[61], [83]
Nhuộm gram Cách tiến hành
Cốđịnh tế bào: Hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
Nhuộm bằng dung dịch Crystal violet trong một phút, rửa nước, thấm khô. Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong một phút, rửa nước, thấm khô.
Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô.
Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong một phút, rửa nước, để khô trong không khí.
Soi kính: dùng vật kính dầu 100x
Đọc kết quả
Vi khuẩn gram âm: Màu hồng Vi khuẩn gram dương: Màu tím
Phản ứng sinh hóa
Vi khuẩn gram âm: Định danh bằng bộ kit API20
Vi khuẩn gram dương: Tiến hành thử hoạt tính catalase để xác định các chủng vi khuẩn chọn lọc thuộc chi Bacillus hay Lactobacillus. Nếu thuộc chi Lactobacillus
thì định danh bằng bộ kit API50CHL và ngược lại thì tiến hành định danh theo khóa
định danh Bacillus của Cowan và Steel (1993).
Bộ Kit này gồm một số phản ứng sinh hóa quan trọng sau: Phản ứng lên men một số loại đường, khử nitrate, β-galactosidase với ONPG, sinh urease, phenyl alanine deaminase, khả năng sử dụng citrate, sinh H2S và sinh Indol, Voges – Proskauer, khả năng sử dụng malonate, lysine decarboxylase và di dộng trên môi trường, thử hoạt tính oxydase... Nguyên tắc và các bước thực hiện được tiến hành theo Lê Đình Hùng (1997) và Trần Linh Thước (2007).
¾Khả năng lên men một số loại đường
Nguyên tắc: Nhằm xác định một số vi sinh vật có khả năng lên men (phân giải) một carbonhydrate đặc hiệu trong môi trường cơ bản tạo nên acid (hoặc acid và hơi).
Cơ sở sinh hóa: Việc sinh acid làm giảm pH thể hiện qua sựđổi màu của chất chỉ thị pH có trong môi trường
Chương 2: Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ
Cách tiến hành
Sử dụng môi trường NB (nutrient broth) có chứa 1% đường, chỉ thị phenol red Cấy ria vi khuẩn được bảo quản ở -800C trên môi trường BHIA, ủ 300C, 24 giờđể tạo giống cấp một
Dùng que cấy vô trùng lấy một vòng vi khuẩn cấy vào môi trường trên, ủ
300C, 24 giờ
Đọc kết quả
Dương tính: Môi trường chuyển sang màu vàng
Âm tính: Môi trường không đổi màu (màu hồng của phenol red)
¾Khả năng khử citrate
Nguyên tắc: Nhằm xác định khả năng của một số vi sinh vật sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất cho hoạt động trao đổi chất làm kiềm hóa môi trường.
Cơ sở sinh hóa: Một số vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất để lấy năng lượng mà không cần dùng quá trình lên men hoặc sinh acid lactic. Thông qua việc biến dưỡng citrate bao gồm sự kết hợp của acetyl với coenzyme A và oxalacetate để thâm nhập vào chu trình Krebs. Sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật làm nguồn carbon sẽ sinh ra CO2 làm kiềm hóa môi trường. Mặt khác mọi vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất
đều có khả năng dùng muối ammonium như nguồn carbon duy nhất tạo NH3 làm kiềm hóa môi trường. Chỉ thị màu bromothymol blue sẽ chuyển từ màu xanh lục sang xanh dương.
Cách tiến hành (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chuẩn bị ống nghiệm thạch nghiêng chứa môi trường Simmons Citrate Agar (SCA), pH 6,9 và chất chỉ thị pH là Bromothymol blue. Môi trường có màu xanh lục.
Cấy ria vi khuẩn được bảo quản ở -800C trên môi trường BHIA, ủ 300C, 24 giờđể tạo giống cấp một.
Dương tính: Môi trường chuyển sang màu xanh dương Âm tính: Môi trường không đổi màu
¾Khả năng sinh Urease
Nguyên tắc: Xác định khả năng vi sinh vật phân giải urea tạo hai phân tử
ammonia do tác dụng của men urease.
Cơ sở sinh hóa: Sự phân hủy urea được xúc tác bởi men đặc hiệu là urease tạo ra hai phân tử ammonia làm kiềm hóa môi trường.
Cách tiến hành
Môi trường Rustigian- Struart và chỉ thị phenol red.
Tiến hành cấy ria vi khuẩn trên môi trường BHIA để tạo giống cấp một, ủ
300C, 24 giờ.
Cấy giống cấp một vào môi trường Rustigian- Struart, ủ 300C, 24 giờ.
Đọc kết quả
Dương tính: Môi trường có màu đỏ tím Âm tính: Không đổi màu (màu vàng cam)
¾Khả năng phân giải nitrate
Nguyên tắc: Một số vi sinh vật có khả năng sử dụng nitrate làm nguồn nhận hydro của cơ chất trong quá trình hô hấp kỵ khí đồng thời sử dụng nitrate làm nguồn nitơ do có khả năng tổng hợp enzym nitratreductase.
Cơ sở sinh hóa: Nitrate bị khử thành nitrite, NH3 và N2. Hoạt tính nitratase
được định tính dựa trên sự tạo thành nitrite và sự cạn kiệt nitrate. Nitrite được tạo ra sẽ phản ứng với sulphanilamide và N-aphtylenediamine hydrocloride ở pH acid cho hợp chất màu hồng. Tuy nhiên có nhiều vi sinh vật tiếp tục chuyển nitrate thành các hợp chất khác mặc dù có sự hiện diện của enzyme nitratase nhưng môi trường không xuất hiện màu hồng. Trường hợp này tiến hành kiểm chứng sự cạn kiệt nitrate bằng bụi kẽm tạo màu hồng.
Cách tiến hành
Tiến hành cấy ria vi khuẩn khảo sát được bảo quả ở -800C trên môi trường BHIA để tạo giống cấp một, ủ 300C, 24 giờ.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ
Cấy vi khuẩn vào môi trường có nitrate, ủ 300C, 24 giờ.
Đọc kết quả: Nhỏ thuốc thử Gress A (acid sulfanilic) và Gress B (⍺- naphthyamine)
Dương tính: Môi trường xuất hiện màu hồng, nếu không xuất hiện màu hồng, tiếp tục định tính nitrate bằng bụi kẽm. Nếu phản ứng định tính nitrate cho màu hồng (do có sự hiện diện của citrate) thì thử nghiệm citratase âm tính (-); nếu không chuyển màu thì thử nghiệm nitrate dương tính.
¾Thử khả năng sinh Indol
Nguyên tắc: Thử khả năng sinh indol từ tryptophan
Cơ sở sinh hóa: Tryptophan là một acid amin có thể bị oxy hóa bởi một số vi sinh vật tạo ra ba sản phẩm biến dưỡng chính có gốc Indol là Indol, skatol (methyl Indol) và Indolacetic acid, Indolacetate. Một số men nội bào khác cũng tham gia vào quá trình này được gọi chung là “triptophanase”
Cách tiến hành
Cấy ria vi khuẩn khảo sát được bảo quả ở -800C trên môi trường BHIA để tạo giống cấp một.
Cấy vi khuẩn vào môi trường nước pepton, nhỏ 5 giọt thuốc thử vào ống nghiệm, ủ 300C, 24 giờ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đọc kết quả
Dương tính: Màu đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trường
Âm tính: Bề mặt môi trường giữ nguyên màu vàng của thuốc thử
Kết quả biến động: Màu cam trên bề mặt môi trường do có skatol
¾Thử phản ứng VP ( Voges – Proskauer)
Nguyên tắc: Xác định khả năng của một số vi sinh vật tạo ra sản phẩm cuối cùng mang tính trung tính như acetoin (acetylmethylcarbinol-AMC) do lên men glucose
Cấy ria vi khuẩn khảo sát được bảo quản ở -80 C trên môi trường BHIA, ủ
300C, 24 giờđể tạo giống cấp một
Môi trường Clark – lubs (CL), thuốc thử Koblentz Cấy vi khuẩn vào môi trường CL, ủ 300C, 24 giờ
Nhỏ thuốc thử vào môi trường, lắc nhẹ từ 0,5 đến 1 phút và đọc kết quả sau 10
đến 20 phút.
Đọc kết quả
Dương tính: Môi trường có màu đỏ cam
Âm tính: Môi trường giữ nguyên màu của thuốc thử, màu vàng hoặc màu nâu
đất
¾Thử nghiệm β-galactosidase với ONPG
Nguyên tắc: Xác định vi khuẩn chỉ có khả năng lên men lactose khi trong tế
bào có sự tổng hợp hai emzyme β-galactosidase. Enzyme này có vai trò xúc tác sự
thủy phân lactose và enzyme permease trong quá trình vận chuyển lactose vào bên trong tế bào. Hoạt tính của enzyme này có thể xác định dựa vào cơ chế tổng hợp O- nitrophenyl – D – galactopyranoside (ONPG).
Cơ sở sinh hóa: Sự thủy phân cơ chất đường lactose bởi enzyme β- galactosidase sẽ phóng thích nitrophenol có màu vàng.
Cách tiến hành
Cấy ria vi khuẩn khảo sát được bảo quản ở -800C trên môi trường BHIA, ủ
300C, 24 giờđể tạo giống cấp một.
Môi trường thử nghiệm này là ONPG broth.
Dùng que cấy lấy sinh khối khuẩn lạc vi khuẩn khảo sát cho vào ống nghiệm chứa môi trường ONPG broth, ủ 300C, 24 giờ
Đọc kết quả
Dương tính: Môi trường có màu vàng
Âm tính: Không có sự chuyển màu môi trường
Chương 2: Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ
Nguyên tắc: Một số vi khuẩn có tiêm mao (Flagella) có khả năng di động trong môi trường bán lỏng, làm đục môi trường hay mọc giống rễ cây xung quanh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đường cấy
Cách tiến hành
Tiến hành cấy ria trên môi trường BHIA để tạo giống cấp một, ủ 300C, 24 giờ
Dùng que cấy lấy vi khuẩn khảo sát cấy thẳng từ trên xuống dưới ngay giữa
ống môi trường bán lỏng, ủ 300C, 24 giờ.
Đọc kết quả
Dương tính: Vi khuẩn mọc lan ra khỏi đường cấy Âm tính: Vi khuẩn chỉ mọc trên đường cấy
¾Thử hoạt tính oxydase
Nguyên tắc: Xác định vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối có khả năng sinh enzyme oxydase (cytochrom oxydase).
Cơ sở sinh hóa: Khi có sự hiện diện của cytochrome C trong tế bào thuốc thử
p-phenylenediamine bị oxy hóa thành hợp chất indolphenol có màu xanh dương.
Cách tiến hành
Giấy tẩm N- dimethyl- paraphenylenediamine
Cấy ria vi khuẩn khảo sát được bảo quản ở -800C trên môi trường BHIA, ủ
300C, 24 giờ để tạo giống cấp một.
Dùng que cấy vô trùng lấy sinh khối khuẩn lạc rồi quệt lên giấy oxydase đã tẩm ướt bằng nước muối sinh lý. Đọc kết quả trong vòng 10 giây đến một phút.
Đọc kết quả
Dương tính: Giấy quệt chuyển sang màu xanh Âm tính: Giấy quệt không đổi màu.