phương pháp Graxianop.
• Cách tiến hành:
Với enzyme Cx: cho 3 ml dung dịch có chứa 50 mg Na-CMC vào ống nghiệm, thêm 1 ml dung dịch acetate 0,5 M, pH 5 và 1 ml dung dịch enzyme, nâng nhiệt đến 400C và giữ trong 1 h. Tiến hành xác định đường khử ngay theo phương pháp Grixianop. Tiến hành mẫu kiểm tra theo cách tương tự, nhưng sau khi trộn lẫn enzyme với cơ chất, tiến hành xác định đường khử ngay.
Hoạt động enzyme được tính bằng số lượng đường khử (tính theo glucose) giữa bình thí nghiệm và bình kiểm tra. Từ đó tính ra đơn vị hoạt động của 1 ml dịch môi trường hoặc 1 g chế phẩm.
Với enzyme C1: Cho vào ống nghiệm (đường kính khoảng 3cm) 150mg sợi bông đã loại tạp chất (hoặc 100 mg CMC), thêm 5 ml dung dịch enzyme, 10 ml dung dịch đệm acetate 0,2 M, pH 5,6 và 5 ml nước cất. Giữ ở 400C trong 24 h rồi đem xác định đường khử theo phương pháp Graxianop. Mẫu kiểm tra cũng được giữ ở cùng điều kiện như trên.
Xác định hàm lượng đường: Sử dụng phương pháp Graxxianop (phương pháp Ferixianua kali).
• Nguyên tắc
Phương pháp này dùng chất oxi hóa là Frixianua kali, có phản ứng chính: 2K3Fe(CN)6+ 2KOH → 2K4Fe(CN)6+ H2O+ O
Tiếp theo, oxy nguyên tử oxy hóa mạnh đường để tạo ra acid tương ứng: CH2OH(CHOH)4CHO+ 2O → COOH(CHOH)4COOH
Phản ứng tổng quát:
4K3Fe(CN)6+ 4KOH + CH2OH(CHOH)4CHO → 4K4Fe(CN)6+ COOH(CHOH)4COOH + 2H2O
Khi dư một giọt dịch đường, đường sẽ khử chỉ thị màu Methilene xanh rồi chuyển sang màu tím hồng và chuyển sang màu vàng khi kết thúc định phân. Từ lượng đường tiêu hao khi định phân ta suy ra lượng đường khử có trong dung dịch cần phân tích.
• Tiến hành
Dùng pipet lấy 20 ml dung dịch Ferixianua kali 1% cho vào bình tam giác 250 ml. Sau đó cho vào 5 ml dung dịch KOH 2,5N và 3-4 giọt Mythylene xanh. Lắc đều và dặt trên bếp điện đun sao cho 1-2 phút thì sôi. Tiếp theo dùng lượng đường khử cần phân tích chuẩn bằng cách nhỏ liên tục vào bình và để bính sôi liên tục đến mất màu của methylene xanh.
• Tính kết quả
Hàm lượng đường khử trong dung dịch cần phân tích sẽ tính theo công thức:
Trong đó:
a: Lượng glucose tương ứng với 20 ml dung dịch Ferixianua kali 1%. b: Số ml dung dịch đường tiêu hao khi chuẩn 20 ml Ferixianua kali 1%. 100: Hệ số qui đổi.
Xác định hệ số a: Cân 0.5 g glucose hoặc fructose tinh khiết sấy khô, pha với nước cất thành 100 ml. Dùng dung dịch này làm chuẩn để chuẩn với 20 ml dung dịch Ferixianua kali vừa pha xem nó tương ứng với bao nhiêu mg đường.
) 100 / ( 100 . % g ml m a D=