[18], [36]
Mẫu vi khuẩn sau khi định danh bằng các phản ứng sinh hóa tiếp tục được gửi
Nguyên tắc của phương pháp PCR: Tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn nhờ đoạn mồi chuyên biệt, mồi xuôi và mồi ngược; mồi xuôi bổ sung cho
đầu 5’ của gen 16S rRNA , mồi ngược bổ sung cho đầu 3’ gen 16S rRNA và DNA polymerase [3], [36].
Mồi xuôi: EGE1: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ Mồi ngược: EGE2: 5’CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’
Cách tiến hành
Tách chiết DNA [36].
Cấy ria vi khuẩn khảo sát được bảo quản ở -800C trên môi trường BHIA, ủ
300C, 24 giờđể tạo giống cấp một
Lấy sinh khối vi khuẩn cho vào ống axygen có chứa 200 μl TE 1x (pH8) Trích ly DNA của vi khuẩn bằng phương pháp sốc nhiệt
Đo nồng độ DNA (25-500ng/phản ứng) bằng máy Biophotometer Khuếch đại gen 16s rRNA 16s bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
Lấy 5μl cho phản ứng PCR để khuếch đại đặc hiệu đoạn DNA dài 500bp trên vùng gen 16s rRNA của vi khuẩn bằng hệ thống máy PCR Thermal cycler của Bio- Rad
Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2%, Chụp hình bằng hệ thống máy Gel Doc của Bio-Rad
Tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ QIA quick PCR Purification kit
Điện di sản phẩm đã tinh sạch bằng hệ thống máy Agilent 2100 Bioanalyzer PCR SEQ sản phẩm đã tinh sạch bằng Big Dye Terminater V3.1 Cycle Sequencing kit của AB applied biosystems trước khi giải trình tự trên hệ thống máy ABI 3130XL
Phân tích kết quả bằng phần mềm sequencing analysis 5.3 và so với kết quả
trên ngân hàng gen
Chương 2: Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ
Tiến hành khảo sát tính tương thích của các chủng vi khuẩn chọn lọc bằng phương pháp thạch khuếch tán.
Dùng 50µl dịch vi khuẩn tuyển chọn thứ nhất có mật độ tế bào 2x108, để tráng trên đĩa BHIA. Sau khi tráng đĩa, lật úp đĩa trong vòng 15 phút đợi đĩa khô. Sau đó dùng ống sắt hình trụ (tiệt trùng bằng cách nhúng cồn rồi hơ lên ngọn lửa nguội thật kỹ) khoan 3 lỗ trên mỗi đĩa thạch, dùng nhíp đã tiệt trùng gắp bỏ các khối thạch để
tạo thành các giếng
Cấy trải dịch vi khuẩn tuyển chọn thứ 2, 3, 4. . . có mật độ tế bào 2x108 trên môi trường BHIA, ủở 30OC trong 24 giờ. Dùng ống sắt hình trụđã tiệt trùng khoan 3 lổ trên mỗi đĩa thạch, dùng nhíp đã tiệt trùng gắp các khối thạch bỏ vào mỗi giếng bên đĩa đã tráng vi khuẩn tuyển chọn thứ nhất
Đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30OC. Sau đó tiến hành đo đường kính vòng vô khuẩn sau 24 giờ
Hình 2.5. Thử khả năng tương thích bằng phương pháp thạch khuếch tán. Các chủng vi khuẩn không tạo thành các vòng vô khuẩn xung quanh các khối thạch sau 24 giờ nuôi cấy được xem là có khả năng tương thích lẫn nhau. Các chủng này có thểđược phối trộn tạo hỗn hợp probiotic.
2.5 Xử lý kết quả
Kết quảđược xử lý thống kê ANOVA và phần mềm Microsoft excel với độ tin cậy p < 0,05. Kết quả trình bày gồm giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Chủng
Chủng Chủng
CHƯƠNG 3
Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn Thạc sĩ
3.1 Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu AHL ở vi khuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Edwarsiella ictaluri
3.1.1 Số lượng dòng vi khuẩn thu được qua các đợt phân lập
Bảng 3.1. Số lượng dòng vi khuẩn thu được sau khi nuôi cấy trong môi trường chứa hỗn hợp phân tử AHL Đợt thu mẫu Ngày tháng Địa điểm thu mẫu Loại mẫu Tổng số mẫu các loại Số dòng vi khuẩn Tổng số Đợt I 14-16/12/2009 Vĩnh Long Tiền Giang Đồng Tháp
Hệ tiêu hóa cá tra thịt 11 46 73 Hệ tiêu hóa cá tra giống 20 27
Đợt II 6-8/4/2010 Vĩnh Long Tiền Giang Đồng Tháp Trà Vinh
Hệ tiêu hóa cá tra thịt 26 53 231 Hệ tiêu hóa cá tra giống 28 69 Bùn đáy ao nuôi cá tra 27 27 Nước ao nuôi cá tra 27 82
Đợt
III 11/5/2010
Đồng Tháp Vĩnh Long
Hệ tiêu hóa cá tra thịt 5 19 66 Bùn đáy ao nuôi cá tra 14 47
Đợt
IV 10-12/8/2010
Đồng Tháp Vĩnh Long An Giang
Hệ tiêu hóa cá tra thịt 33 34 188 Hệ tiêu hóa cá giống 11 21 Bùn đáy ao nuôi cá tra 18 54 Nước ao nuôi cá tra 29 79
Tổng số mẫu và dòng vi khuẩn 249 558 558 Quá trình phân lập được tiến hành trong môi trường bao gồm nước muối sinh
lý (NaCl 0,9%) có bổ sung 5ppm hỗn hợp phân tử AHL, qua bốn chu kỳ. Hỗn dịch thu được ở cuối chu kỳ 4 được tiến hành cấy trải trên môi trường BHIA để tuyển chọn sơ bộ dựa vào đặc điểm hình thái của khuẩn lạc.
Từ 249 mẫu thu được ban đầu, chúng tôi tiến hành phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu ”Quorum sensing” trong môi trường chỉ có hỗn hợp phân tử tín hiệu AHL là nguồn nitrogen và cacbon duy nhất. Qua bốn đợt phân lập
3.1.2 Biến động giá trị pH của hỗn dịch vi khuẩn trong quá trình phân lập
Đồ thị 3.1. Biến động giá trị pH của hệ vi sinh từ các mẫu phân lập khác nhau qua bốn chu kỳ.
Qua đồ thị 3.1 thể hiện sự biến động giá trị pH trong môi trường phân lập chứng tỏ có sự phân cắt vòng lactone qua 4 chu kỳ. Giá trị pH của mẫu đối chứng (gồm nước muối sinh lý có bổ sung 5ppm hỗn hợp phân tử tín hiệu AHL) qua 4 chu kỳ vẫn nằm trong ngưỡng thích hợp (< 7,5) để không diễn ra sự phân hủy hóa học đối với phân tử AHL. Nhìn chung giá trị pH của các mẫu tăng qua bốn chu kỳ và tương đối ổn định ở chu kỳ ba và bốn. Trong đó, giá trị pH trung bình của hệ vi sinh mẫu nước là (6,69 ± 0,22) và mẫu bùn là (5,71± 0,29) và các mẫu vi sinh của hệ tiêu hóa cá tra thịt là (4,62 ± 0,7) và cá tra giống là (3,88 ± 0,48). Qua chu kỳ 3 và 4, hầu hết giá trị pH của các hệ vi sinh vật không có sự khác biệt và có pH dao động trong khoảng từ 5,98 đến 7,02.
Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn Thạc sĩ
3.1.3 Biến động mật độ quang của các hỗn hợp vi khuẩn qua quá trình phân lập
Đồ thị 3.2. Biến động mật độ quang của các hỗn hợp vi khuẩn trong các hỗn hợp vi sinh vật từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, nước và bùn ao nuôi cá tra qua bốn chu kỳ.
Dựa vào đồ thị 3.2 nhận thấy ở cuối chu kỳ 1, mật độ vi khuẩn ở các mẫu dao động khá cao, trong đó mật độ vi khuẩn thu từ hệ tiêu hóa cá tra thịt (OD: 0,840 ± 1,15) cao khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) so với mật độ vi khuẩn thu từ hệ tiêu hóa cá tra giống (OD: 0,580 ± 0,38), nước (OD: 0,41 ± 0,34) và bùn (OD: 0,30 ± 0,22). Đến cuối chu kỳ 3 thì không còn sự khác biệt về mật độ vi khuẩn giữa các mẫu (p>0,05), nhưng đến cuối chu kỳ 4 có sự khác biệt về mật độ vi khuẩn giữa mẫu nước và mẫu bùn so với mẫu thu từ hệ tiêu hóa cá tra thịt. Mật độ vi khuẩn giảm dần qua các chu kỳ phân lập chứng tỏ đã xảy ra sự chọn lọc các chủng vi khuẩn thật sự có khả năng phân hủy phân tử AHL.
3.1.4 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc sau quá trình phân lập
Quá trình phân lập được tiến hành trên môi trường BHIA. Vi khuẩn phát triển trên môi trường này tạo thành nhiều loại khuẩn lạc có hình dạng và màu sắc khác
Màu sắc: Màu trắng trong, trắng đục, vàng trong có ánh kim, màu vàng đậm, màu vàng nhạt, màu đỏ gạch . . .
Hình dạng: Khuẩn lạc rất đa dạng về hình dạng như
9 Rìa khuẩn lạc có các dạng: Tròn đều, không đều hoặc có răng cưa . . .
9 Bề mặt: Trơn nhẵn, gồ ghề, hoặc có tâm nhô cao, khô hoặc ướt . . . (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.1. Hình thái các khuẩn lạc phân lập từ mẫu nước ở cuối chu kỳ 4 (a) và mẫu bùn ở cuối chu kỳ 4 (b) trên môi trường BHIA.
3.2 Khả năng phân hủy phân tử HHL bởi các dòng vi khuẩn đã được chọn lọc
Bảng 3.2. Khả năng phân hủy HHL của những dòng vi khuẩn đã được phân lập
Tên mẫu
Số lượng Số dòng vi khuHHL ẩn phân hủy Tỉ lệ dòng vi khuẩn phân hủy HHL (%) Mẫu phân lập Dòng vi khuẩn Mạnh Trung bình Yếu Không phân hủy
Hệ tiêu hóa cá tra thịt 61 152 6 13 23 110 27,63 Hệ tiêu hóa cá tra giống 58 117 5 12 17 83 29,06 Bùn đáy ao nuôi cá tra 70 128 5 14 10 99 22,66 Nước ao nuôi cá tra 60 161 2 7 14 138 14,29
Tổng 249 558 18 46 64 430 22,94
Tỉ lệ % 3,23 8,24 11,47 77,06
Chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng phân hủy HHL từ 558 dòng vi khuẩn đã phân lập, dựa vào phương trình đường chuẩn y = 9,352x + 11,19 (R2= 0,999). Chúng tôi thu được 18 dòng có khả năng phân hủy HHL mạnh (chiếm 3,23%), 46 dòng có khả năng phân hủy HHL trung bình (chiếm 8,24%), 64 dòng có khả năng
b a
Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn Thạc sĩ
phân hủy HHL yếu (chiếm 11,47%) và 430 dòng không phân hủy (chiếm 77,06%). Tỉ lệ dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy HHL tập trung nhiều nhất ở mẫu cá giống (29,06%), tiếp theo là mẫu cá thịt (27,63%), mẫu bùn (22,66%) và cuối cùng là mẫu nước (14,29%).
Theo tiêu chí sàng lọc, chúng tôi chọn 64 dòng vi khuẩn gồm 18 dòng có khả năng phân hủy HHL mạnh và 46 dòng có khả năng phân hủy HHL trung bình để tiến hành các bước sàng lọc tiếp theo.
3.3 Khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Edwardsiella ictaluri 3.3.1 Phương pháp thạch khuếch tán 3.3.1 Phương pháp thạch khuếch tán
Từ 64 dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy HHL, tiến hành kiểm tra sơ bộ khả năng đối kháng bằng phương pháp thạch khuếch tán. Kết quả được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
bằng phương pháp thạch khuếch tán Ký hiệu dòng vi khuẩn Khả năng đối kháng Ký hiệu dòng vi khuẩn Khả năng đối kháng Ký hiệu dòng vi khuẩn Khả năng đối kháng Đường kính vòng kháng khuẩn Mức độđối kháng Đường kính vòng kháng khuẩn Mức độđối kháng Đường kính vòng kháng khuẩn Mức độđối kháng T1DT1.1 05,00±0,00 + G2DT1.1 07,67±0,29 ++ B3TVL11.3 00,00±0,00 - T1DT1.4.1 09,67±1,53 ++ G2DT1.4 17,70±2,00 +++ B3TVL4.1 12,33±0,60 +++ T1DT1.4.2 10,30±3,46 ++ G2DT1.7 14,00±0,00 +++ B4GDT11.1 00,00±0,00 - T1DT101 16,00±1,00 +++ G2DT1.7.1 09,00±1,00 ++ B4GVL6.2 00,00±0,00 - T1DT103 28,00±5,30 +++ G2DT1.8.1 12,70±1,20 +++ B4TAG19A 16,67±1,20 +++ T1DT11c 05,50±1,30 + G2DT12.1 00,00±0,00 - B4TAG23a1 08,70±0,60 ++ T1DT203 03,50±1,80 + G2DT15.2 10,33±0,29 ++ B4TDT12.1 08,33±0,58 ++ T1TG303 04,00±2,50 + G2TG1.1 00,00±0,00 - B4TDT12.4 34,67±1,53 +++ T1VL402 06,67±1,20 + G2TG103 05,00±0,00 + B4TDT12.5 27,00±1,00 +++ T2TG1.1 08,80±0,00 ++ G2VL1.2 10,67±1,53 ++ B4TVL3.2 15,00±1,73 +++ T2TG2 08,20±1,20 ++ G2VL1.4.2 04,7±1,00 + B4TVL6.1 08,33±1,53 ++ T2TG601 07,70±1,20 ++ G2VL1.8b 00,00±0,00 - N2GDT102 03,67±0,58 + T2TV301 05,00±2,50 + G2VL502 12,33+5,51 +++ N2GDT501 00,00±0,00 - T2TV701 00,00±0,00 - G4AG23.2 06,00±0,00 + N2GTG102 05,67±1,20 + T3VL1.3 06,50±1,00 + B2GTG301 00,00±0.00 - N2GVL804 22,00±0,00 +++ T3VL17.3 04,33±1,50 + B2GVL301 05,30±1,00 + N2TDT103 00,00±0,00 - T4AG25.1 05,35±1,00 + B2TTG201 00,00±0,00 - N4GVL6.1 00,00±0,00 + T4VL1.2 06,50±0,50 + B3GDT1.4 00,00±0,00 - N4TAG22a1 32,00±1,00 +++ TA4TDT25.1 05,30±0,50 + B3TDT12.1 17,00±1,00 +++ N4TDT13.1 06,50±0,00 + G1DT102 08,67±0,58 ++ B3TDT4.1 32,00±1,60 +++ N4TVL3.1 00,00±0,00 - G1DT203 06,50±1,00 + B3TDT7.1 05,67±1,53 + G1TG5b 06,00±1,80 + B3TVL102 00,00±0,00 -
Từ 64 dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy HHL, chúng tôi tiến hành thử khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh trên cá tra Edw. ictaluri. Kết quả thu được 15 dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh (chiếm 23,44%), 13 dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng trung bình (chiếm 20,31%), 20 dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng yếu (chiếm 31,25%) và 16 dòng vi khuẩn còn lại không có khả năng đối kháng chiếm (25,00%).
Bảng 3.4. Tỉ lệ % mẫu có khuẩn lạc đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
Tên mẫu Số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy HHL
Số dòng vi khuẩn đối kháng Edw. ictaluri Tỉ lệ dòng vi khuẩn đối kháng (%) Không đối kháng (d=0) Đối kháng yếu (0<d<7) Đối kháng trung bình (7≤d<12) Đối kháng mạnh (d≥12)
Hệ Tiêu hóa cá tra thịt 19 1 11 6 1 94,74 Hệ tiêu hóa cá tra giống 17 4 4 4 5 76,47 Bùn đáy ao nuôi cá tra 19 7 2 3 7 63,16 Nước ao nuôi cá tra 9 4 3 0 2 55,56 Tổng số dòng vi khuẩn 64 16 20 13 15
Tỉ lệ % 25,00 31,25 20,31 23,44 Dựa vào kết quả bảng 3.4 cho thấy những dòng vi khuẩn thu từ hỗn hợp hệ vi sinh vật hệ tiêu hóa cá tra thịt có khả năng đối kháng với Edw. ictaluri chiếm tỉ lệ cao nhất (94,74%), tiếp theo là những dòng vi khuẩn thu từ hỗn hợp hệ vi sinh vật hệ tiêu hóa cá tra giống (chiếm 76,47%), kế đến là những dòng vi khuẩn thu từ hỗn hợp hệ vi sinh vật bùn đáy ao nuôi cá tra (chiếm 63,16%), sau cùng là những dòng vi khuẩn từ nước ao nuôi cá tra (chiếm 55,56%). Điều này chứng tỏ những dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn Edw. ictaluri xuất hiện nhiều với tần xuất cao trong hệ tiêu hóa cá tra.
Chúng tôi chọn được 28 dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn
Edw. ictaluri (bao gồm 15 dòng vi khuẩn đối kháng mạnh và 13 dòng vi khuẩn đối kháng trung bình) để kiểm tra lại khả năng đối kháng bằng các phương pháp khác nhau.
Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn Thạc sĩ
3.3.2 Các phương pháp khác
Từ 28 dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng đã được kiểm tra sơ bộ bằng phương pháp thạch khuếch tán, chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp đường vuông góc, phương pháp đĩa giấy khuếch tán, phương pháp BLIS.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.2. Thử khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn khảo sát bằng phương pháp đường vuông góc (a), thạch khuếch tán (b), đĩa giấy khuếch tán (c), BLIS (d).
a b
Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng với Edw. ictaluri bởi các dòng vi khuẩn khảo sátbằng bốn phương pháp
Số thứ tự Ký hiệu dòng vi khuẩn Phương pháp kiểm tra khả năng đối kháng
Đường vuông góc Thạch khuếch tán Đĩa giấy khuếch tán BLIS 1 T1DT1.4.1 32,00 ±1,00 09,67 ±1,53 04,00 ±0,00 11,33 ±1,15 2 T1DT1.4.2 37,70 ±1,00 11,30 ±3,46 00,00 ±0,00 23,00 ±6,93 3 T1DT101 19,00 ±1,63 16,00 ±1,00 12,33 ±1,53 17,00 ±1,00 4 T1DT103 31,00 ±2,83 28,00 ±5,30 25,00 ±1,73 00,00 ±0,00 5 T2TG1.1 8,67 ±0,58 08,80 ±0,00 04,50 ±0,50 07,00 ±1,00 6 T2TG2 8,67 ±1,53 08,20 ±1,20 00,00 ±0,00 08,00 ±1,00 7 T2TG601 11,33 ±0,58 07,70 ±1,20 02,67 ±1,15 06,00 ±1,00 8 G1DT102 10,00 ±2,00 09,67 ±0,58 08,33 ±1,53 00,00 ±0,00 9 G2DT1.1 09,33 ±1,20 07,67 ±0,29 04,00 ±1,00 07,33 ±1,15 10 G2DT1.4 20,33 ±1,25 17,70 ±2,00 09,00 ±1,73 00,00 ±0,00 11 G2DT1.7 18,33 ±0,58 14,00 ±0,00 12,00 ±2,00 14,00 ±0,00 12 G2DT1.7.1 10,67 ±1,53 09,00 ±1,00 02,67 ±0,58 07,33 ±1,15 13 G2DT1.8.1 29,00 ±5,20 12,70 ±1,20 08,67 ±1,15 12,67 ±1,53 14 G2DT15.2 17,67 ±3,21 10,83 ±0,29 00,00 ±0,00 00,00 ±0,00 15 G2VL1.2 09,67 ±2,08 10,67 ±1,53 00,00 ±0,00 03,00 ±1,00 16 G2VL502 17,00 ±1,00 12,33 ±5,51 04,00 ±1,00 07,00 ±1,73 17 B3TDT12.1 17,67 ±0,58 17,00 ±1,00 11,00 ±1,00 12,00 ±1,00 18 B3TDT4.1 33,67 ±1,53 32,00 ±1,60 14,00 ±1,00 17,33 ±0,94 19 B3TVL4.1 14,33 ±0,58 12,33 ±0,60 00,00 ±0,00 00,00 ±0,00 20 B4TAG19A 30,33 ±2.08 16,67 ±1,20 13,00 ±1,00 22,67 ±2,31 21 B4TAG23a1 16,00 ±0,82 08,67 ±0,60 02,00 ±1,00 08,33 ±0,58 22 B4TDT12.1 09,00 ±1,00 08,33 ±0,58 00,00 ±0,00 09,67 ±1,53 23 B4TDT12.4 37,00 ±2,00 34,67 ±1,53 22,67 ±3,21 27,33 ±3,06 24 B4TDT12.5 38,93 ±1,53 27,00 ±1,00 09,00 ±2,65 09,00 ±1,00 25 B4TVL3.2 21,33 ±1,89 15,00 ±1,73 13,67 ±0,58 16,67 ±1,53 26 B4TVL6.1 07,89 ±1,53 08,33 ±1,53 02,67 ±0,58 06,67 ±1,53 27 N2GVL804 26,67 ±0,67 14,00 ±0,00 11,67 ±2,08 13,33 ±1,15 28 N4TAG22a1 32,00 ±2,60 32,00 ±1,00 00,00 ±0,00 23,33 ±1,15 Tổng số dòng vi khuẩn đối kháng 28 28 21 23
Giá trị trong bảng là giá trị trung bình của khoảng cách đối kháng (mm) ± độ lệch chuẩn.
Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn Thạc sĩ
Dựa vào bảng 3.5 cho thấy
9 Phương pháp đường vuông góc: Ở 28 dòng vi khuẩn có xuất hiện đường kháng khuẩn, kích thước đường kháng khuẩn dao động trong khoảng từ 8mm đến 38mm.
9 Phương pháp thạch khuếch tán: Ở 28 dòng vi khuẩn có xuất hiện đường kháng khuẩn, kích thước đường kháng khuẩn dao động trong khoảng từ 7mm đến 34mm.
9 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán: Ở 21 dòng vi khuẩn có xuất hiện đường