Bảng 1.2. Ảnh hưởng của probiotic lên sự phát triển của ấu trùng cá biển trong điều kiện in vitro
Probiotica Loài cá chủb Probiotic sử
dụng Ảnh hưởng lên vật chủ Tác giả L. plantarum Hippoglossus hippoglossus (ấu trùng và cá con) Thức ăn tươi vào nước nuôi, 106 cfu ml-1 trong 24h, 6 ngày Tế bào túi biểu bì tăng, tỉ lệ sống sót tăng sau 32 ngày Ottesen và Olafsen (2000) Streptococcus faecium, L. acidophilus, và Saccharomyce s cerevisiae Oreochromis niloticus (0.15 g) Thức ăn, ăn kiên 0.1% , 9 tuần Khả năng tăng trưởng tăng FCR giảm Lara-Flores và ctv. (2003)
B. circulans Labeo rohita
(0.83 g) Thức ăn, 1.5×103 cfu g-1, 60 ngày Khả năng tăng trưởng tăng, FCR giảm Ghosh và ctv. (2003)
Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ
Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng chế phẩm sinh học ảnh hưởng có lợi về mặt dinh dưỡng như: Khửđộc tố các hợp chất có hại tiềm ẩn trong thức ăn, làm biến tính các hợp chất khó tiêu hóa như ( kitin, tinh bột, protein, lipid) có trong thực phẩm bởi các emzyme phân giải như amylase và protease thêm vào đó probiotic cung cấp vitamine ( Biotin và vitamin B12), carotenoid, protein, các acid béo phân tử thấp và các acid béo cao phân tử không có khả năng tạo cholesterol (Highly polyunsaturated fatty acids-HPUFAs) như: Acid eicosapentanoic (EPA) và docohexaenoic (DHA) chúng rất cần thiết cho sự phát triển của cá [26], [147]. Trong các thí nghiệm in vivo, nhiều nghiên cứu đã chứng minh việc đưa probiotic vào khẩu phần ăn với liều lượng 103 đến 1012 cfu g-1 cho cá từ 30 đến 90 ngày tuổi. Kết quả thể hiện trong bảng 1.2 cho thấy probiotic kích thích sự phát triển như: Tăng tỉ lệ sống sót, tăng trọng, đặc biệt là tốc độ phát triển, nhưng tốc độ chuyển hóa thức ăn thấp. Một số nghiên cứu cho rằng việc bổ sung probiotic không ảnh hưởng có lợi cho sự tăng trưởng bởi vì tỉ lệ cho ăn thấp, thời gian cho ăn hạn chế, và phụ thuộc vào nguồn gốc chế phẩm sinh học [106], [142].
1.3.4.5 Sự hình thành quần thể trong ruột (Gut colonization )
Sự hình thành quần thể và khả năng bám của probiotic trong biểu mô dạ dày và màng nhầy ruột cá là cơ chế bảo vệ chống lại bệnh tật qua việc cạnh tranh với các thụ thể gắn kết, cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống (vị trí gắn kết trong hệ
tiêu hóa) hoặc oxy và tạo các hợp chất kháng khuẩn [26]. Thí nghiệm về vi khuẩn lactic được thực hiện bởi nhiều tác giả khác nhau [26], [60]). Gần đây người ta đã chứng minh rằng Lactobacillus plantarum có khả năng bám và hình thành quần thể
trong biểu mô ruột. Vi khuẩn lactic là loài duy nhất sử dụng khả năng bám đặc hiệu (manose-specific adhesins) cạnh tranh với những vi khuẩn gram âm khác và các thụ
thể trên bề mặt màng nhầy tế biểu mô ruột [29]. Hơn thế nữa sự hình thành quần thể
và khả năng bám của probiotic đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa và điều chỉnh hệ miễn dịch của vật chủ [85], [129]. Nhiều thông tin khác về khả năng bám và hình thành quần thể trong ruột cá được ghi nhận trong bảng 1.3. Một số loài vi
tại và tăng sinh trong biểu mô của ruột [110]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh vi khuẩn lactic (LAB) vẫn còn tồn tại trong ruột cá từ hai đến ba tuần sau khi thay đổi thức ăn có chứa vi khuẩn lactic [28], [86].
Bảng 1.3. Ảnh hưởng của probiotic lên sự hình thành quần thể và khả năng bám dính trong ruột cá Probiotic Loài chủb Probiotic sử dụng Thời gian probiotic tồn tại trong ruột (cfu g-1) Tác giả L. rhamnosus (ATCC 53103) O. mykiss (83 g) Thức ăn , 104 - 1011 cfu g-1, 14 ngày 105 – 1010 trong ruột, sau một tuần phát hiện nhưng biến mất sau hai tuần Nikoskela ine và ctv. (2003) L. rhamnosus JCM 1136 ( thức ăn sống) O. mykiss (75 g) Thức ăn, 109 – 1011 cfu g-1, 30 ngày 107 – 109ở bao tử 107 – 108ở ruột non Panigrahi và ctv. (2004) L. rhamnosus (Thức ăn sống, đông khô) O. mykiss (126 g) Thức ăn , 1011 g-1, 30 ngày 105 – 109 trong ruột, không phát hiện sau hai tuần Panigrahi và ctv. (2005) Carnobacterium maltaromaticum và C. divergens O. mykiss (25 g) Thức ăn, >107 cfu g-1, 14 ngày 107 dịch ruột, 105 – 106 thành ruột Kim và Austin (2006) Lactococcus lactis lactis, L. sakei Salmo trutta (70 g) Thức ăn, 106 cfu g-1, 14 ngày 105 – 107 trong ruột, và vẫn tồn tại sau hai tuần Balcázar và ctv. (2007d)
1.4 Cơ chế hoạt đông của hệ thống “ Quorum sensing” ở vi khuẩn gây bệnh
Trong thập kỷ gần đây, cụm từ “Quorum sensing” được nhắc đến như một quá trình thông tin giữa tế bào với tế bào trong quần thể vi khuẩn. Các phân tử tín hiệu “Quorum sensing” như AHL (N-acyl homoserin lactone) có liên quan đến quá trình
Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ
điều hòa các nhân tố gây độc ở nhiều vi khuẩn gây bệnh. Sự phá vỡ hệ thống “Quorum sensing” được xem là một liệu pháp mới chống lại bệnh nhiễm khuẩn trong nuôi trồng thủy sản.
1.4.1 Định nghĩa quá trình “Quorum sensing”
Vi khuẩn có thể giao tiếp với nhau và sử dụng các phân tử tín hiệu hóa học do chúng tiết ra, tiếp nhận và phản ứng đối với sự tích lũy của những phân tử tín hiệu này. Việc phát hiện các phân tử tín hiệu trong môi trường cho phép vi khuẩn phân biệt giữa các quần thể vi khuẩn mật độ thấp và mật độ cao, và kiểm soát việc biểu hiện gen đối với sự thay đổi về mật độ tế bào. Quá trình này gọi là “Quorum sensing”, cho phép một quần thể vi khuẩn kiểm soát có phối hợp sự biểu hiện gen của cả quần thể. Nhiều kiểu hình ở vi khuẩn được điều khiển bởi “Quorum sensing”, bao gồm sự cộng sinh, độc lực, sự sản xuất kháng sinh, sự tạo thành màng sinh học … [124].
Trong quần thể vi khuẩn tồn tại hai loại ngôn ngữ “Quorum sensing” là ngôn ngữ phổ biến và ngôn ngữđặc hiệu, cho phép vi khuẩn giao tiếp trong cùng một loài và giữa các loài. Quá trình “Quorum sensing” ở vi khuẩn gram âm được điều khiển bởi phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone (AHL) [67]. Ở vi khuẩn gram dương, quá trình “Quorum sensing” được điều khiển bởi các phân tử oligopeptide có chiều dài 5 đến 17 amino [101].
Phân tử AHL có liên quan đến các quá trình “Quorum sensing” ở các vi khuẩn gây bệnh gram âm ở người và thực vật, ví dụ như Pseudomonas aeruginosa [119],
Erwinia carotovora, Agrobacterium tumefaciens [151], Vibrio harveyi [96] và những vi khuẩn gây bệnh khác trên cá [35].
1.4.2 Hệ thống “Quorum sensing” của Edwardsiella spp.
Hệ thống “Quorum sensing” cũng được phát hiện ở nhóm vi khuẩn gây bệnh quan trọng trên cá, Edwardsiella spp. Han và ctv. (2009) xác định có bốn loại phân tử tín hiệu AHL (BHL, HHL, 3-oxo-HHL và một phân tử AHL chưa xác định rõ) liên quan đến độc lực của Edwardsiella tarda, tác nhân gây bệnh trên các loài cá
Nhóm nghiên cứu trên lại xác định bốn loại phân tử tín hiệu AHL nói trên cũng tồn tại ởEdwardsiella ictaluri, vi khuẩn gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) và bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở Việt Nam (theo thông tin từ nhóm nghiên cứu của của viện nghiên cứu và nuôi trồng thủy sản II ).
1.4.3 Sự phân hủy sinh học quá trình “Quorum sensing” của vi khuẩn gây bệnh bệnh
Khả năng phân hủy phân tử AHL phân bố rộng rãi trong quần thể vi khuẩn. Những enzyme có thể bẻ gãy phân tử AHL đã được phát hiện ở các loài vi khuẩn thuộc nhóm β-Proteobacteria [156], α-Proteobacteria và γ-Proteobacteria [139] cũng như ở một số loài thuộc nhóm vi khuẩn gram dương [49]. Những loài vi khuẩn này có thể khóa hệ thống “ Quorum sensing” của những loài vi khuẩn cạnh tranh để đạt
được ưu thế chọn lọc. Đó là trường hợp của những vi khuẩn sinh sống gần các vi khuẩn điều khiển quá trình tiết ra chất kháng sinh thông qua hệ thống “Quorum sensing” [115]. Quá trình phân hủy các hợp chất tín hiệu có thể được xúc tác bởi hai loại enzyme: AHL lactonase và AHL acylase. Bên cạnh đó, enzyme acylase của các sinh vật bậc cao cũng có thểức chế các phân tử AHL [153].
1.4.3.1 Enzyme AHL lactonase
Dong và ctv. (2000) sàng lọc hơn 500 chủng vi khuẩn thu từ thực địa và phòng thí nghiệm về hoạt tính ức chế phân tử AHL. Trong số này, 24 chủng cho các hoạt
động enzyme khác nhau trong việc phân hủy phân tử AHL. Enzyme chịu trách nhiệm cho việc phân hủy AHL (AiiA) được phân lập từ chủng vi khuẩn có hoạt tính cao nhất, chủng Bacillus 240B1. Enzyme ở dạng tinh khiết ở nồng độ 50 mg/l, làm giảm nồng độ của N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone từ 20 µM xuống khỏang 5 µM sau 10 phút. Khi chạy quang phổ ion hóa phun điện tử của sản phẩm thủy phân cho thấy enzyme AiiA có tác dụng mở vòng lactone để tạo thành N-(3- oxohexanoyl)-L-homoserine [50]. Những nghiên cứu tiếp theo cho thấy các gen mã hóa enzyme lactonase phân bố rộng rãi ở nhiều loài Bacillus [52]. Những enzyme
Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ
Bằng chứng đầu tiên cho thấy sựức chế bằng enzyme đối với phân tử AHL có thể được sử dụng như một biện pháp kiểm soát sinh học được báo cáo trong nghiên cứu của Dong và ctv. (2000). Trong nghiên cứu này, sự biểu hiện của enzyme AiiA
đối với vi khuẩn Erwinia carotovora làm giảm khả năng tiết enzyme phân hủy thành tế bào của vi khuẩn gây bệnh xuống chỉ còn 10% và hầu nhưức chếđược các triệu chứng bệnh thối củ ở những thực vật mẫn cảm. Trong một nghiên cứu in vivo
tiếp theo, Molina và ctv. (2003) thử nghiệm hiệu quả của việc sử dụng một chủng
Bacillus phân hủy AHL trong việc kiểm soát sinh học đối với bệnh ở thực vật. Chủng Bacillus này có thể làm giảm bệnh thối củ gây ra bởi Erwinia carotovora
xuống còn 15% và bệnh mụn cây ở cà chua gây ra bởi Agrobacterium tumefaciens
xuống còn 10%. Việc phân hủy phân tử AHL bởi chủng Bacillus bảo vệ hiệu quả
tương đương hoặc tốt hơn so với việc sản xuất kháng sinh bởi một chủng kiểm soát sinh học Pseudomonas chlororaphis. Hơn nữa, việc phân hủy các phân tử AHL không chỉ có tác dụng phòng bệnh mà còn có tác dụng trị bệnh. Gần đây, những kết quả tương tựđã đạt được với chủng Bacillus thuringiensis [52].
1.4.3.2 Enzyme AHL acylase
Cùng một thời điểm khi Dong và ctv. (2000) phát hiện chủng Bacillus có khả
năng phân hủy AHL, Leadbetter và Greenberg (2000) phân lập được một chủng vi khuẩn có thể sử dụng phân tử AHL như là nguồn cacbon và nitơ. Chủng vi khuẩn này có tên là Vibrio paradoxus VAI-C, được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường có chứa 5 mg/l N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone làm nguồn cacbon và nitơ
duy nhất. Trong các thí nghiệm sử dụng AHL được dán nhãn phóng xạ, các nhà nghiên cứu đã chứng minh Vibrio paradoxus cắt đứt phân tử AHL bằng một enzyme AHL acylase, giải phóng ra homoserine lactone và một acid béo. Sau đó, acid béo được sử dụng như nguồn cacbon thông qua đường dẫn β-oxidation. Cần có thêm nhiều nghiên cứu trong tương lai để làm sáng tỏ bằng cách nào vi khuẩn đã lấy
được nitrogen từ homoserine lactone. Gần đây, Flagan và ctv. (2003) phân lập một chủng vi khuẩn Arthrobacter sp. VAI-A, có khả năng phân hủy và sử dụng các sản
độ tăng trưởng phụ thuộc nồng độ AHL và năng suất của hỗn hợp hai chủng
Arthrobacter sp. và Vibrio paradoxus VAI-C cao hơn so với các chủng này nuôi riêng lẻ. Điều này cho thấy rằng quần thể nhiều loài vi khuẩn có thể có ảnh hưởng hổ trợ qua lại trong quá trình chuyển đổi và khoáng hóa tín hiệu “Quorum sensing”. Lin và ctv. (2003) phân lập một chủng vi khuẩn ức chế AHL, Ralstonia sp. XJI2B từ một màng sinh học đa loài. Enzyme chịu trách nhiệm trong việc ức chế
AHL (AiiD) được tinh chế và sau đó được ủ với phân tử N-(3-oxohexanoyl)-L- homoserine lactone. Việc chạy quang phổ ion hóa phun điện tử đối với sản phẩm thủy phân cho thấy rằng enzyme AiiD thủy phân liên kết amid của phân tử AHL. Sự
thể hiện của enzyme AiiD ở vi khuẩn P. aeruginosa tái tổ hợp PAO1 ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh và làm giảm tỉ lệ chết của giun tròn Caenorhabditis elegans xuống còn 15%, so với chủng vi khuẩn không tái tổ hợp.
Hình 1.4. Cơ chế phân hủy phân tử AHL của enzyme AHL-lactonase và AHL- acylase [53].
Chương 2:Vật liệu và phương pháp Luận văn thạc sĩ
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
¾Thời gian: từ tháng 4/2010 – 12/2011
¾Địa điểm: Phòng Sinh Học Thực Nghiệm - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2.
2.2 Địa điểm thu mẫu
Ao nuôi cá tra thuộc 5 tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long: Tiền Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, An Giang, Trà Vinh. ( phụ lục 1)
Hệ vi sinh vật từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, từ mẫu nước và bùn đáy ao nuôi được thu thập từ các vùng nuôi khác nhau. Mỗi đợt thu mẫu tiến hành thu ở ba tỉnh, mỗi tỉnh chọn ba hộ nuôi cá tra thương phẩm, ba hộ sản xuất giống. Đối với ao cá thịt thu 3 con/mẫu/ao; đối với cá giống thu 10 con/mẫu /ao. Tiến hành thu bốn
đợt thu mẫu vào các thời điểm khác nhau trong năm.
Thu hệ tiêu hóa cá tra giống và thịt
Thu hệ tiêu hóa (đoạn ruột gần dạ dày, phần ruột non và ruột già) của cá tra thịt và cá tra giống khỏe mạnh, không bị bệnh và xay xát. Sau đó giữ lạnh khoảng 50C. Thời gian lưu mẫu không quá 24 giờ.
Mẫu hệ tiêu hóa của cá tra thịt và cá tra giống được đồng nhất bằng máy đồng nhất mẫu (MF10 basic, Đức) trong nước muối sinh lý (NaCl 0,9%),với tốc độ 8.000 vòng/ phút (rpm) trong 10 phút, để phóng thích hệ vi sinh vật đường ruột, sau đó ly tâm ở tốc độ 2.000 vòng/phút trong năm phút. Dịch nổi được giữ lại và bảo quản trong glycerol 20% ở nhiệt độ -800C để sử dụng cho bước phân lập tiếp theo.
Thu mẫu nước
Dùng dụng cụ chuyên dụng để thu mẫu nước (Hình 2.1a). Mỗi ao thu một mẫu, nước được thu ở ba tầng nước khác nhau, sau đó trộn lại thành 1 mẫu khoảng 0,5 lít nước được bảo quản lạnh khoảng 5oC trong suốt thời gian chuyển mẫu về
phòng thí nghiệm. Lấy 1ml mẫu nước tăng sinh trong 9ml môi trường BHI ủ trong 24 giờ ở 30oC. Sau đó giữ giống trong glycerol 20%, ở -80oC để dùng cho thí nghiệm sàng lọc tiếp theo.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ
Mẫu bùn thu cùng thời gian và địa điểm với mẫu nước. Mỗi ao thu một mẫu bùn khoảng 200g/mẫu bằng dụng cụ chuyên dùng (Hình 2.1b). Cân 1g bùn hòa tan với 9ml nước muối sinh lý NaCl 0,9%. Ly tâm 2.000 rpm, trong 5 phút. Hút 1 ml dịch nổi tăng sinh trong 9ml môi trường BHI trong 24 giờ, ở 30oC. Sau đó giữ
giống trong glycerol 20%, ở -80oC để dùng cho thí nghiệm sàng lọc tiếp theo.
Hình 2.1. Dụng cụ thu mẫu nước hình (a), mẫu bùn (b).
2.3 Vật liệu nghiên cứu
2.3.1 Nguồn vật liệu cho phân lập
Hệ vi sinh vật làm nguồn vật liệu cho phân lập được thu từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, từ mẫu nước và bùn ởđáy các ao nuôi cá tra thuộc 5 tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long: Đồng Tháp, Tiền Giang, Trà Vinh, Vĩnh Long, An Giang (Bảng 2.1)
Tiến hành 4 đợt thu mẫu
¾ Đợt 1: Tổng số mẫu thu được là 31 mẫu gồm 11 mẫu hệ tiêu hóa cá tra thương phẩm (cá tra thịt) và 20 mẫu hệ tiêu hóa cá tra giống thuộc 3 tỉnh: Đồng Tháp, Tiền Giang, Vĩnh Long.
¾ Đợt 2: Tổng số mẫu thu được là 108 mẫu gồm 26 mẫu hệ tiêu hóa cá tra thương phẩm, 28 mẫu hệ tiêu hóa cá tra giống, 27 mẫu bùn ởđáy ao nuôi cá tra và 27 mẫu nước ao nuôi cá tra thuộc 4 tỉnh: Đồng Tháp, Tiền Giang, Trà Vinh, Vĩnh Long.
¾ Đợt 3: Tổng số mẫu thu được là 19 mẫu gồm 5 mẫu hệ tiêu hóa cá tra thương phẩm và 14 mẫu bùn ở đáy ao nuôi cá tra thuộc 2 tỉnh: Đồng Tháp, Vĩnh Long.
¾ Đợt 4: Tổng số mẫu thu được là 91 mẫu gồm 18 mẫu hệ tiêu hóa cá tra