Sơđồ 2.1. Qui trình nghiên cứu của đề tài.
Dương tính Dương tính
Nguồn phân lập
- Hệ tiêu hóa cá tra (cá giống và cá thương phẩm) - Nước và bùn (ao cá giống và ao cá nuôi thương phẩm)
Âm tính
Loại bỏ
Thử khả năng đối kháng Edw. ictaluri
Nuôi cấy cấy hỗn hợp vi sinh vật trong môi trường có chứa hỗn hợp AHL (4 chu kỳ)
Định danh vi khuẩn:
- Hình thái và sinh hóa - Giải trình tự gen 16S rRNA
Thử khả năng phân hủy N-hexanoyl-DL- homoserine lactone
Chọn các khuẩn lạc riêng lẻ
Đánh giá khả năng tương thích lẫn nhau
Các hỗn hợp vi khuẩn được tuyển chọn để phối chế tạo chế phẩm vi sinh
Các chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn cho thử nghiệm các đặc tính sinh học in vitro: - Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ muối - Khả năng chịu pH dạ dày và muối mật
Thử khả năng sinh hemolysin Loại bỏ
α,β hemolysin
γ hemolysin
Thử khả năng đối kháng với một số vi khuẩn kiểm định
Chương 2: Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ
2.4.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn có đặc tính phân hủy phân tử AHL (phân tử tín hiệu “Quorum sensing” ở vi khuẩn Edwardsiella ictaluri)
Lấy 500 µl MSo Ủ 2 ngày , 300C Ủ 2 ngày , 300C Ủ 24 giờ, 30oC Ủ 4 ngày, 30oC Lấy 200µl MS1 Ủ 2 ngày, 30oC Lấy 200µl MS3
Pha loãng và trải trên BHIA Hỗn hợp vi sinh vật (MS0) (Hệ
tiêu hóa, nước, bùn) (MS0: microbial suspension) 10ml NaCl 0,9% + 5ppm AHLs (MS1) 10ml NaCl 0,9% + 5ppm AHLs (MS2) 10ml NaCl 0,9% + 5ppm AHLs (MS3) Chu kỳ 2 Chu kỳ 4 10ml NaCl 0,9% + 5ppm AHLs (MS4) Cuối mỗi chu kỳ tiến hành: - Đo mật độ quang (600 nm) - Đo PH Chọn các khuẩn lạc có hình dạng và màu sắc khác nhau, tăng sinh trong BHI
Giữ giống trong glycerol 20%
Ủ 2 ngày, 30oC Lấy 200µl MS2
Cách tiến hành
Hỗn hợp vi sinh thu được từ hệ tiêu hóa cá tra thương phẩm và cá tra giống, từ
mẫu nước và bùn được nuôi cấy trong môi trường chứa 10ml dung dịch nước muối sinh lý 0,9% có bổ sung 5ppm hỗn hợp hai loại phân tử AHL (N-butyryl homoserine lactone và N-hexanoyl homoserine lactone). Mỗi đợt phân lập trải qua bốn chu kỳ (sơđồ 2.2).
Chu kỳ một: 500μl dịch vi khuẩn của mỗi loại mẫu khác nhau cho vào bình erlen chứa 10ml nước muối sinh lý 0,9% có bổ sung 5 ppm hỗn hợp AHL. Lắc 120 vòng/ phút (rpm), ủ 300C, bốn ngày.
Chu kỳ hai : 200 μl dịch vi khuẩn trong bình erlen ở chu kỳ một được cấy chuyền sang bình erlen mới có chứa 10ml nước muối sinh lý NaCl (0,9%) chứa lượng AHL như ban đầu. Lắc 120 vòng/ phút (rpm), ủ 300C, hai ngày. Đo mật độ
quang và pH của dịch vi khuẩn ở cuối mỗi chu kỳ.
Chu kỳ ba và bốn: Tương tự chu kì hai.
Cuối chu kỳ bốn: Dịch vi khuẩn được pha loãng bậc 10 (10-1, 10-2,…), mỗi
độ pha loãng tiến hành trải một đĩa thạch BHIA, ủ 300C, 24 giờ. Sau đó chọn khuẩn lạc đặc trưng dựa vào hình thái, màu sắc. Mỗi loại khuẩn lạc được tăng sinh trong 1ml môi trường BHI, đặt trong tủấm lắc 120 ở rpm. Sau 24 giờ tiến hành giữ giống trong Glycerol 20% ở -800C để sử dụng cho các bước sàng lọc tiếp theo.
2.4.3 Thử khả năng phân hủy phân tử HHL (N-hexanoyl homoserine lactone) của các chủng vi khuẩn phân lập được ởđiều kiện in vitro
2.4.3.1 Xây dựng đường chuẩn tương quan giữa nồng độ HHL và đường kính vòng tròn sắc tố violacein
Giống vi khuẩn C. violaceum CV026 lưu giữ ở -800C được cấy chuyền sang
đĩa BHIA có bổ sung 20ppm kanamycin, ủ ở 30oC trong 24 giờ để tạo giống cấp một. Từ giống cấp một, chọn một khuẩn lạc cấy chuyền sang erlen chứa 10ml môi trường BHI có bổ sung 20ppm kanamycin. Nuôi cấy lắc 120 rpm, ở 30oC trong 24 giờđể tạo giống cấp hai (được sử dụng trong thí nghiệm này).
Chương 2: Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ
Tiến hành pha loãng dung dịch HHL (N-hexanoyl homoserine lactone) từ
nồng độ 2500 mg/l thành các nồng độ 10; 5; 2,5; 1; 0,5 ppm.
Nhỏ 50µl canh khuẩn CV026 (tương ứng với nồng độ 109 CFU/ml) lên mỗi
đĩa BHIA. Dùng que cấy tam giác trải đều dịch khuẩn trên đĩa rồi để khô.
Sử dụng 3 x 10µl dung dịch HHL ở các nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ nhỏ
vào ba vị trí trên đĩa BHIA đã trang sẵn dịch khuẩn CV026. Để trong tủ cấy vô trùng cho đến khi khô, ủ trong 24 giờở nhiệt độ 30oC.
Sau khi ủ 24 giờ, trên đĩa xuất hiện ba vòng tròn sắc tố violacein tương ứng tại ba vị trí đã nhỏ dung dịch HHL (Hình 2.2). Tiến hành đo đường kính của các vòng sắc tố, và xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa ln[HHL] và đường kính
đường sắc tố violacein (mm) (lấy giá trị trung bình của ba giá trịđo được).
Hình 2.2. Các vòng sắc tố violacein tiết ra bởi vi khuẩn CV026 khi có sự hiện diện của phân tử HHL.
Đánh giá khả năng phân hủy HHL theo các mức độ sau đây
9 Phân hủy mạnh (+++): 0≤ [HHL] < 0,5ppm
9 Phân hủy trung bình (++): 0,5 ppm ≤ [HHL] < 2ppm
9 Phân hủy yếu (+): 2ppm ≤ [HHL] < 4ppm
9 Không phân hủy (-) : 4ppm ≤ [HHL] ≤ 5 ppm
2.4.3.2 Khảo sát đặc tính phân hủy HHL của các chủng vi khuẩn phân lập ở điều kiện in vitro
Chọn một khuẩn lạc trên đĩa BHIA (đối với mỗi chủng), cấy chuyền sang các erlen chứa 10ml dung dịch BHI, ủ trong 24 giờ, 300C để tạo giống cấp hai.
Từ các giống cấp hai này, tiến hành đo mật độ quang của dịch khuẩn ở bước sóng 600nm (OD 600).
Mật độ vi khuẩn được xác định theo công thức: 1,02 x 109 x OD600 (CFU/ml) (công thức Mc Fahrland).
Từ mật độ vi khuẩn xác định được, tính toán thể tích cần thiết cấy vào các erlen chứa 10ml dung dịch BHI đểđạt mật độ 2x107 CFU/ml.
Bổ sung vào mỗi erlen 5ppm dung dịch HHL. Sử dụng một erlen đối chứng, chỉ chứa HHL mà không bổ sung vi khuẩn. Tất cả erlen được đặt trong tủ ấm lắc ở
tốc độ 120 rpm trong 24 giờở 300C.
Sau đó lấy 3x 10µl dịch nổi nhỏ lên bề mặt đĩa BHIA đã tráng sẵn 50µl dịch vi khuẩn CV026 đã chuẩn bị trước đó 24 giờ. Đem ủở 30oC trong 24 giờ.
Sau thời gian ủ, đo đường kính các vòng tròn violacein và dựa vào đường chuẩn đã thiết lập để tính toán nồng độ HHL còn lại trong môi trường.
2.4.4 Khảo sát đặc tính đối kháng với Edwardsiella ictaluri trong điều kiện in vitro
2.4.4.1 Phương pháp đường vuông góc (Cross Streak)
Các chủng vi khuẩn phân lập được bảo quản ở –80oC, được cấy chuyền sang
đĩa chứa môi trường BHIA và ủở 30oC trong 24 giờđể tạo giống cấp một.
Chọn một khuẩn lạc trên đĩa BHIA (đối với mỗi chủng), cấy chuyền sang các erlen chứa 10ml dung dịch BHI, ủ trong 24 giờở 300C để tạo giống cấp hai.
Tiến hành đo mật độ quang của dịch khuẩn ở bước sóng 600nm (OD600) và
điều chỉnh về mật độ vi khuẩn là 2×107 CFU/ml.
Dùng tâm bông cấy vi khuẩn đã được chọn lọc thành một đường thẳng trên
đĩa thạch BHIA, ủ 24 giờ, nhiệt độ 30oC.
Tương tự với vi khuẩn Edwardsiella ictaluriđược bảo quản ở -800C, được cấy chuyền trên đĩa thạch máu ủ trong 24 giờở 300C để tạo giống cấp một.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ
Chọn khuẩn lạc để nuôi cấy trong 10ml BHI, ủ trong 24 giờ ở 300C để tạo giống cấp hai. Đo OD, điều chỉnh nồng độ vi khuẩn về mật độ vi khuẩn 2×108 CFU/ml.
Tiếp tục cấy vi khuẩn gây bệnh Edw. ictaluri thành bốn đường vuông góc cách với đường đã cấy vi khuẩn cần khảo sát khoảng 1mm. Sau đó ủ ở 300C trong 24 giờ, và tiến hành đo khoảng cách kháng khuẩn. Nếu các chủng vi khuẩn tạo thành
đường kháng khuẩn có khoảng cách kháng khuẩn gấp hai lần so với đường kính của vi khuẩn phân lập mọc được xem là chủng đối kháng mạnh [40], [70], [75].
a. Không có đối kháng b. Có đối kháng Hình 2.3. Phương pháp đường vuông góc.
2.4.4.2 Phương pháp thạch khuếch tán (modified agar well-diffusion method)
Phương pháp này dựa theo tác giả Hai và ctv. (2007) [75], và được bổ sung và
điều chỉnh bởi TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh (2007) [136], Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II
Dùng 50 µl dịch vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có mật độ tế bào 2x108 tráng lên môi trường BHIA. Sau khi tráng đĩa lật úp đĩa và để trong tủ cấy khoảng 15 phút cho khô. Sau đó dùng ống sắt hình trụ (tiệt trùng bằng cách nhúng cồn rồi hơ
trên lửa và làm nguội thật kỹ) khoan ba lỗ (đường kính 8mm) trên đĩa thạch. Các khối thạch sau khi đục được lấy ra và bỏđi để tạo thành các giếng.
Khoảng đối kháng với vi khuẩn E. ictaluri E. ictaluri Vi khuẩn khảo sát Vi khuẩn khảo sát E. ictaluri
Các đĩa tráng vi khuẩn cần khảo sát có mật độ tế bào 2x10 , đã ủ trong 24 giờ
trước, ở nhiệt độ 300C. Chọn những vùng khuẩn lạc mọc dày và đều, dùng ống sắt hình trụ tiệt trùng khoan ba khối thạch từ mỗi đĩa.
Dùng nhíp tiệt trùng gắp các khối thạch có chứa vi khuẩn khảo sát và đặt vào các giếng đã trải Edwardsiella ictaluri.
Tiến hành quan sát sự tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh các khối thạch sau khi ủ 24 giờ. Các chủng vi khuẩn tạo vòng kháng khuẩn có đường kính d ≥12mm
được cho là đối kháng mạnh (+++) ; 7mm ≤ d < 12mm : đối kháng trung bình (++) ; 0< d < 7mm: đối kháng yếu (+); d = 0mm:không đối kháng (-).
2.4.4.3 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán (Disc-diffusion method) [40], [75].
Dùng 50µl dịch vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cấp hai có mật độ vi khuẩn là 2×108 CFU/ml để tráng trên đĩa BHIA. Sau khi tráng đĩa, lật úp đĩa trong vòng 15 phút đợi đĩa khô.
Dùng 1ml dịch vi khuẩn khảo sát có mật độ tế bào 109 cho vào eppendorf đem ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút. Thu dịch nổi và lọc qua màng lọc vi khuẩn 0,22µm (Millipore, USA).
Đặt vào dịch nổi của mỗi dòng vi khuẩn ba đĩa giấy, ngâm trong 15 phút cho các chất có trong dịch nổi thấm vào đĩa giấy.
Sau đó dùng nhíp gắp các đĩa giấy ra và đặt lên ba vị trí khác nhau của mỗi đĩa thạch đã tráng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Ủ 300C trong 24 giờ, tiến hành đo
đường kính vòng kháng khuẩn.
2.4.4.4 Phương pháp BLIS (Bacteriocin-like inhibitory substance)
Cấy vi khuẩn khảo sát có mật độ tế bào 2x107 thành một đường thẳng trên môi trường BHIA. Ủở nhiệt độ 300C trong 24 giờ.
Dùng lam có dán lớp băng keo trong gạt bỏ lớp sinh khối vi khuẩn. Sau đó lật úp đĩa trên một lớp bông thấm có chứa dung dịch chloroform (CCl4) trong thời gian 30 phút để diệt tế bào vi khuẩn còn sót lại trên môi trường. Sau đó lật ngửa đĩa lại và đợi khoảng 15 phút cho dư lượng Chloroform bay hơi hết.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ
Tiếp tục cấy vi khuẩn gây bệnh Edw. ictaluri thành bốn đường vuông góc với
đường đã cấy vi khuẩn cần khảo sát, ủ ở 300C trong 24 giờ, tiến hành đo khoảng cách kháng khuẩn [40], [70], [75].
.
Hình 2. 4. Cách làm chết vi khuẩn bằng chloroform
2.4.5 Thử khả năng gây bệnh cho người và động vật [15], [126].
Để đảm bảo tính an toàn cho người và vật chủ, tiến hành thử khả năng sinh hemolysin của một số vi khuẩn đã được chọn lọc nhằm loại bỏ những chủng có tiềm năng gây bệnh cho người và động vật.
Nguyên tắc: Vi khuẩn có tiềm năng gây bệnh cho người và động vật có khả
năng sinh enzyme hemoglysin làm tan máu (dung huyết) khi cấy trên môi trường thạch có bổ sung 5% máu cừu. Có ba dạng dung huyết:
- α: Dung huyết không hoàn toàn, môi trường nơi khuẩn lạc mọc có màu hơi xanh.
- β: Dung huyết hoàn toàn, môi trường xung quanh và phía dưới vùng khuẩn lạc mọc có màu sáng trong.
- γ : Không dung huyết, môi trường không đổi màu. Cách tiến hành
Các chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn bảo quản ở –80oC, được cấy chuyền sang đĩa BHIA và ủở 30oC trong 24 giờđể tạo giống cấp một. Chọn một khuẩn lạc trên đĩa BHIA (đối với mỗi chủng), cấy sang môi trường BA, ủở 300C trong 48 giờ.
Chọn lọc các chủng không dung huyết γ (không có tiềm năng gây bệnh cho người và động vật) và loại bỏ các chủng có khả năng dung huyết α, β (có tiềm năng gây bệnh cho người và động vật).
2.4.6 Thử khả năng đối kháng với một số chủng kiểm định
Hiện nay các loài vi sinh vật gây bệnh quan trọng trên đối tượng thủy sản bao gồm Edwardsiella ictaluri, một số loài gây bệnh khác thuộc chi Vibrio như: V. harveyi, V. paraheamolyticus, V. alginolyticus, và Aeromonas hydrophila. Do đó, thử khả năng đối kháng là tiêu chí cần thiết trong việc chọn lọc các chủng vi khuẩn làm probiotic.
Sử dụng phương pháp thạch khuếch tán và đường vuông góc để kiểm tra khả
năng đối kháng tương tự phần 2.4.4.1 và 2.4.4.2.
2.4.7 Thử nghiệm các đặc tính sinh học in vitro của các chủng vi khuẩn đã
được tuyển chọn
2.4.7.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của vi khuẩn tuyển chọn Mục tiêu: Tìm nhiệt độ tối ưu thích hợp cho sự phát triển của từng chủng vi khuẩn đã được chọn lọc và thích ứng với môi trường nuôi trồng thủy sản.
Cách tiến hành
Tiến hành nhân giống cấp một và cấp hai của các chủng vi khuẩn khảo sát. Chuẩn bị các ống nghiệm chứa môi trường BHI
Đo mật độ quang của dịch vi khuẩn ở bước sóng 600nm (OD 600) và điều chỉnh về nồng độ 106 cfu/ml
Ủở các nhiệt độ: 20, 25, 30, 35, 40 (0C), trong 24 giờ
Đo mật độ quang của dịch khuẩn ở bước sóng 600nm (OD 600) để xác định mật độ tế bào
Mật độ vi khuẩn được xác định theo công thức: 1,02 x 109 x OD600 (CFU/ml) (công thức Mc Fahrland)
Chương 2: Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ
Mục tiêu: Tìm khoảng pH tối ưu thích hợp nhất cho sự phát triển của từng chủng vi khuẩn đã được chọn lọc và khoảng pH thích hợp trong môi trường nuôi trồng thủy sản
Cách tiến hành
Tiến hành nhân giống cấp một, cấp hai của các chủng vi khuẩn khảo sát. Chuẩn bị các ống nghiệm chứa môi trường BHI và điều chỉnh pH bằng dung dịch HCl 1M và NaOH 1M về các giá trị sau: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10
Đo mật độ quang của dịch vi khuẩn ở bước sóng 600nm (OD 600) điều chỉnh về nồng độ 106 cfu/ml
Nuôi cấy lắc 120 rpm ở 300C, 24 giờ
Đo mật độ quang của vi khuẩn ở bước sóng 600nm (OD 600) để xác định mật
độ tế bào vi khuẩn
2.4.7.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên sự tăng trưởng của vi khuẩn tuyển chọn
Mục tiêu: Tìm nồng độ muối tối thích cần thiết cho sự phát triển của các chủng vi khuẩn đã được chọn lọc phù hợp với môi trường nuôi trồng thủy sản.
Cách tiến hành
Tiến hành nhân giống cấp một và cấp hai của các chủng vi khuẩn khảo sát Chuẩn bị các ống nghiệm chứa môi trường LB có bổ sung NaCl tương ứng với các nồng độ muối sau: 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%.
Đo mật độ quang của dịch vi khuẩn ở bước sóng 600nm (OD 600) điều chỉnh về nồng độ 106 cfu/ml.
Nuôi cấy lắc 120 rpm, 300C, 24 giờ.
Tiến hành đo mật độ quang của dịch khuẩn ở bước sóng 600nm (OD 600) để
xác định mật độ tế bào vi khuẩn.
2.4.7.4 Khả năng chịu pH dạ dày [7], [77], [99]
Mục tiêu: Tìm những chủng có khả năng chịu đựng pH dạ dày thích hợp sử
Tiến hành nhân giống cấp một, cấp hai của các chủng vi khuẩn khảo sát Chuẩn bị các ống nghiệm chứa môi trường BHI và dùng HCl 1M để điều chỉnh pH về các giá trị 2, 3
Đo mật độ quang của dịch vi khuẩn ở bước sóng 600nm (OD 600) và điều chỉnh về nồng độ 106 cfu/ml.
Nuôi cấy lắc ở tốc độ 120 rpm, ủ 300C.
Kiểm tra mật độ tế bào ở các thời điểm sau: 0, 1, 2, 3, 6, 12, 24 giờ.
Tại các thời điểm trên, lấy 1ml dịch vi khuẩn li tâm 10.000 rmp/10 phút, thu phần cặn rắn, dùng NaCl 0,9% rửa phần cặn rắn thu được cho đến khi sạch acid (ba lần).
Pha loãng đến nồng độ thích hợp 10-1,10-2, 10-3. . .trong dung dịch NaCl 0,9%.