đức,

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VSV SINH CELLULASE CAO TỪ RONG GIẤY

Để tuyển chọn các chủng VSV có khả năng sinh enzyme cellulase thủy phâncellulose, chúng tôi tiến hành phân lập VSV từ các mẫu rong giấy đã mục thu tại bãibiển Hòn Chồng - Nha Trang Sử dụng môi trường thạch thường để phân lập vi

khuẩn Sơ tuyển VSV bằng phương pháp đặt thỏi thạch trên môi trường CMC vàxác định hoạt tính enzyme cellulase bằng cách đo vòng thủy phân trên CMC Kếtquả phân lập thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Hoạt tính cellulase của một số chủng VSV phân lập

Từ những chủng có họat tính cellulase cao, chúng tôi chọn được bốn chủng VSV

có vòng thủy phân cellulose mạnh nhất gồm VK4, N3, N4 và XK4 Tiếp tục xác địnhhoạt độ enzyme cellulase theo phương pháp Miller để chọn chủng có hoạt tínhcellulase cao nhất Kết quả xác định hoạt tính cellulase được thể hiện như sau (bảng3.2)

Bảng 3.2 Hoạt tính cellulase của 4 chủng đã qua sơ tuyển

Ghi chú: x coi như không có hoạt tính (lượng dịch enzyme không đủ làm

chuyển màu của methylene xanh (phụ lục 02))

Qua bảng kết quả xác định họat tính cellulase, chúng tôi chọn được hai chủngnấm sợi N3 và N4 là hai chủng phân lập được từ rong giấy đã ủ mục tại bãi biểnHòn Chồng - Nha Trang là những chủng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất (hình3.1 và 3.2) Hai chủng này được đem bảo quản và phục vụ cho các thí nghiệm vềsau

Hình 3.1 Hình ảnh về hai chủng nấm sợi có khả năng sinh cellulase mạnh nhất

(N3 và N4) được tuyển chọn

Hình 3.2 Hoạt tính cellulase của hai chủng N3 và N4 trên CMC 3.2 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG N3 VÀ N4 TUYỂN CHỌN ĐƯỢC

3.2.1 Ảnh hưởng của thời gian

Tiến hành nuôi cấy hai chủng N3 và N4 trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phúttrong môi trường Capek, sau các khoảng thời gian: 6; 12; 18; 24; 30; 36; 42; 48; 54;

60 h lấy mẫu để xác định hoạt tính của enzyme cellulase và đo sinh khối tế bào Kếtquả nghiên cứu được thể hiện ở phụ lục 01, hình 3.3 và hình 3.4

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của

Kết quả phân tích cho thấy khả năng sinh enzyme cellulase ngoại bào củachủng N3 tăng mạnh từ 17% (6 mm) ở 6h nuôi cấy lên 94% (33 mm) ở 30h nuôicấy, đạt cực đại 100% (35 mm) ở 36 h nuôi cấy, sau đó giảm dần đến 91,5% (32mm) ở 48 h và giảm mạnh xuống 83% (29 mm), 51,5% (18 mm) sau 60 h Như vậychủng N3 sinh enzyme cellulase ngoại bào mạnh nhất sau 30 ÷ 48 h nuôi cấy và đạtcực đại ở 36 h

Tương tự chủng N4 sinh cellulase ngoại bào mạnh nhất ở 30-54 h và đạt cựcđại 100% (31 mm) ở 42 h nuôi cấy, sau đó hoạt tính cellulase giảm mạnh còn 71%(22 mm) ở 60 h

Những nghiên cứu trước đây cho thấy, một số chủng vi khuẩn chịu nhiệt phânlập từ bể ủ rác thải sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 48 h nuôi cấy (Tăng ThịChính và cộng sự, 1999) Các chủng xạ khuẩn phân lập từ bể ủ rác thải sinh tổnghợp cellulase mạnh nhất sau 48÷72 h nuôi cấy (Tăng Thị Chính và cộng sự, 1999),

còn các chủng xạ khuẩn Actinomyces ưa ẩm sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau

72÷96 h nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng, Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999; Phạm Thị Ngọc