Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có đặc tính phân hủy phân tử tín hiệu quorum sensing và đối kháng với vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ (Edwardsiella ictaluri) trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

Trong nghiên cứu này, cách tiếp cận của đề tài là phân lập, tuyển chọn những chủng vi khuẩn từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, từ nước và bùn đáy ao nuôi cá tra, có khả năng đối kháng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHẠM THỊ KIM ANH

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ ĐẶC TÍNH PHÂN HỦY PHÂN TỬ TÍN HIỆU ‘‘QUORUM

GAN THẬN MỦ (Edwardsiella ictaluri) TRÊN CÁ TRA

(Pangasianodon hypophthalmus)

Chuyên ngành: VI SINH

Mã số chuyên ngành: 604240

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS NGUYỄN THỊ NGỌC TĨNH

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa i

Lời cam đoan ii

Mục lục iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt viii

Danh mục các bảng ix

Danh mục các hình vẽ x

Danh mục các đồ thị xi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu probiotic 4

1.1.1 Tình hình nghiên cứu probiotic trên thế giới 4

1.1.2 Tình hình nghiên cứu probiotic tại Việt Nam 6

1.2 Tình hình dịch bệnh gây ra bởi vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 7

1.2.1 Bệnh gây ra bởi vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 7

1.2.1.1 Lịch sử phát hiện tác nhân gây bệnh 7

1.2.1.2 Đặc điểm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 8

1.2.1.3 Triệu chứng lâm sàng 8

1.2.1.4 Đường lây truyền 10

1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá da trơn 10

1.2.2.1 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá da trơn

10

1.2.2.2 Các nghiên cứu phòng bệnh do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá da trơn 10

1.2.3 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra 12

1.2.3.1 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra 12

Mục lục Luận văn Thạc sĩ

1.2.3.2 Các nghiên cứu phòng bệnh do Edwardsiella ictaluri gây ra

trên cá tra 12

1.3 Giới thiệu về probiotic 13

1.3.1 Định nghĩa probiotic 14

1.3.2 Đặc điểm của probiotic 15

1.3.3 Vai trò của Probiotic 15

1.3.4 Cơ chế tác động của probiotic 16

1.3.4.1 Tác động đối kháng 16

1.3.4.2 Cải thiện chất lượng nước 17

1.3.4.3 Tăng cường hệ miễn dịch 18

1.3.4.4 Ảnh hưởng đến sự sinh trưởng 19

1.3.4.5 Sự hình thành quần thể trong ruột (Gut colonization) 20

1.4 Cơ chế hoạt đông của hệ thống “ Quorum sensing” ở vi khuẩn gây bệnh 21

1.4.1 Định nghĩa quá trình “Quorum sensing” 22

1.4.2 Hệ thống “Quorum sensing” của Edwardsiella spp 22

1.4.3 Sự phân hủy sinh học quá trình “Quorum sensing” của vi khuẩn gây bệnh 23

1.4.3.1 Enzyme AHL lactonase 23

1.4.3.2 Enzyme AHL acylase 24

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26

2.2 Địa điểm thu mẫu 26

2.3 Vật liệu nghiên cứu 27

2.3.1 Nguồn vật liệu cho phân lập 27

2.3.2 Chủng vi khuẩn 29

2.3.3 Môi trường và hóa chất 29

2.4.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn có đặc tính phân hủy phân tử AHL

(phân tử tín hiệu “Quorum sensing” ở vi khuẩn Edwardsiella ictaluri) 31

2.4.3 Thử khả năng phân hủy phân tử HHL (N-hexanoyl homoserine

lactone) của các chủng vi khuẩn phân lập được ở điều kiện in vitro 32

2.4.3.1 Xây dựng đường chuẩn tương quan giữa nồng độ HHL và đường kính vòng tròn sắc tố violacein 32 2.4.3.2 Khảo sát đặc tính phân hủy HHL của các chủng vi khuẩn

phân lập ở điều kiện in vitro 33 2.4.4 Khảo sát đặc tính đối kháng với Edwardsiella ictaluri trong điều kiện

in vitro 34

2.4.4.1 Phương pháp đường vuông góc (Cross Streak) 34

2.4.4.2 Phương pháp thạch khuếch tán (modified agar well-diffusion method) 35 2.4.4.3 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán (Disc-diffusion method) 36

2.4.4.4 Phương pháp BLIS (Bacteriocin-like inhibitory substance) 36 2.4.5 Thửkhả năng gây bệnh cho người và động vật 37 2.4.6 Thử khả năng đối kháng với một số chủng kiểm định 38

2.4.7 Thử nghiệm các đặc tính sinh học in vitro của các chủng vi khuẩn đã

được tuyển chọn 38 2.4.7.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của vi khuẩn tuyển

chọn 38 2.4.7.2 Ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng của vi khuẩn tuyển chọn 38 2.4.7.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên sự tăng trưởng của vi khuẩn tuyển chọn 39 2.4.7.4 Khả năng chịu pH dạ dày 39 2.4.7.5 Khả năng chịu muối mật 40

Mục lục Luận văn Thạc sĩ

2.4.8 Định danh vi khuẩn sử dụng phương pháp truyền thống và giải trình

tự gen 16S rRNA 41

2.4.8.1 Định danh vi khuẩn sử dụng phương pháp truyền thống 41

2.4.8.2 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA 47

2.4.9 Thử khả năng tương thích giữa các chủng vi khuẩn đã được chọn 48

2.5 Xử lý kết quả 49

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu AHL ở vi khuẩn Edwarsiella ictaluri 50

3.1.1 Số lượng dòng vi khuẩn thu được qua các đợt phân lập 50

3.1.2 Biến động giá trị pH của hỗn dịch vi khuẩn trong quá trình phân lập

51

3.1.3 Biến động mật độ quang của các hỗn hợp vi khuẩn qua quá trình phân lập 52

3.1.4 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc sau quá trình phân lập 52

3.2 Khả năng phân hủy phân tử HHL bởi các dòng vi khuẩn đã được chọn lọc 53

3.3 Khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Edwardsiella ictaluri 54

3.3.1 Phương pháp thạch khuếch tán 54

3.3.2 Các phương pháp khác 56

3.4 Kết quả thử khả năng sinh hemolysin 59

3.5 Kết quả thử khả năng đối kháng với một số chủng vi khuẩn kiểm định 61 3.6 Kết quả thử một số đặc tính sinh học in vitro của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 62

3.6.1 Đường cong tăng trưởng 63

3.6.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 64

3.6.5 Khả năng chịu pH dạ dày 66

3.6.6 Khả năng chịu muối mật 68

3.7 Kết quả định danh 71

3.7.1 Định danh bằng hình thái và các phản ứng sinh hóa 71

3.7.2 Định danh bằng sinh học phân tử 74

3.8 Kết quả thử khả năng tương thích lẫn nhau 74

3.9 Bàn luận 74

Chương 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 80

4.2 Kiến nghị 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Danh Mục Luận văn Thac sĩ

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

EMB Eosine Methylen Blue Lactase Agar

ESC Enteric Septicaemia of Cashfish

FAO Food and Agriculture Organization

HHL N- Hexanoyl- L- Homoserine Lactone

MIC Minimum Inhibitory Concentration

Probiotic Chế phẩm sinh học hoặc chế phẩm vi sinh

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu phân lập vi khuẩn probiotic đối kháng vi khuẩn gây

bệnh trong nuôi trồng thủy sản 5

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của probiotic lên sự phát triển của ấu trùng cá biển trong

điều kiện in vitro 19

Bảng 1.3 Ảnh hưởng của probiotic lên sự hình thành quần thể và khả năng bám

dính trong ruột cá 21

Bảng 2.1 Số lượng mẫu thu được qua bốn đợt 28 Bảng 3.1 Số lượng dòng vi khuẩn thu được sau khi nuôi cấy trong môi trường chứa

hỗn hợp phân tử AHL 50

Bảng 3.2 Khả năng phân hủy HHL của những dòng vi khuẩn đã được phân lập 53

Bảng 3.3 Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

bằng phương pháp thạch khuếch tán 54

Bảng 3.4 Tỉ lệ % mẫu có khuẩn lạc đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri.55 Bảng 3.5 Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng với Edw ictaluri bởi các dòng vi

khuẩn khảo sát bằng bốn phương pháp 57

Bảng 3.6 Kết quả thử khả năng sinh hemolysin 59 Bảng 3.7 Tổng hợp các đặc tính của các chủng vi khuẩn được sàng lọc: khả năng

phân hủy HHL, đối kháng Edw ictaluri và sinh hemolysin 60

Bảng 3.8 Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp đường vuông

73

Bảng 3.13 Kết quả định danh bằng sinh học phân tử 74 Bảng 3.14 Thử khả năng tương thích lẫn nhau giữa các chủng vi khuẩn tuyển chọn

74

Danh Mục Luận văn Thac sĩ

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ Edwardsiella ictaluri 8

Hình 1.2 Cá bệnh ESC cấp tính nhưng không có biểu hiện lâm sàng (A), Cá bệnh ESC cấp tính với những đốm xuất huyết màu đỏ ở phần đầu và bụng (B) và Cá bị bệnh ESC mãn tính (C) 9

Hình 1.3 Cá tra khỏe mạnh với nội tạng bình thường (A), cá tra bị bệnh mủ ở gan thận với nội tạng sưng to và nhiều đốm mủ trắng trên thận, lá lách và gan (B) 9

Hình 1.4 Cơ chế phân hủy phân tử AHL của enzyme lactonase và AHL-acylase 25

Hình 2.1 Dụng cụ thu mẫu nước hình (a), mẫu bùn (b) 27

Sơ đồ 2.1 Qui trình nghiên cứu của đề tài 30

Sơ đồ 2.2 Qui trình phân lập vi khuẩn phân hủy phân tử AHL 31

Hình 2.2 Các vòng sắc tố violacein tiết ra bởi vi khuẩn CV026 khi có sự hiện diện của phân tử HHL 33

Hình 2.3 Phương pháp đường vuông góc 35

Hình 2 4 Cách làm chết vi khuẩn bằng chloroform 37

Hình 2.5 Thử khả năng tương thích bằng phương pháp thạch khuếch tán 49

Hình 3.1 Hình thái các khuẩn lạc phân lập từ mẫu nước ở cuối chu kỳ 4 (a) và mẫu bùn ở cuối chu kỳ 4 (b) trên môi trường BHIA 53

Hình 3.2 Thử khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn khảo sát bằng phương pháp đường vuông góc (a), thạch khuếch tán (b), đĩa giấy khuếch tán (c), BLIS (d) 56

Hình 3.3 Kết quả thử khả năng sinh hemolysin 59

Hình 3.4 Thử khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đường vuông góc 61

Hình 3.5 Kết quả nhuộm gram T1DT101(a), T1DT103(b), G1DT102(c), G2VL1.2(d), B4TAG19A(e), N4TAG22a1(f) 71

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1 Biến động giá trị pH của hệ vi sinh từ các mẫu phân lập khác nhau qua

bốn chu kỳ 51

Đồ thị 3.2 Biến động mật độ quang của các hỗn hợp vi khuẩn trong các hỗn hợp vi

sinh vật từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, nước và bùn ao nuôi cá tra qua bốn chu

kỳ 52

Đồ thị 3.3 Đường cong tăng trưởng chủng T1DT101 (a), T1DT103 (b), G1DT102

(c), G2VL1.2 (d), B4TAG19A (e), N4TAG22a1(f) 63

Đồ thị 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn

Mở đầu Luận văn Thac sĩ

MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam, nghề nuôi thủy sản đang phát triển nhanh và là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn, đóng góp rất lớn cho xuất khẩu Theo FAO (2008), sản lượng nuôi trồng thủy sản của Việt Nam đạt gần 1,7 triệu tấn, có giá trị khoảng 3,3

tỉ USD trong năm 2006 Trong đó, sản lượng nuôi trồng thủy sản nước ngọt ước tính khoảng 1,51 triệu tấn, giá trị khoảng 3,17 tỉ USD Trong các loài cá nuôi nước

ngọt, cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) loài cá nuôi nước ngọt truyền thống, là

một đối tượng xuất khẩu với nhiều mặt hàng chế biến được xuất sang hơn 80 nước trên thế giới Cá tra được nuôi phổ biến trong ao, lồng bè, đăng quần với mức độ thâm canh, bán thâm canh và qui mô nông hộ ở hầu hết các tỉnh Nam Bộ, trong đó tập trung chủ yếu ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ Sản lượng cá tra ước tính đạt khoảng 300.000 tấn (năm 2004), đạt 400.000 tấn (năm 2005), đạt

800.000 tấn (năm 2006), đạt 1.000.000 tấn (năm 2007), 1.128.014 tấn (năm 2008)

và 1,2 triệu tấn (năm 2009), tổng sản lượng năm 2010 là 1,141 triệu tấn, kim ngạch xuất khuẩu đạt 1,44 tỉ USD [1] Trong vòng 10 năm phát triển, sản lượng xuất khẩu của cá tra từ 7.000 tấn, giá trị 20 triệu USD (năm 1997) tăng lên 286.000 tấn, giá trị

737 triệu USD (năm 2006) và 1,2 tỉ USD trong năm 2008 Qua số liệu thống kê cho thấy rằng cá tra là loài cá xuất khẩu chiến lược của Việt Nam trong những năm tiếp theo Kỹ thuật nuôi thâm canh đã giúp cải thiện đáng kể năng suất trong nuôi trồng thủy sản nói chung và cá tra nói riêng Tuy nhiên, bên cạnh đó, nó cũng đồng thời tạo ra sự ô nhiễm môi trường, dịch bệnh ngày càng nhiều và khó điều trị Bệnh cá tra chủ yếu do vi khuẩn và ký sinh trùng gây nên và có thể gây chết lên đến 70-80%[9] Để phòng ngừa và điều trị bệnh, hầu hết nông dân dùng thuốc kháng sinh để trị bệnh cá tra Với sự lạm dụng sử dụng thuốc kháng sinh đã tạo ra các chủng vi khuẩn kháng thuốc và dư lượng thuốc kháng sinh trong các sản phẩm chế biến từ cá tra

Để thay thế dần phương pháp phòng bệnh truyền thống, phương pháp phòng và trị bệnh bằng liệu pháp sinh học ngày càng được ưa chuộng như vaccine, các chất tăng

Vaccine được cho là phương pháp hiệu quả nhất trong phòng ngừa một số bệnh gây

ra bởi vi khuẩn và virus, nhưng chưa được sử dụng phổ biến có thể là do giá thành quá cao, thời gian nghiên cứu lâu và thường gây sốc cho cá Những thành công đáng chú ý là việc sử dụng các chất tăng cường hệ miễn dịch vừa có phổ phòng ngừa bệnh rộng vừa thân thiện với môi trường Hơn thế nữa, phương pháp trị liệu sinh học bằng vi sinh vật có lợi (probiotic) được mong đợi và trở thành công cụ phòng ngừa, điều trị nhiều bệnh hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản thông qua khả năng cải thiện môi trường nước và ức chế vi sinh vật gây bệnh Đặc biệt là các vi sinh vật có lợi có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu “Quorum sensing” của các vi khuẩn gây bệnh và có khả năng làm giảm độc lực của chúng

Trong nghiên cứu này, cách tiếp cận của đề tài là phân lập, tuyển chọn những chủng vi khuẩn từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, từ nước và bùn đáy ao nuôi cá tra,

có khả năng đối kháng và phân hủy phân tử tín hiệu “Quorum sensing” của vi

khuẩn Edwardsiella ictaluri Đây là cách tiếp cận mới hiện nay về nghiên cứu và

ứng dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản nhằm kiểm soát dịch bệnh

do vi khuẩn gây nên Đề tài thành công là kết quả bước đầu chọn ra các dòng vi khuẩn có những đặc tính ưu việt, làm nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học ứng dụng cho các ao nuôi cá tra nhằm giảm thiểu dịch bệnh gây rủi

ro cho người nuôi

Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “ PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ ĐẶC TÍNH PHÂN HỦY PHÂN TỬ TÍN HIỆU ‘‘QUORUM SENSING” VÀ ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN GÂY

BỆNH GAN THẬN MỦ (Edwardsiella ictaluri) TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon

hypophthalmus) ”

Mục tiêu:

Sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống,

từ nước và bùn đáy ao nuôi cá tra có đặc tính phân hủy phân tử tín hiệu ‘‘Quorum

sensing” và đối kháng với vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ (Edwardsiella ictaluri) trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

Mở đầu Luận văn Thac sĩ

Nội dung nghiên cứu

¾ Sàng lọc những chủng vi khuẩn từ các mẫu hệ tiêu hóa cá tra thịt và cá tra giống; nước và bùn ở đáy các ao nuôi cá tra ở một vài tỉnh thuộc Đồng Bằng Sông

Cửu Long có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu “Quorum sensing” ở Edwardsiella

ictaluri và cũng đối kháng với vi khuẩn này

¾ Thử khả năng gây bệnh cho người, động vật và khả năng đối kháng với một

Ý nghĩa thưc tiễn

¾ Tạo ra sản phẩm probiotic nội địa giá thành rẻ nhưng hiệu quả cao

¾ Giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh và rủi ro cho người nuôi cá tra do bệnh gan thận mủ gây nên, đồng thời tăng chất lượng thịt phi lê cá đáp ứng yêu cầu vệ

sinh an toàn thực phẩm của cá tra xuất khẩu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

1.1 Tình hình nghiên cứu probiotic

1.1.1 Tình hình nghiên cứu probiotic trên thế giới

Sản lượng nuôi trồng thủy sản trên thế giới chiếm đến 40% tổng sản lượng thủy sản, với tổng giá trị vào khoảng 78 tỉ USD năm 2006 [58], 102 tỉ USD năm

2008 [57] Vai trò của nuôi trồng thủy sản ngày càng gia tăng đáng kể, do sản lượng khai thác thủy sản đã trở nên bão hòa và nhu cầu tiêu thụ thuỷ sản ngày càng tăng Tuy nhiên, vấn đề dịch bệnh đang gây tổn thất rất lớn cho nghề nuôi thủy sản

Những bệnh gây ra bởi Vibrio spp., Aeromonas spp., Pseudomonas spp.,

Streptococcus spp., xảy ra rất phổ biến và dẫn đến tỉ lệ chết cao của tôm cá nuôi

[150]

Khi người nuôi gặp phải vấn đề dịch bệnh, thông thường biện pháp đối phó đầu tiên là sử dụng các hóa chất diệt khuẩn hoặc kháng sinh Việc sử dụng những hóa chất này đã đem lại hiệu quả cao trong việc phòng và trị bệnh trên vật nuôi [114], [124] Tuy nhiên, việc lạm dụng hóa chất diệt khuẩn và kháng sinh trong nông nghiệp cũng như trong nuôi trồng thủy sản đã dẫn đến sự xuất hiện các dòng

vi khuẩn kháng thuốc [22], [124] Nghiêm trọng hơn, những dòng vi khuẩn kháng thuốc có thể truyền những gen kháng thuốc cho vi khuẩn gây bệnh ở người, đe dọa đến sức khỏe con người [125], [152]

Nhận thức được về những mối nguy đó, Hoa Kỳ và nhiều nước Châu Âu, Châu Á đã ban hành những đạo luật về kiểm soát việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản, đồng thời hiện đang tìm kiếm những biện pháp thay thế để tiến đến việc ngưng sử dụng kháng sinh Thức tỉnh trước những mối đe dọa do việc sử dụng kháng sinh cũng như do vi khuẩn gây bệnh mang đến cho người nuôi, những biện pháp thay thế đang được tìm kiếm Trong đó có việc sử dụng vaccine, các chất kích thích miễn dịch, các peptide kháng khuẩn, hợp chất tiền sinh học (prebiotic), chế phẩm vi sinh (probiotic) Đặc biệt, việc sử dụng chế phẩm

vi sinh đang ngày càng được quan tâm và ứng dụng rộng rãi

vi khuẩn có đặc tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh dựa vào phương pháp xác

định hoạt tính ức chế in vitro [40], [79], [133] là cách tiếp cận được sử dụng chủ

yếu trong việc phân lập vi khuẩn probiotic Hiện nay, có bốn phương pháp thường

được sử dụng để sàng lọc các chủng vi khuẩn tiết ra các hợp chất ức chế in vitro:

Phương pháp đường vuông góc, phương pháp thạch khuếch tán, phương pháp đĩa giấy khuếch tán và phương pháp BLIS (Bacteriocin-like inhibitory substance) Tất

cả các phương pháp trên đều dựa trên một nguyên tắc là khi một chủng vi khuẩn tiết

ra một hợp chất ngoại bào có đặc tính ức chế một chủng vi khuẩn khác, hoạt tính này sẽ được thể hiện thông qua việc ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn khác trong môi trường agar

Trong một số trường hợp, những vi khuẩn ứng cử viên sau khi sàng lọc in vitro

sẽ được kiểm tra in vivo ở qui mô nhỏ về đặc tính an toàn đối với vật chủ [40], [79]

và khả năng bảo vệ vật chủ khi gây cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh [81], [89] Một số nghiên cứu khác, những vi khuẩn ứng cử viên sau khi sàng lọc sẽ tiếp tục được kiểm tra những đặc tính khác như khả năng chịu đựng muối mật [37], khả năng kích thích hệ miễn dịch [82], sự hình thành quần thể [36], khả năng cạnh tranh chất dinh dưỡng [73] Trong thực tế, những nghiên cứu này là cần thiết để kiểm tra các vi khuẩn probiotic ứng viên có thể hiện những cơ chế tác động nào khác hay

không Ngoài ra, những thử nghiệm in vivo là rất cần thiết, bởi một chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn khác ở điều kiện in vitro, không nhất thiết sẽ thể hiện đặc

tính đối kháng đó khi có sự hiện diện của vật chủ

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu phân lập vi khuẩn probiotic đối kháng vi khuẩn gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản [150]

Động vật thử nghiệm Loài vi khuẩn probiotic phân

lập

Đối kháng vi khuẩn gây

bệnh

Cá tuyết Đại Tây Dương Carnobacterium divergens V anguillarum

Lactobacillus plantarum A salmonicida

Cá hồi Đại Tây Dương

Carnobacterium sp V anguillarum Pseudomonas fluorescens A salmonicida

Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

1.1.2 Tình hình nghiên cứu probiotic tại Việt Nam [2], [5], [15]

Hiện nay, ở Việt Nam có khoảng 400 loại chế phẩm vi sinh, trong đó có khoảng 330 loại dùng để xử lý môi trường và trên 60 loại dùng để trộn vào thức ăn nhằm mục đích kích thích tăng trưởng, tăng sức đề kháng của tôm cá Đa số các loại chế phẩm này có nguồn gốc từ nhiều nước: Trung Quốc, Indonesia, Đài Loan, Anh, Mỹ, Ấn Độ, Hàn Quốc, Úc, Đức, Thái Lan Và trong những năm gần đây, các nhà khoa học Việt Nam đã bắt đầu nghiên cứu tạo những chế phẩm vi sinh được phân lập trong nước sử dụng trong nuôi trồng thủy sản, có hiệu quả tương đương nhưng giá thành rẻ hơn nhiều so với các chế phẩm vi sinh có nguồn gốc nhập ngoại Tiến sĩ Võ Thị Hạnh (Viện Sinh học Nhiệt đới, 2003) [5] đã tạo ra chế phẩm BIO II bằng cách phối trộn các chế phẩm vi sinh vật sống và enzyme tiêu hóa tự sản xuất Chế phẩm BIO II có tác dụng phân hủy thức ăn thừa và các khí thải ở đáy ao,

ổn định pH và màu nước ao, kìm hãm sự tăng trưởng của các vi sinh vật gây bệnh cho tôm cá và tăng năng suất nuôi trồng

Chế phẩm EM có nguồn gốc từ Nhật, gồm năm nhóm loài vi sinh có ích (vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn lactic, nấm men, xạ khuẩn, nấm sợi) với khoảng 80 loài

vi sinh vật sống cộng sinh trong một môi trường Chế phẩmEM đã được Việt Nam hóa dưới cái tên VEM (Vietnamese effective microorganisms) và được ứng dụng rộng rãi trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản [15]

PGS.TS Lê Dụ (2005) [2] đã xây dựng được bảy qui trình kỹ thuật ứng dụng các loại chế phẩm EM tương ứng với bảy đối tượng nông nghiệp Sử dụng chế phẩm EM trong nuôi tôm sú tại Bình Định bước đầu cho thấy những kết quả khả quan trong việc hạn chế ô nhiễm môi trường ao nuôi Những ao sử dụng chế phẩm này có màu nước trong, độ kiềm và pH dao động không đáng kể, tôm không bị nhớt

và phát triển ổn định

Đề tài “Nghiên cứu công nghệ xử lý cặn bùn ao nuôi tôm công nghiệp góp phần làm sạch nền đáy và sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh” của nhóm nghiên cứu

một chủng xạ khuẩn, hai chủng nấm sợi, một chủng nấm men) [14] Chế phẩm probiotic nói trên khi được bổ sung vào ao nuôi tôm đã góp phần cải thiện các chỉ

số thủy lý hóa của bùn và nước ao nuôi Hàm lượng H2S, NH4-N, NO2-N, NO3-N, COD, chất hữu cơ tổng trong bùn luôn thấp hơn trong ao đối chứng và ổn định Tỉ

lệ sống của tôm tăng 82%, sản lượng tăng 121% và trọng lượng trung bình tăng 19%

Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học hoàn thiện chế phẩm TS3 có khả năng tăng sức đề kháng của tôm trong nuôi tôm sú thâm canh” [13] do nhóm nghiên cứu của Viện Công Nghệ Sinh Học, Công Nghệ Thực Phẩm và Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III thực hiện Tiêu chí của đề tài là phân lập các chủng vi khuẩn có đặc tính đối kháng với hai chủng vi khuẩn gây bệnh trên tôm

Bio-(Vibrio alginolyticus, Vibrio parahaemolyticus), đồng thời có khả năng cải thiện

môi trường ao nuôi tôm Đề tài đã tuyển chọn được năm chủng vi khuẩn để tạo chế phẩm sinh học Kết quả thử nghiệm trong bể kính và bể composite cho thấy tỉ lệ

sống của tôm tăng 15%, trọng lượng trung bình tăng 13% so với đối chứng

1.2 Tình hình dịch bệnh gây ra bởi vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

1.2.1 Bệnh gây ra bởi vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

1.2.1.1 Lịch sử phát hiện tác nhân gây bệnh

Tác nhân gây bệnh Edwardsiella ictaluri đã được báo cáo lần đầu tiên trên cá nheo Mỹ, Ictalurus punctatus, vào năm 1979 Đến năm 1999, Austin & Austin cũng

đã xác định Edwardsiella ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính trên cá

da trơn, hội chứng này được gọi tắt là ESC và có thể dẫn đến tỉ lệ chết cao ở cá nheo Mỹ

Ở Việt Nam bệnh gan thận mủ trên cá tra xuất hiện lần đầu tiên vào cuối năm

1998, tác nhân gây bệnh lúc đầu được xác định bởi nhóm nghiên cứu của trường

Đại học Stirling phối hợp với trường Đại học Cần Thơ là Bacillus sp.[62] Đến năm

2002 nhóm nghiên cứu này đã đính chính lại tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá

tra là vi khuẩn Edwardsiella ictaluri [42]

Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

1.2.1.2 Đặc điểm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri thuộc họ Enterbacteriaceae là vi khuẩn gram

âm, hình que, kích thước 1 x 2 - 3μm, không sinh bào tử, là vi khuẩn yếm khí tùy ý, phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, không oxy hoá, lên men trong môi

trường glucose Có 1-3 Plasmid liên kết với Edw ictaluri [104], [134] Những

plasmid có thể đóng vai trò quan trọng trong việc đề kháng với kháng sinh

Edwarsiella ictaluri là một trong những loài khó tính nhất của chủng Edwarsiella Edwarsiella ictaluri tăng trưởng chậm trên môi trường thạch BHIA khoảng từ 36 –

48 giờ ở 28 – 30oC, phát triển thành khuẩn lạc nhỏ và tăng trưởng rất chậm hoặc không tăng trưởng khi ủ ở 37oC Vi khuẩn có thể phân lập từ mẫu cá bệnh (gan, thận, tỳ tạng) trên môi trường TSA, EMB sau 48 giờ ở 28oC tạo thành khuẩn lạc màu trắng đục, hoặc trên môi trường thạch máu (BA)

Hình 1.1 Vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ Edwardsiella ictaluri

1.2.1.3 Triệu chứng lâm sàng

Đối với cá nheo Mỹ [138]

Triệu chứng lâm sàng của cá bị nhiễm bệnh ESC khác nhau tùy thuộc vào từng giai đoạn và mức độ trầm trọng của bệnh, chất lượng nước và các yếu tố gây xáo trộn Biểu hiện lâm sàng của cá bị nhiễm bệnh ESC có thể chia thành ba dạng: Bệnh cấp tính, mãn cấp và mãn tính

Bệnh cấp tính: Bệnh phát triển và tiến triển rất nhanh, hầu như không có biểu

hiện lâm sàng bên ngoài và tỷ lệ chết cao Cá bị nhiễm bệnh sắp chết phát hiện

hoặc nằm bất động chờ chết Bụng sưng phòng, mắt lồi Các đốm xuất huyết màu

đỏ và lan rộng trên da đầu và bụng Gan có hoặc chưa có dấu hiệu hoại tử nhưng thận và lách bị sưng tấy

Bệnh mãn cấp: Bệnh phát triển chậm hơn bệnh cấp tính nhưng mức độ chết

tích lủy tăng nhanh Triệu chứng lâm sàng bên ngoài biểu hiện rõ hơn như những đốm xuất huyết và những vết lở nhỏ đường kính từ 2 – 3mm màu đỏ xen lẫn trắng hoặc màu trắng xung quanh đỏ Cá bị nhiễm bệnh có khuynh hướng bỏ ăn từ từ

Bệnh mãn tính: Bệnh tiến triển chậm và có biểu hiện suy nhược hệ thần kinh

trung ương như quay tròn, nhào lộn Bệnh xuất hiện sau 30 ngày kể từ khi dịch bệnh cấp tính bùng phát và tỉ lệ chết bắt đầu giảm Biểu hiện lâm sàng cơ bản là khối u nhỏ hay vết lở loét xuất hiện trên đầu

Hình 1.2 Cá bệnh ESC cấp tính nhưng không có biểu hiện lâm sàng (A), Cá bệnh ESC cấp tính với những đốm xuất huyết màu đỏ ở phần đầu và bụng (B) và Cá bị bệnh ESC mãn tính (C)

Đối với cá tra

Hình 1.3 Cá tra khỏe mạnh với nội tạng bình thường (A), cá tra bị bệnh mủ ở gan thận với nội tạng sưng to và nhiều đốm mủ trắng trên thận, lá lách và gan (B)

B

Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

Cá nhiễm bệnh, tỉ lệ chết cao (10-90%), có thể lên đến 100% đồng thời trên gan, thận và tụy tạng xuất hiện nhiều đốm trắng đường kính 1-3mm bên trong chứa dịch màu trắng đục [10] Bệnh thường xảy ra nhiều vào mùa mưa lũ khi nhiệt độ nước nằm trong khoảng 20 – 290C [137]

1.2.1.4 Đường lây truyền [132]

Edw ictaluri có thể nhiễm cho cá bằng hai đường khác nhau:

¾ Vi khuẩn trong nước có thể qua đường mũi của cá vào cơ quan khứu giác di chuyển vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não và bệnh lan rộng từ màng não

đến sọ và da

¾ Edw ictaluri cũng có thể xâm nhiễm qua đường tiêu hóa, thức ăn qua

đường miệng gây nhiễm khuẩn ruột hoặc qua niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu Bằng đường này vi khuẩn vào mao mạch trong biểu bì gây họai tử và mất sắc tố của da

Bệnh tiến triển gây viêm ruột, viêm gan và viêm cầu thận trong vòng hai tuần sau khi nhiễm khuẩn

1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên

cá da trơn

1.2.2.1 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá da trơn

Bệnh nhiễm khuẩn cấp tính đường ruột trên cá da trơn được tìm thấy tại bất cứ nơi nào nuôi cá nheo tại nước Mỹ Bệnh xảy ra ở tất cả các kích cỡ cá nuôi nhưng tập trung ở giai đoạn cá hương và cá giống [141] Sự thiệt hại cho nghề nuôi công nghiệp của cá da trơn do ESC được ước tính hàng năm khoảng 4 – 6 triệu USD từ năm 1990 và đã tăng nhanh sau đó Khoảng 70% các hộ nuôi được khảo sát vào năm 1996 cho thấy nguyên nhân từ ESC đã gây ra thiệt hại cao nhất cho các hộ nuôi

cá da trơn, với 57% số hộ nuôi bị thiệt hại nặng [140]

1.2.2.2 Các nghiên cứu phòng bệnh do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá da

trơn

vaccine sống cải tiến dưới dạng đông khô (Immuno X+5, Immuno2 X+5, Serial 1A)

và một loại vaccine sống truyền thống (RE-33) [130] Cá nheo Mỹ (Ictalurus

punctatus) được gây miễn dịch bằng phương pháp ngâm ở các ngày tuổi khác nhau

(từ 7 ngày tuổi đến 31 ngày tuổi) Kết quả cho thấy hiệu lực của vaccine đã thể hiện được ngay từ khi cá được gây miễn dịch ở giai đoạn 7 ngày tuổi và 10 ngày tuổi Tỉ

lệ sống của cá 7 ngày tuổi được gây miễn dịch dao động trong khoảng 58,4 – 77,5%, đối với cá 10 ngày tuổi thì dao động trong khoảng 64,1 – 78,9% Ba năm

sau đó, nhóm tác giả này cũng đã nghiên cứu phương pháp in ovo đối với việc sử

dụng các loại vaccine sống cải tiến này, khi gây miễn dịch từ giai đoạn trứng của cá nheo Mỹ, bằng phương pháp ngâm trong thời gian 10 phút Kết quả cho thấy phương pháp gây miễn dịch này là khá hiệu quả, với tỉ lệ bảo hộ khoảng 59,7% [131]

Shelby và ctv (2007a,b) bổ sung hai loại chế phẩm sinh học probiotic có chứa

Pediococcus sp và Enterococcus sp (riêng lẻ hoặc phối hợp với nhau) vào thức ăn

của cá nheo Mỹ giống và cho ăn trong vòng 5 – 8 tuần Sau đó tiến hành đo các chỉ tiêu: tăng trọng, hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) và các thông số miễn dịch như protein huyết thanh, immunoglobulin, lysozyme, complement Các số liệu về vi sinh cho thấy hai chủng vi khuẩn probiotic vẫn tồn tại được trong thức ăn sau khi bổ sung trong thời gian bốn tuần Tuy nhiên, các tác giả không tìm thấy sự khác biệt nào về tăng trọng, đáp ứng miễn dịch cũng như tính kháng bệnh của cá sau thời gian cho ăn thức ăn có bổ sung chế phẩm sinh học

Aboagye và ctv (2008) thử nghiệm ảnh hưởng của chế phẩm sinh học,

Lymnozyme đến tỉ lệ sống của cá nheo Mỹ sau khi được gây nhiễm thực nghiệm

với Edwardsiella ictaluri Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở nghiệm thức có bổ sung

Lymnozyme vào nước hàng ngày liên tục trong hai tuần, tỉ lệ chết của cá sau khi

gây nhiễm Edwardsiella ictaluri (45%) giảm có ý nghĩa thống kê (p = 0,002) so với

nghiệm thức đối chứng (80%)

Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

1.2.3 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên

cá tra

Sự phát triển ngày càng nhanh của cá tra cùng với thị trường xuất khẩu tiềm năng, hàng ngàn nông dân đã chạy theo lợi nhuận từ cá tra một cách vô điều kiện, với năm 2008 là đỉnh điểm của phong trào nuôi cá tra ở ĐBSCL Người nuôi đã ồ ạt

mở rộng diện tích nuôi, tăng mật độ nuôi một cách tự phát, cung cấp một lượng lớn thức ăn dẫn đến môi trường trong ao nuôi dễ bị ô nhiễm, là điều kiện để bệnh bộc phát và gây thiệt hại cho người nuôi

Đặc biệt trong vài năm trở lại đây, phong trào nuôi cá tra xuất khẩu ở ĐBSCL tăng rất nhanh và không theo qui hoạch nên bệnh trên cá tra nuôi hiện nay xảy ra ngày càng nhiều nhưng việc điều trị lại kém hiệu quả đang là vấn đề quan tâm hàng đầu của người nuôi cá và cả các nhà chuyên môn

1.2.3.1 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra

Các bệnh thường gặp trên cá tra bao gồm bệnh do vi khuẩn (bệnh gan thận mủ

do Edwardsiella ictaluri, bệnh đốm đỏ do Pseudomonas, bệnh nhiễm trùng máu do

Edwardsiella tarda), nấm (nấm thủy mi, ) và ký sinh trùng (trùng bánh xe, trùng

quả dưa, sán lá đơn chủ, sán song chủ, ) Theo kết quả điều tra của Nguyễn Thanh Phương (2007) [11] về các bệnh do tác nhân gây vi khuẩn xuất hiện trong các ao nuôi cá tra thâm canh ở tỉnh An Giang, 68,3% số hộ điều tra nhận thấy bệnh đỏ mỏ

đỏ đuôi, 61% số hộ ghi nhận bệnh gan-thận-mủ, 51,2% số hộ ghi nhận bệnh phù đầu, 24,4% số hộ ghi nhận bệnh vàng da Theo thống kê của Lý Thị Thanh Loan (2008) [10], tần suất xuất hiện bệnh năm 2007 ở các tỉnh ĐBSCL bao gồm bệnh gan thận mủ: 52,80%; xuất huyết: 42,50%; phù đầu, phù mắt: 20,70%; vàng da: 21,60% Trong đó bệnh gan thận mủ (hay bệnh đốm trắng nội tạng) gây thiệt hại nhiều nhất cho người nuôi

1.2.3.2 Các nghiên cứu phòng bệnh do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra

Để giải quyết vấn đề vi khuẩn gây bệnh Edwardsiella ictaluri kháng sinh,

có hiệu quả và kinh tế Từ năm 2005, Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II đã phối hợp với Công ty Thuốc Thú Y Trung ương II (Navetco) thực hiện đề tài cấp

Bộ “Nghiên cứu vaccine phòng bệnh nhiễm khuẩn cho cá tra, cá basa, cá mú, cá giò, cá hồng Mỹ nuôi công nghiệp” [12], trong đó đối tượng được quan tâm đặc biệt

là cá tra Sau ba năm tiến hành nghiên cứu vaccine phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra đã đạt được một số kết quả khả quan

Tuy nhiên, các loại vaccine nói trên là vaccine bất hoạt (sử dụng kháng nguyên là tế bào vi khuẩn giết bằng formalin 0,4%), có một số nhược điểm là tỉ lệ bảo hộ chưa cao, thời gian bảo hộ khá ngắn (hai tháng, trong khi một vụ nuôi cá tra kéo dài tới 5 – 6 tháng), đòi hỏi phải bổ sung một số chất bổ trợ để làm tăng hiệu quả của vaccine Biện pháp phòng bệnh tổng hợp luôn đòi hỏi sự kết hợp của nhiều cách tiếp cận khác nhau: Quản lý môi trường nuôi, quản lý chất lượng con giống, tăng cường sức khỏe vật nuôi, sử dụng các hợp chất kích thích miễn dịch, vaccine bất hoạt, vaccine sống nhược độc, các chế phẩm sinh học có nguồn gốc thảo dược, các chế phẩm vi sinh vật

Hiện nay, một số chế phẩm vi sinh đã được ứng dụng trong sản xuất cá tra giống và nuôi thương phẩm nhằm thay thế cho việc sử dụng kháng sinh Các chế phẩm này được bổ sung vào trong thức ăn dưới dạng men vi sinh, đồng thời được

bổ sung vào nước để xử lý môi trường Gần đây, chế phẩm probiotic Bokashi được chiết xuất từ lá trầu của nhóm nghiên cứu Khoa Thủy Sản, trường Đại Học Nông Lâm Huế được xem là một trong những hướng nghiên cứu đột phá trong việc phòng

và trị bệnh cho tôm cá Thành phần hệ vi sinh vật trong chế phẩm này bao gồm vi khuẩn lactic (50%), vi khuẩn quang hợp (20%), nấm men (20%), xạ khuẩn (5%), nấm sợi (5%) Qua kết quả thử nghiệm của Công ty TNHH Hải Nông Phát thành phố Hồ Chí Minh trên một số ao nuôi cá tra, basa từ tháng 4/2006 đến nay đã đạt được những thành công nhất định trong việc phòng bệnh gan thận [4]

1.3 Giới thiệu về probiotic

Sử dụng probiotic không chỉ là một phương pháp mà còn là một chiến lược phòng bệnh mới về kỹ thuật vi sinh làm giảm tỉ lệ chết của vật chủ đối các bệnh

Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

nhiễm trùng [34] Chế phẩm sinh học góp phần quan trọng tăng cường hoạt động của cơ chế phòng bệnh không đặc hiệu và cơ chế bảo vệ đặc hiệu chống lại bệnh tật [84]

Những nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn probiotic từ môi trường nuôi trồng thủy sản đã được báo cáo vào những năm 1980 [54].Trong hệ thống nuôi trồng thủy sản “mối tương tác giữa vi sinh vật và vật chủ không chỉ có giới hạn trong đường ruột của vật chủ mà vi khuẩn probiotic cũng có thể hoạt động trên mang, da và cả trong môi trường sống xung quanh của vật chủ” Liên quan đến điều này,

Verschuere và ctv (2000) đề nghị một định nghĩa mới cho phép mở rộng ứng dụng

của thuật ngữ “probiotic” trong nuôi trồng thủy sản Probiotic được định nghĩa như

là “vi sinh vật sống được bổ sung vào thức ăn để mang lại những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ bởi khả năng tăng cường mối quan hệ đối với vật chủ hoặc mối quan hệ giữa vật chủ với quần thể vi sinh vật xung quanh, làm tăng giá trị của dinh dưỡng, tăng khả năng đề kháng của vật chủ đối với bệnh tật, hoặc cải thiện môi trường sống xung quanh vật chủ” Việc sử dụng probiotic trong công nghiệp nuôi trồng thủy sản

trong hai thập kỉ qua Gần đây, hầu hết các nghiên cứu về chế phẩm sinh học được thực hiện trên nhóm cá, nhóm giáp xác, nhuyễn thể và thức ăn tự nhiên [97], [147]

Sự hình thành quần thể vi sinh vật trên cá, nhóm giáp xác, và nhuyễn thể ở giai đoạn ấu trùng, giai đoạn chuyển tiếp phản ánh hệ vi sinh vật tồn tại trên trứng, môi trường nước nuôi và hệ vi sinh vật trong thức ăn tự nhiên trong suốt giai đoạn đầu của quá trình ương nuôi [107] Do đó, việc hình thành hệ vi sinh vật của ấu trùng thông qua việc bổ sung probiotic đang được xem như là một chiến lược để ưu tiên hình thành hệ vi sinh vật có lợi cho ấu trùng trong quá trình ương nuôi [144]

1.3.2 Đặc điểm của probiotic [143]

Một chế phẩm probiotic phải an toàn và hiệu quả:

¾ Không gây bệnh đối với vật chủ

¾ Có thể sống sót trong hệ tiêu hóa, có khả năng bám vào biểu mô ruột và hình thành quần thể trong hệ tiêu hóa

¾ Hoàn toàn không mang gen kháng kháng sinh và tạo độc tố

1.3.3 Vai trò của Probiotic

Các chế phẩm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản hiện có thể chia làm ba loại [120], [68]

¾ Vi sinh vật cư trú thường xuyên trong hệ tiêu hóa: Các vi sinh vật thuộc

giống Bacillus, Lactobacilluc, Sacharomyces … thường được trộn vào thức ăn hoặc

giàu hóa qua thức ăn tự nhiên

¾ Vi sinh vật có tính đối kháng hoặc cạnh tranh dinh dưỡng với vi khuẩn

gây bệnh (biocontrol – không nhất thiết phải cư trú trong hệ tiêu hóa): Bacillus

lichenifomis, Bacillus ssp., Vibrio alginolyticus…

¾ Vi sinh vật cải thiện chất lượng môi trường ( bioremediation – xử lý

sinh học): Nitrosomonas, Nitrobacter, Actinomyces, các loài Bacillus khác, các loài tảo, các vi khuẩn tía không lưu huỳnh như: Rhodobacter sp., Rhodospirillum,

Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas palutris, Rhodomicrobium vanniell, các loại nấm Asperillus oryzae, Asperillus niger, Rhizopus sp., tuy

Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

nhiên có nhiều vi sinh vật thực hiện được nhiều chức năng khác nhau nên ranh giới

giữa các nhóm này đôi khi không phân chia rõ ràng

1.3.4 Cơ chế tác động của probiotic

Những số liệu khoa học và các ứng dụng probiotic hiện nay về cơ chế tác động

đã chứng minh thành phần của các vi sinh vật không thể tồn tại độc lập mà còn đóng vai trò thuận lợi đối với hệ thống đường ruột [122] Cơ chế tác động của probiotic gồm: (1) cải thiện chất lượng nước; (2) tạo ra các hợp chất ức chế hoặc kháng sinh; (3) có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng, năng lượng hoặc các hợp chất hóa học và có khả năng hình thành quần thể; (4) tăng cường các phản ứng miễn dịch; (5) tương tác với các phytoplanton; (6) cung cấp nguồn dinh dưỡng đa lượng

và các enzyme cần thiết cho hệ tiêu hóa; (7) điều chỉnh các phản ứng đối với môi trường [81]

1.3.4.1 Tác động đối kháng

Các hợp chất đối kháng là các chất hóa học được tiết ra từ vi khuẩn Các hợp chất này là những độc tố hoặc những chất ức chế sự phát triển của những vi sinh vật khác Các chất ức chế bao gồm các chất như kháng sinh, acid hữu cơ, hydro peroxide, carbon dioxide, siderophores và bacteriocin được tạo ra từ các loài vi khuẩn khác nhau [147]

Những loài vi khuẩn khác nhau có thể tiết ra một số hợp chất hóa học có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế các quần thể vi khuẩn khác nhau để đấu tranh giành lấy

năng lượng hay các chất hóa học Nhiều nghiên cứu in vitro đã chứng minh một số

chủng vi khuẩn bổ sung vào môi trường nuôi ấu trùng có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh [65] Tuy nhiên những hợp chất ức chế hay đối kháng với các vi khuẩn

khác trong các nghiên cứu in vitro không đảm bảo rằng những chủng probiotic có tiềm năng này vẫn còn có hiệu quả trong các nghiên cứu in vivo trong cùng một

điều kiện ứng dụng [72] Vì vậy, hầu hết các nghiên cứu trên ấu trùng của giáp xác

và nhuyễn thể đã được công nhận hiệu quả ức chế vi khuẩn gây bệnh của một số

Maeda và Liao (1992b) đã thử nghiệm hiệu quả một số chủng vi khuẩn được phân lập từ môi trường nuôi tôm sú lên sự phát triển của ấu trùng tôm Trong số bảy chủng được thử nghiệm, chủng PM-4, được bổ sung cùng với tảo khuê đã cho tỉ lệ sống và tỉ lệ lột xác của ấu trùng cao so với những lô thí nghiệm đối chứng chỉ được

bổ sung tảo khuê Trong một thí nghiệm kiểm soát sinh học, Maeda (1994) sau đó

đã chứng minh rằng chủng PM-4 có khả năng ức chế sự phát triển của Vibrio spp Bằng cách tạo ra các hợp chất có đặc tính kháng khuẩn Riquelme và ctv (1997)

cũng đã lựa chọn các chủng vi khuẩn có lợi xuất hiện ở điều kiện tự nhiên có khả

năng làm tăng tỉ lệ tăng trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng Điệp Chi Lê (Argopecten

purpuratus) Mười một trong số 506 chủng vi khuẩn đã tạo ra hợp chất có khả năng

ức chế Vibrio anguillarum bảo vệ ấu trùng của con Điệp Chi Lê chống lại mầm bệnh từ VAR (vibrio anguillarum related) sau khi gây nhiễm Tương tự, chủng

Roseobacter sp (BS107) cũng tiết ra hợp chất kháng khuẩn chống lại Vibrio anguillarum Hoạt tính kháng khuẩn hoạt động cao nhất sau khi nuôi cấy chủng V.anguillarum 48 giờ trong dịch nổi của BS107 Trong thực nghiệm, dịch nổi sau li

tâm của chủng BS107 thúc đẩy đặc hiệu tỉ lệ sống của ấu trùng Điệp Chi Lê [118]

Chủng Aeromonas media A199 đã bảo vệ ấu trùng con Hầu Thái Bình Dương (Crassostrea gigas) khi chúng được cảm nhiễm với Vibrio tubiashii Hơn nữa,

A199 còn thể hiện phổ hoạt tính đối kháng rộng chống lại các vi khuẩn gây bệnh

trên cá, nhóm giáp xác và nhuyễn thể trong nghiên cứu in vitro [70] Sau đó, trong một nghiên cứu in vitro, Lategan và ctv (2006) đã tìm thấy sự tạo ra một hợp chất

ngoại bào có khả năng ức chế và có đặc tính tương tự như các chất được tiết ra từ chủng A199 Hợp chất ức chế này được xác định là indole 2, 3-benzopyrrole có

hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm rộng Lactobacillus brevis (108 CFU/ml) được

sử dụng để kiểm soát sự phát triển của Vibrio alginolyticus trong môi trường nuôi tự nhiên Trong một nghiên cứu in vitro khác, các sản phẩm ngoại bào được tiết ra từ

Lactobacillus brevís cũng có thể ức chế sự phát triển của Vibro alginolyticus [145]

1.3.4.2 Cải thiện chất lượng nước

Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

Probiotic được chứng minh hiệu quả trong việc cải thiện chất lượng môi trường nước nuôi cá [32] Chế phẩm sinh học tăng cường sự phân hủy các hợp chất hữu cơ, làm giảm hàm lượng nitơ, phospho và kiểm soát hàm lượng phospho, nitric, hydrosulfic [33] Ứng dụng chế phẩm sinh học thương mại làm giảm sự tích tụ các hợp chất hữu cơ, cải thiện chất lượng nước và cải thiện điều kiện môi trường của các trang trại [135], giảm hàm lượng nitơ [149] và phospho trong bùn của các ao

nuôi tôm Lactobacillus vannamei [148] Chế phẩm sinh học Bacillus spp Được

đánh giá là có tác động cải thiện chất lượng môi trường nước trong ao nuôi tôm

[60] Probiotic Lactobacillus spp JK-8 và JK-11 làm giảm mật độ của các vi khuẩn gây bệnh và nitơ ở các trang trại đã bị nhiễm bệnh Sử dụng vi khuẩn Bacillus spp Không chỉ cải thiện chất lượng nước mà còn làm giảm vi khuẩn gây bệnh Vibrio

spp [44]

1.3.4.3 Tăng cường hệ miễn dịch

Chế phẩm sinh học có tác dụng kích thích hệ miễn dịch của cá Sự hình thành quần thể và khả năng bám của probiotic vào biểu mô ruột cá là điều kiện cần thiết

để tăng cường hệ miễn dịch thông qua khả năng gắn kết của các kiểu phân tử liên quan với vi khuẩn ( bacteria associated molecular patterns – BAMP ) bị biến đổi thành các phân tử và các thụ thể chuyên biệt liên quan trên bề mặt của tế bào biểu

mô ruột và các mô lympho ruột ( gut associated lymphoid tissue – GALT ) gọi là các protein nhận dạng điển hình (pattern recognition proteins – PRP ), đặt biệt là sự hiện diện của các thụ thể toll – like (Toll-like receptor - TLR ) [34] Ảnh hưởng của probiotic đến hệ miễn dịch được chứng minh rất rõ ở người [63] cũng như động vật [146] và động vật thủy sản [24], [112], [121] Việc bổ sung thức ăn có chứa

Lactobacillus lactis ssp Lactis, Leuconostoccous mensenteroides, Lactobacillus sakei vào cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) và cá hồi đại dương (Salmo trutta) từ

21 đến 24 ngày làm tăng hoạt động thực bào ( phagocytic activity – PA ), tạo các anion superoxide, và các hoạt động bổ trợ khác (ACH 50 – alternative complement

động thực bào, hoạt động của lysozyme trên màng nhày ruột và huyết thanh tăng

đáng kể [86] Oncorhynchus mykiss ăn thức ăn chứa Lactobacillus rhamnosus (JCM

113630) trong vòng 30 ngày cho thấy tăng hoạt động thực bào (PA), lysozyme huyết thanh, các hoạt động bổ trợ khác (ACH50) và hàm lượng globulin miễn dịch trong tế bào chất cũng tăng lên đáng kể [110], [111]

Một nghiên cứu khác đã chứng minh rằng anion superoxide, ACH50, và biểu hiện gen cytokine (IL-1β1, TNF1 và TNF2) của vi khuẩn khi cá Oncorhynchus

mykiss ăn thức ăn có chứa Lactobacillus rhamnosus, Enterococcus faecium, và Bacillus subtilis trong 45 ngày cao hơn ăn thức ăn đối chứng [112] Một số hợp chất

khác cũng có thể được sử dụng làm chất kích thích miễn dịch như lipopolysaccharide (LPS) của vi khuẩn Gram âm, peptidoglycan (PG) của vi khuẩn Gram dương hay β-glucan của nấm men, có thể tác động thông qua việc kích thích một số cơ chế [55]

1.3.4.4 Ảnh hưởng đến sự sinh trưởng

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của probiotic lên sự phát triển của ấu trùng cá biển trong điều

kiện in vitro

Probiotica Loài cá chủb Probiotic sử

dụng

Ảnh hưởng lên vật chủ Tác giả

L plantarum Hippoglossus

hippoglossus (ấu trùng và cá

con)

Thức ăn tươi vào nước nuôi,

106 cfu ml-1trong 24h, 6 ngày

Tế bào túi biểu bì tăng,

tỉ lệ sống sót tăng sau 32 ngày

Ottesen và Olafsen

(0.15 g)

Thức ăn, ăn kiên 0.1% , 9 tuần

Khả năng tăng trưởng tăng

Khả năng tăng trưởng tăng,

FCR giảm

Ghosh và

ctv (2003)

Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng chế phẩm sinh học ảnh hưởng có lợi

về mặt dinh dưỡng như: Khử độc tố các hợp chất có hại tiềm ẩn trong thức ăn, làm biến tính các hợp chất khó tiêu hóa như ( kitin, tinh bột, protein, lipid) có trong thực phẩm bởi các emzyme phân giải như amylase và protease thêm vào đó probiotic cung cấp vitamine ( Biotin và vitamin B12), carotenoid, protein, các acid béo phân

tử thấp và các acid béo cao phân tử không có khả năng tạo cholesterol (Highly polyunsaturated fatty acids-HPUFAs) như: Acid eicosapentanoic (EPA) và docohexaenoic (DHA) chúng rất cần thiết cho sự phát triển của cá [26], [147]

Trong các thí nghiệm in vivo, nhiều nghiên cứu đã chứng minh việc đưa probiotic

vào khẩu phần ăn với liều lượng 103 đến 1012 cfu g-1 cho cá từ 30 đến 90 ngày tuổi Kết quả thể hiện trong bảng 1.2 cho thấy probiotic kích thích sự phát triển như: Tăng tỉ lệ sống sót, tăng trọng, đặc biệt là tốc độ phát triển, nhưng tốc độ chuyển hóa thức ăn thấp Một số nghiên cứu cho rằng việc bổ sung probiotic không ảnh hưởng có lợi cho sự tăng trưởng bởi vì tỉ lệ cho ăn thấp, thời gian cho ăn hạn chế,

và phụ thuộc vào nguồn gốc chế phẩm sinh học [106], [142]

1.3.4.5 Sự hình thành quần thể trong ruột (Gut colonization )

Sự hình thành quần thể và khả năng bám của probiotic trong biểu mô dạ dày và màng nhầy ruột cá là cơ chế bảo vệ chống lại bệnh tật qua việc cạnh tranh với các thụ thể gắn kết, cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống (vị trí gắn kết trong hệ tiêu hóa) hoặc oxy và tạo các hợp chất kháng khuẩn [26] Thí nghiệm về vi khuẩn lactic được thực hiện bởi nhiều tác giả khác nhau [26], [60]) Gần đây người ta đã

chứng minh rằng Lactobacillus plantarum có khả năng bám và hình thành quần thể

trong biểu mô ruột Vi khuẩn lactic là loài duy nhất sử dụng khả năng bám đặc hiệu (manose-specific adhesins) cạnh tranh với những vi khuẩn gram âm khác và các thụ thể trên bề mặt màng nhầy tế biểu mô ruột [29] Hơn thế nữa sự hình thành quần thể

và khả năng bám của probiotic đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa và điều chỉnh hệ miễn dịch của vật chủ [85], [129] Nhiều thông tin khác về khả năng bám

tại và tăng sinh trong biểu mô của ruột [110] Nhiều nghiên cứu đã chứng minh vi khuẩn lactic (LAB) vẫn còn tồn tại trong ruột cá từ hai đến ba tuần sau khi thay đổi thức ăn có chứa vi khuẩn lactic [28], [86]

Bảng 1.3 Ảnh hưởng của probiotic lên sự hình thành quần thể và khả năng bám dính trong ruột cá

Probiotic Loài

chủb

Probiotic sử dụng

Thời gian probiotic tồn tại trong ruột (cfu g-1) Tác giả

Nikoskelaine và

Thức ăn , 1011

g-1, 30 ngày

105 – 109 trong ruột, không phát hiện sau hai tuần

Thức ăn, >107cfu g-1, 14 ngày

107 dịch ruột, 105 – 106 thành ruột

Kim và Austin (2006)

Lactococcus

lactis lactis,

L sakei

Salmo trutta (70 g)

Thức ăn, 106cfu g-1, 14 ngày

105 – 107 trong ruột, và vẫn tồn tại sau hai tuần

Balcázar

và ctv

(2007d)

1.4 Cơ chế hoạt đông của hệ thống “ Quorum sensing” ở vi khuẩn gây bệnh

Trong thập kỷ gần đây, cụm từ “Quorum sensing” được nhắc đến như một quá trình thông tin giữa tế bào với tế bào trong quần thể vi khuẩn Các phân tử tín hiệu

“Quorum sensing” như AHL (N-acyl homoserin lactone) có liên quan đến quá trình

Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

điều hòa các nhân tố gây độc ở nhiều vi khuẩn gây bệnh Sự phá vỡ hệ thống

“Quorum sensing” được xem là một liệu pháp mới chống lại bệnh nhiễm khuẩn

trong nuôi trồng thủy sản

1.4.1 Định nghĩa quá trình “Quorum sensing”

Vi khuẩn có thể giao tiếp với nhau và sử dụng các phân tử tín hiệu hóa học do chúng tiết ra, tiếp nhận và phản ứng đối với sự tích lũy của những phân tử tín hiệu này Việc phát hiện các phân tử tín hiệu trong môi trường cho phép vi khuẩn phân biệt giữa các quần thể vi khuẩn mật độ thấp và mật độ cao, và kiểm soát việc biểu hiện gen đối với sự thay đổi về mật độ tế bào Quá trình này gọi là “Quorum sensing”, cho phép một quần thể vi khuẩn kiểm soát có phối hợp sự biểu hiện gen của cả quần thể Nhiều kiểu hình ở vi khuẩn được điều khiển bởi “Quorum sensing”, bao gồm sự cộng sinh, độc lực, sự sản xuất kháng sinh, sự tạo thành màng sinh học … [124]

Trong quần thể vi khuẩn tồn tại hai loại ngôn ngữ “Quorum sensing” là ngôn ngữ phổ biến và ngôn ngữ đặc hiệu, cho phép vi khuẩn giao tiếp trong cùng một loài

và giữa các loài Quá trình “Quorum sensing” ở vi khuẩn gram âm được điều khiển bởi phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone (AHL) [67] Ở vi khuẩn gram dương, quá trình “Quorum sensing” được điều khiển bởi các phân tử oligopeptide

có chiều dài 5 đến 17 amino [101]

Phân tử AHL có liên quan đến các quá trình “Quorum sensing” ở các vi khuẩn

gây bệnh gram âm ở người và thực vật, ví dụ như Pseudomonas aeruginosa [119],

Erwinia carotovora, Agrobacterium tumefaciens [151], Vibrio harveyi [96] và

những vi khuẩn gây bệnh khác trên cá [35]

1.4.2 Hệ thống “Quorum sensing” của Edwardsiella spp

Hệ thống “Quorum sensing” cũng được phát hiện ở nhóm vi khuẩn gây bệnh

quan trọng trên cá, Edwardsiella spp Han và ctv (2009) xác định có bốn loại phân

tử tín hiệu AHL (BHL, HHL, 3-oxo-HHL và một phân tử AHL chưa xác định rõ)

Nhóm nghiên cứu trên lại xác định bốn loại phân tử tín hiệu AHL nói trên cũng tồn

tại ở Edwardsiella ictaluri, vi khuẩn gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính trên

cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) và bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon

hypophthalmus) nuôi ở Việt Nam (theo thông tin từ nhóm nghiên cứu của của viện

nghiên cứu và nuôi trồng thủy sản II )

1.4.3 Sự phân hủy sinh học quá trình “Quorum sensing” của vi khuẩn gây bệnh

Khả năng phân hủy phân tử AHL phân bố rộng rãi trong quần thể vi khuẩn Những enzyme có thể bẻ gãy phân tử AHL đã được phát hiện ở các loài vi khuẩn thuộc nhóm β-Proteobacteria [156], α-Proteobacteria và γ-Proteobacteria [139] cũng như ở một số loài thuộc nhóm vi khuẩn gram dương [49] Những loài vi khuẩn này

có thể khóa hệ thống “ Quorum sensing” của những loài vi khuẩn cạnh tranh để đạt được ưu thế chọn lọc Đó là trường hợp của những vi khuẩn sinh sống gần các vi khuẩn điều khiển quá trình tiết ra chất kháng sinh thông qua hệ thống “Quorum sensing” [115] Quá trình phân hủy các hợp chất tín hiệu có thể được xúc tác bởi hai loại enzyme: AHL lactonase và AHL acylase Bên cạnh đó, enzyme acylase của các sinh vật bậc cao cũng có thể ức chế các phân tử AHL [153]

1.4.3.1 Enzyme AHL lactonase

Dong và ctv (2000) sàng lọc hơn 500 chủng vi khuẩn thu từ thực địa và phòng

thí nghiệm về hoạt tính ức chế phân tử AHL Trong số này, 24 chủng cho các hoạt động enzyme khác nhau trong việc phân hủy phân tử AHL Enzyme chịu trách nhiệm cho việc phân hủy AHL (AiiA) được phân lập từ chủng vi khuẩn có hoạt tính

cao nhất, chủng Bacillus 240B1 Enzyme ở dạng tinh khiết ở nồng độ 50 mg/l, làm

giảm nồng độ của N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone từ 20 µM xuống khỏang 5 µM sau 10 phút Khi chạy quang phổ ion hóa phun điện tử của sản phẩm thủy phân cho thấy enzyme AiiA có tác dụng mở vòng lactone để tạo thành N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine [50] Những nghiên cứu tiếp theo cho thấy các gen mã

hóa enzyme lactonase phân bố rộng rãi ở nhiều loài Bacillus [52] Những enzyme

đồng dạng này cho thấy 90% tương đồng về trình tự ở mức độ acid amin

Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ

Bằng chứng đầu tiên cho thấy sự ức chế bằng enzyme đối với phân tử AHL có thể được sử dụng như một biện pháp kiểm soát sinh học được báo cáo trong nghiên

cứu của Dong và ctv (2000) Trong nghiên cứu này, sự biểu hiện của enzyme AiiA đối với vi khuẩn Erwinia carotovora làm giảm khả năng tiết enzyme phân hủy

thành tế bào của vi khuẩn gây bệnh xuống chỉ còn 10% và hầu như ức chế được các

triệu chứng bệnh thối củ ở những thực vật mẫn cảm Trong một nghiên cứu in vivo tiếp theo, Molina và ctv (2003) thử nghiệm hiệu quả của việc sử dụng một chủng

Bacillus phân hủy AHL trong việc kiểm soát sinh học đối với bệnh ở thực vật

Chủng Bacillus này có thể làm giảm bệnh thối củ gây ra bởi Erwinia carotovora xuống còn 15% và bệnh mụn cây ở cà chua gây ra bởi Agrobacterium tumefaciens xuống còn 10% Việc phân hủy phân tử AHL bởi chủng Bacillus bảo vệ hiệu quả

tương đương hoặc tốt hơn so với việc sản xuất kháng sinh bởi một chủng kiểm soát

sinh học Pseudomonas chlororaphis Hơn nữa, việc phân hủy các phân tử AHL

không chỉ có tác dụng phòng bệnh mà còn có tác dụng trị bệnh Gần đây, những kết

quả tương tự đã đạt được với chủng Bacillus thuringiensis [52]

1.4.3.2 Enzyme AHL acylase

Cùng một thời điểm khi Dong và ctv (2000) phát hiện chủng Bacillus có khả

năng phân hủy AHL, Leadbetter và Greenberg (2000) phân lập được một chủng vi khuẩn có thể sử dụng phân tử AHL như là nguồn cacbon và nitơ Chủng vi khuẩn

này có tên là Vibrio paradoxus VAI-C, được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường có

chứa 5 mg/l N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất Trong các thí nghiệm sử dụng AHL được dán nhãn phóng xạ, các nhà

nghiên cứu đã chứng minh Vibrio paradoxus cắt đứt phân tử AHL bằng một

enzyme AHL acylase, giải phóng ra homoserine lactone và một acid béo Sau đó, acid béo được sử dụng như nguồn cacbon thông qua đường dẫn β-oxidation Cần có thêm nhiều nghiên cứu trong tương lai để làm sáng tỏ bằng cách nào vi khuẩn đã lấy

được nitrogen từ homoserine lactone Gần đây, Flagan và ctv (2003) phân lập một

độ tăng trưởng phụ thuộc nồng độ AHL và năng suất của hỗn hợp hai chủng

Arthrobacter sp và Vibrio paradoxus VAI-C cao hơn so với các chủng này nuôi

riêng lẻ Điều này cho thấy rằng quần thể nhiều loài vi khuẩn có thể có ảnh hưởng

hổ trợ qua lại trong quá trình chuyển đổi và khoáng hóa tín hiệu “Quorum sensing” Lin và ctv (2003) phân lập một chủng vi khuẩn ức chế AHL, Ralstonia sp

XJI2B từ một màng sinh học đa loài Enzyme chịu trách nhiệm trong việc ức chế AHL (AiiD) được tinh chế và sau đó được ủ với phân tử N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone Việc chạy quang phổ ion hóa phun điện tử đối với sản phẩm thủy phân cho thấy rằng enzyme AiiD thủy phân liên kết amid của phân tử AHL Sự

thể hiện của enzyme AiiD ở vi khuẩn P aeruginosa tái tổ hợp PAO1 ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh và làm giảm tỉ lệ chết của giun tròn Caenorhabditis

elegans xuống còn 15%, so với chủng vi khuẩn không tái tổ hợp

Hình 1.4 Cơ chế phân hủy phân tử AHL của enzyme lactonase và

AHL-acylase [53]

Chương 2:Vật liệu và phương pháp Luận văn thạc sĩ

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG

PHÁP

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

¾ Thời gian: từ tháng 4/2010 – 12/2011

¾ Địa điểm: Phòng Sinh Học Thực Nghiệm - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2

2.2 Địa điểm thu mẫu

Ao nuôi cá tra thuộc 5 tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long: Tiền Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, An Giang, Trà Vinh ( phụ lục 1)

Hệ vi sinh vật từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, từ mẫu nước và bùn đáy ao nuôi được thu thập từ các vùng nuôi khác nhau Mỗi đợt thu mẫu tiến hành thu ở ba tỉnh, mỗi tỉnh chọn ba hộ nuôi cá tra thương phẩm, ba hộ sản xuất giống Đối với ao

cá thịt thu 3 con/mẫu/ao; đối với cá giống thu 10 con/mẫu /ao Tiến hành thu bốn đợt thu mẫu vào các thời điểm khác nhau trong năm

Thu hệ tiêu hóa cá tra giống và thịt

Thu hệ tiêu hóa (đoạn ruột gần dạ dày, phần ruột non và ruột già) của cá tra thịt và cá tra giống khỏe mạnh, không bị bệnh và xay xát Sau đó giữ lạnh khoảng

50C Thời gian lưu mẫu không quá 24 giờ

Mẫu hệ tiêu hóa của cá tra thịt và cá tra giống được đồng nhất bằng máy đồng nhất mẫu (MF10 basic, Đức) trong nước muối sinh lý (NaCl 0,9%),với tốc độ 8.000 vòng/ phút (rpm) trong 10 phút, để phóng thích hệ vi sinh vật đường ruột, sau đó ly tâm ở tốc độ 2.000 vòng/phút trong năm phút Dịch nổi được giữ lại và bảo quản trong glycerol 20% ở nhiệt độ -800C để sử dụng cho bước phân lập tiếp theo

Thu mẫu nước

Dùng dụng cụ chuyên dụng để thu mẫu nước (Hình 2.1a) Mỗi ao thu một mẫu, nước được thu ở ba tầng nước khác nhau, sau đó trộn lại thành 1 mẫu khoảng 0,5 lít nước được bảo quản lạnh khoảng 5oC trong suốt thời gian chuyển mẫu về phòng thí nghiệm Lấy 1ml mẫu nước tăng sinh trong 9ml môi trường BHI ủ trong

24 giờ ở 30oC Sau đó giữ giống trong glycerol 20%, ở -80oC để dùng cho thí nghiệm sàng lọc tiếp theo

Thu mẫu bùn

Chương 2: Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ

Mẫu bùn thu cùng thời gian và địa điểm với mẫu nước Mỗi ao thu một mẫu bùn khoảng 200g/mẫu bằng dụng cụ chuyên dùng (Hình 2.1b) Cân 1g bùn hòa tan với 9ml nước muối sinh lý NaCl 0,9% Ly tâm 2.000 rpm, trong 5 phút Hút 1 ml dịch nổi tăng sinh trong 9ml môi trường BHI trong 24 giờ, ở 30oC Sau đó giữ giống trong glycerol 20%, ở -80oC để dùng cho thí nghiệm sàng lọc tiếp theo

Hình 2.1 Dụng cụ thu mẫu nước hình (a), mẫu bùn (b)

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Nguồn vật liệu cho phân lập

Hệ vi sinh vật làm nguồn vật liệu cho phân lập được thu từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, từ mẫu nước và bùn ở đáy các ao nuôi cá tra thuộc 5 tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long: Đồng Tháp, Tiền Giang, Trà Vinh, Vĩnh Long, An Giang (Bảng 2.1)

Tiến hành 4 đợt thu mẫu

¾ Đợt 1: Tổng số mẫu thu được là 31 mẫu gồm 11 mẫu hệ tiêu hóa cá tra

thương phẩm (cá tra thịt) và 20 mẫu hệ tiêu hóa cá tra giống thuộc 3 tỉnh: Đồng Tháp, Tiền Giang, Vĩnh Long

¾ Đợt 2: Tổng số mẫu thu được là 108 mẫu gồm 26 mẫu hệ tiêu hóa cá tra

thương phẩm, 28 mẫu hệ tiêu hóa cá tra giống, 27 mẫu bùn ở đáy ao nuôi cá tra và

27 mẫu nước ao nuôi cá tra thuộc 4 tỉnh: Đồng Tháp, Tiền Giang, Trà Vinh, Vĩnh

Long

¾ Đợt 3: Tổng số mẫu thu được là 19 mẫu gồm 5 mẫu hệ tiêu hóa cá tra

thương phẩm và 14 mẫu bùn ở đáy ao nuôi cá tra thuộc 2 tỉnh: Đồng Tháp, Vĩnh

Long

¾ Đợt 4: Tổng số mẫu thu được là 91 mẫu gồm 18 mẫu hệ tiêu hóa cá tra

thương phẩm, 11 mẫu hệ tiêu hóa cá tra giống, 29 mẫu bùn ở đáy ao nuôi cá tra và

33 mẫu nước ao nuôi cá tra thuộc 3 tỉnh: An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long

Bảng 2.1 Số lượng mẫu thu được qua bốn đợt

Đợt thu

mẫu Ngày tháng Địa điểm thu mẫu Loại mẫu Tổng số mẫu

Đợt I 14 - 16/12/2009

Vĩnh Long, Tiền Giang, Đồng Tháp

Hệ tiêu hóa cá tra thịt 11

Hệ tiêu hóa cá tra thịt 26

Đợt III 11/05/2010

Đồng Tháp, Vĩnh Long

Hệ tiêu hóa cá thịt 5 Bùn đáy ao nuôi

cá tra 14

Đợt IV 10 - 12/8/2010 Đồng Tháp, Vĩnh Long,

An Giang

Hệ tiêu hóa cá tra thịt 18

Hệ tiêu hóa cá tra giống 11 Bùn đáy ao nuôi

cá tra 29 Nước ao nuôi cá

tra 33 Tổng số mẫu 249