Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn ChồngNha Trang

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Đồ án này Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS. Vũ Ngọc Bội - Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Xin cám ơn: PGS. TS. Ngô Đăng Nghĩa - Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, ThS. Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng. Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, Phòng thí nghiệm CNSH đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua. i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i 11. William MF, Catherine TK, (1990), “Microbial enzymes and biotechnology”. Elsevier Science Publishing CO, INC, p. 1-70 45 26. John RW (2002), “Handbook of Enzymology”. Marcel Dekker Inc, p. 707-718, 761- 789, 879-915, 993-1018 47 DANH MỤC BẢNG LỜI CẢM ƠN i 11. William MF, Catherine TK, (1990), “Microbial enzymes and biotechnology”. Elsevier Science Publishing CO, INC, p. 1-70 45 26. John RW (2002), “Handbook of Enzymology”. Marcel Dekker Inc, p. 707-718, 761- 789, 879-915, 993-1018 47 ii DANH MỤC HÌNH LỜI CẢM ƠN i 11. William MF, Catherine TK, (1990), “Microbial enzymes and biotechnology”. Elsevier Science Publishing CO, INC, p. 1-70 45 26. John RW (2002), “Handbook of Enzymology”. Marcel Dekker Inc, p. 707-718, 761- 789, 879-915, 993-1018 47 iii MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: công nghiệp, chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Các enzyme đang được sử dụng phổ biến protease, amylase, pectinase, glucooxydase, … Cellulase là một trong số các enzyme được ứng dụng phổ biến trong công nghệ thực phẩm, công nghiệp dệt, bia - rượu, bột giặt, sản xuất phân bón hữu cơ, y tế, xử lý môi trường, Đặc biệt hiện nay cellulase được toàn thế giới quan tâm nghiên cứu và phát triển nhằm ứng dụng trong công nghệ chế tạo nhiên liệu sinh học. Đây là nguồn nhiên liệu thân thiện với môi trường và có thể giải quyết được vấn đề thiếu nhiên liệu khi các nguồn nhiên liệu truyền thống đang ngày càng cạn kiệt. Tuy vậy, hiện nay enzyme cellulase được sử dụng trong các ngành công nghiệp ở Việt Nam chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao. Nước ta là một nước sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme cellulase là rất phong phú. Vì thế, việc nghiên cứu sản xuất ra các enzyme từ vi sinh vật phân lập từ tự nhiên tại Việt Nam hiện nay đang là một đòi hỏi cấp thiết. Việc tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sản xuất enzyme nhất là cellulase từ tự nhiên không những giúp tận dụng các nguồn gen quý hiếm có sẵn từ tự nhiên mà còn góp phần bảo tồn gen, cải tạo các chủng vi sinh vật công nghiệp đã bị thoái hóa giống sau một thời gian sử dụng. Xuất phát từ lý do trên và tình hình nghiên cứu tại Việt nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang” với mục tiêu: thu thập các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phân rong giấy với họat tính cao làm cơ sở cho việc sản xuất enzyme cellulase, ứng dụng trong sản xuất cồn từ rong biển - một hướng đang được toàn thế giới quan tâm. Nội dung của đề tài: 1) Phân lập và tuyển chọn được chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase cao từ rong giấy thu tại Hòn Chồng-Nha Trang; 1 2) Sơ bộ phân loại các chủng vi sinh vật sinh cellulase cao phân lập được; 3) Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng vi sinh tuyển chọn được. Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo không thể tránh được các hạn chế. Em rất mong nhận được các ý kiến góp ý của những ai quan tâm đến vấn đề này, để cho báo cáo thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cám ơn. 2 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ CELLULASE 1.1.1. Giới thiệu về cellulose Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật. Ngoài ra, người ta còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật (VSV). Ở tế bào thực vật và một số tế bào vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi. Hình 1.1. Cấu trúc không gian của phân tử cellulose Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose. Các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bằng liên kết α-1,4 glucoside. Các gốc glucose trong cellulose thường lệch nhau một góc 180 o và có dạng như một chiếc ghế bành. Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường và 3 được cấu tạo như hình 1.1 và hình 1.2. Hình 1.2. Cấu trúc phân tử celulose Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy. Người và hầu hết động vật không có khả năng phân hủy cellulose. Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ. Tuy nhiên nhiều chủng VSV bao gồm nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007). Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân cellulose tạo thành các phân tử đường β-glucose. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, cellulose bị phân hủy dưới tác dụng hiệp đồng của phức hệ cellulase bao gồm ba enzyme là Exo-β-(1,4)- glucananse hay enzyme C 1 , Endo-β- glucananse hay endocellulase còn gọi là enzyme CMC-ase hay C x và β-(1,4)-glucosidase hay cellobioase: • Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydrolase, C1 EC 3.2.1.91) giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC nhưng tác dụng mạnh lên cellulose vô định hình hoặc cellulose đã bị phân giải một phần. Tác dụng lên cellulose kết tinh không rõ nhưng khi có mặt endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt. • Endo-1,4-glucanase (hay CMC-ase, Cx, EC 3.2.1.4) thủy phân liên kết ß-1,4- glucoside và tác động vào chuỗi cellulose một cách tùy tiện, sản phẩm của quá trình thủy phân là cellobiose và glucose. Do thủy phân CMC hoặc cellulose theo kiểu tùy tiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi cellulose và tăng chậm các nhóm khử, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose. • ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiose và các 4 cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase, còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. Chức năng của ß-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng của cellulase. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thành cellobiose và cuối cùng thành glucose. Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo 3 giai đoạn chủ yếu sau: Trong giai đoạn thứ nhất, dưới tác dụng của tác nhân C 1 , cellulose bị thủy phân thành cellulose hòa tan. Trong giai đoạn thứ hai, cellulose hòa tan sẽ bị thủy phân dưới tác dụng xúc tác của hệ enzyme C x tạo thành đường cellobiose. Ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzyme ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose. 5 ﾧ Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm. 1.1.2. VSV sinh tổng hợp cellulase Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi VSV cả trong điều kiện hiếu khí và yếm khí. Các loài VSV thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose. Số lượng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp enzyme 6 có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia quá trình phân giải này. Bảng 1.1 dưới đây là một số loại VSV được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ nhất. 7 [...]... Minh và cộng sự, 2006) Từ các phân tích ở trên cho thấy hiện ở Vi t Nam chưa có công trình nào công bố về vi c phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh enzyme celluase từ rong giấy Vì thế vi c Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang ” là cần thiết nhằm thu thập các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase. .. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VSV SINH CELLULASE CAO TỪ RONG GIẤY Để tuyển chọn các chủng VSV có khả năng sinh enzyme cellulase thủy phân cellulose, chúng tôi tiến hành phân lập VSV từ các mẫu rong giấy đã mục thu tại bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang Sử dụng môi trường thạch thường để phân lập vi khuẩn, môi trường Capek để phân lập nấm mốc và môi trường ISP 4 để phân lập xạ... - Thu rong giấy đã ủ mục tại bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang - Phân lập và tuyển chọn các chủng VSV trên môi trường thạch đặc trưng (chọn chủng VSV có vòng phân giải CMC lớn nhất là chủng có khả năng sinh cellulase cao nhất) - Sơ bộ phân loại các chủng VSV được tuyển chọn bằng phương pháp truyền thống - Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng VSV được tuyển chọn 2.2.1... VSV có khả năng sinh enzyme cellulase cao là những chủng có khả năng phân giải tốt cơ chất cellulose Vì thế các chủng VSV sinh enzyme cellulase cao thường hiện diện ở những nơi giàu nguồn cellulose như: rơm rạ mục, lá cây mục, gỗ mục, mùn cưa mục hay hiện diện trên thân rong Vì thế chúng tôi tiến hành phân lập và tuyển chọn những VSV sinh enzyme cellulase trên rong giấy và tuyển chọn các chủng sinh cellulase. .. quả phân lập ở bảng 3.1 cho thấy đã phân lập được 16 chủng VSV có khả năng sản xuất enzyme cellulase, trong đó có 14 chủng VSV có hoạt tính enzyme cellulase cao bao gồm 7 chủng vi khuẩn, 4 chủng nấm mốc và 4 chủng xạ khuẩn Từ những chủng có họat tính cellulase cao, chúng tôi chọn được bốn chủng VSV 20 có vòng thủy phân cellulose mạnh nhất gồm VK 4, N3, N4 và XK4 Tiếp tục xác định hoạt độ enzyme cellulase. .. đề phân lập các chủng vi sinh vật và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase như: tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp cellulase và tinh sạch, đánh giá tính chất hóa lý của cellulase từ chủng penicillium sp DTQ - HK1 (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007) Nghiên cứu phân loại và xác định hoạt tính cellulase của chủng. .. họat tính cellulase, chúng tôi chọn được hai chủng nấm sợi N3 và N4 là hai chủng phân lập được từ rong giấy đã ủ mục tại bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang là những chủng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất (hình 3.1 và 3.2) Hai chủng này được đem bảo quản và phục vụ cho các thí nghiệm về sau 21 Hình 3.1 Hình ảnh về hai chủng nấm sợi có khả năng sinh cellulase mạnh nhất (N3 và N4) được tuyển chọn 22 Hình... mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phân rong giấy với họat tính cao làm cơ sở cho vi c sản xuất enzyme cellulase ứng dụng trong sản xuất cồn từ rong biển - một hướng đang được toàn thế giới quan tâm 12 CHƯƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1 Rong giấy: Mẫu rong giấy mục được lấy từ bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang Rong Giấy có tên khoa học là: Ulva retieulata,... lại; VSV có khả năng sinh hơi khi có bọt khí trong ống duhaml 2.2.6 Kiểm tra khả năng chịu muối Cấy vi sinh vật lên đĩa peptri chứa môi trường đặc trưng với các nồng độ muối khác nhau từ 1 - 11%, giữ trong tủ ấm 37 oC Sau 1 - 5 ngày lấy ra đọc kết quả, nếu VSV mọc được ta kết luận chúng có khả năng chịu muối và ngược lại 2.2.7 Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân khác (protease và amylase)... của enzyme cellulase và đo sinh khối tế bào Kết 23 quả nghiên cứu được thể hiện ở phụ lục 01, hình 3.3 và hình 3.4 Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng N3 24 Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng N4 Nhận xét Kết quả phân tích cho thấy khả năng sinh enzyme cellulase ngoại bào của chủng N3 tăng mạnh từ 17% (6 mm) ở 6h . chưa có công trình nào công bố về vi c phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh enzyme celluase từ rong giấy. Vì thế vi c Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme. một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang với mục tiêu: thu thập các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phân. Phân lập và tuyển chọn được chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase cao từ rong giấy thu tại Hòn Chồng-Nha Trang; 1 2) Sơ bộ phân loại các chủng vi sinh vật sinh cellulase cao phân