3.7.1 Định danh bằng hình thái và các phản ứng sinh hóa
Nhuộm gram
Bảng 3.10. Kết quả nhuộm gram Chủng vi
khuẩn Gram
Hình thái tế
bào Hình dạng khuẩn lạc Catalase T1DT101 + Trực khuẩn Tròn, trắng trong , 0,5mm đường kính khoảng -
T1DT103 - Trực khuẩn Trắng đục, mtròn ọc lang thành nhđồng tâm ững vòng + G1DT102 - Trực khuẩn Tròn,trắng đục, nhỏ li ti + G2VL1.2 + Trực khuẩn Tròn, trắng trong, nhỏ li ti - B4TAG19A - Trực khuẩn Trắng đục, đường kính từ 0,5-1,0mm + N4TAG22a1 - Trực khuẩn Tròn, trắng đụ 0,3-0,5mm c, nhỏ li ti đường kính -
Hình 3.5. Kết quả nhuộm gram T1DT101(a), T1DT103(b), G1DT102(c), G2VL1.2(d), B4TAG19A(e), N4TAG22a1(f).
a cb
Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn Thạc sĩ
Bảng 3.11. Kết quả định danh 4 chủng vi khuẩn gram âm bằng Kit API 20E Chủng vi khuẩn Phản ứng T1DT103 G1DT102 B4TAG19A N4TAG19A ONPG - + + - Argine dehydrocarboxylase - - + - Lysine Decarboxylase - - - - Orginine Decarboxylase + - + - Citrate + + + - H2S + - - - Urease + - - - L- Trytophan + - - - Indol - - - - Voges- Proskauer + + + - Gelatin + - - - Glucose + + + - Manitol - + + + Inositol - - + - Sorbitol - + + - Rhamnose - + + - Saccharose - + + - Mellobiose - + + - Amygdalin - + + - Arabinose - + + - Oxidase - - - + Khử NO2 + - + - N2 - - - - Di động + - + - O/F +/+ +/+ +/+ +/+
Bảng 3.12. Kết quả định danh 2 chủng vi khuẩn gram dương bằng Kit API 50 CHL Chủng vi khuẩn Phản ứng T1DT 101 G2VL1 .2 Chủng Phản ứng T1TD 101 G2VL1.2 Glycerol - - Salicin + - Erythritol - - D-Cellobiose + - D-Arabinose - - D-Maltose + + L-Arabinose + + D-Lactose + - D-Ribose + + Melibiose + + D-Xylose - + D-Saccharose + + L-Xylose - - D-Trehalose + - D-Adonitol - - Inulin - - Methyl B-D- Xylopyranoside - - D-Melezitose + - D-Galactose + + D-Rafinose + + D-Glucose + + Amidon - - D-Frucrose + + Glycogen - - D-Mannose + - Xylitol - - L-Sorbose - - Gentobiose + + L-Rhamnose - - D-Turanose + - Dulcitol - - D-Lyxose - - Inositol - - D-Tagatose - - D-Manitol + - D-Fucose - - D-Sorbitol + - L-Fucose - - Methyl a-D- Manopyranoside + - D-Arabitol - - Methyl a-D- Glucopyranoside - + L-Arabitol - - N-Acetyl
glucosamine + + Potassium gluconate + +
Amygdalin + - Potassium 2-Ketogluconate - +
Arbutin + - Potassium 5-Ketogluconate - -
Esculin + + Lactobacillus
plantarum Lactobacillus brevis
Kết luận
Kết quả định danh bằng các phản ứng sinh hóa cho thấy 6 chủng vi khuẩn thuộc 6 loài: Lactobacillus plantarum, Proteus mirabilis, Rahnella aquatilis,
Lactobacillus brevis, Enterobacter cloacae, Aeromonas salmonicida. Chủng
Aeromonas salmonicida gây bệnh cho cá nên được loại bỏ, do đó chọn 5 chủng tiếp tục định danh bằng sinh học phân tử.
Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn Thạc sĩ
3.7.2 Định danh bằng sinh học phân tử
Bảng 3.13. Kết quả định danh bằng sinh học phân tử
Chủng vi khuẩn
Định danh sinh hóa
Định danh sinh học phân tử
Kết luận Max
score Query Coverage E-Value Max Identities DanhĐịnh
T1DT
101 Lactobacillus plantarum 837 100% 0,0 99% Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum
T1DT
103 Proteus mirabilis 835 100% 0,0 100% Proteus mirabilis Proteus mirabilis
G1DT
102 Rahnella aquatilis 852 100% 0,0 99% Rhanella aquatis Rahnella aquatilis
G2VL
1.2 Lactobacillus brevis 911 100% 0,0 100% Lactobacillus brevis Lactobacillus brevis
B4TA G19A Enterobacter cloacae 900 99% 0,0 98% Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae
Kết quả định danh sinh học phân tử hoàn toàn phù hợp với kết quả định danh sinh hóa, cho thấy 5 chủng tuyển chọn thuộc 5 loài: Lactobacillus plantarum, Proteus
mirabilis, Rahnella aquatilis, Lactobacillus brevis, và Enterobacter cloacae.
3.8 Kết quả thử khả năng tương thích lẫn nhau
Kết quả thử khả năng tương thích lẫn nhau của 5 chủng vi khuẩn tuyển chọn thể hiện trong bảng 3.14.
Bảng 3.14. Thử khả năng tương thích lẫn nhau giữa các chủng vi khuẩn tuyển chọn Chủng vi khuẩn T1DT101 T1DT103 G1DT102 G2VL1.2 B4TAG19A T1DT101 - - - - T1DT103 - - - - G1DT102 - - - G2VL1.2 - - - B4TAG19A - - - -
Kết quả cho thấy 5 chủng vi khuẩn tuyển chọn không đối kháng lẫn nhau
(tương thích với nhau). Vì vậy, 5 chủng này có thể phối trộn với nhau để tạo hỗn hợp probiotic.
3.9 Bàn luận
hypophthalmus), từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, nước và bùn ao nuôi cá tra thu ở 5 tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long.
Các nghiên cứu sàng lọc vi khuẩn probiotic theo hướng tiếp cận bẻ gãy phân tử tín hiệu “Quorum sensing” ngày càng nhiều, có thể kể đến các nghiên cứu của Chu và ctv. (2010), Dong và ctv. (2004). Defoirt và ctv. (2011) đã chứng minh nhiều loài vi khuẩn gây bệnh điều hòa sự biểu hiện gen độc lực thông qua phân tử tín hiệu “Quorum sensing”. Do đó, việc bẻ gãy phân tử tín hiệu “Quorum sensing” ở vi khuẩn gây bệnh được xem như một cách tiếp cận đầy tiềm năng để kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn ở động vật thủy sản.
Theo thông tin từ nhóm nghiên cứu của của Viện Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản II, hai phân tử C4-HSL và C6-HSL (N-Butyryl-DL-homoserine lactone và N-Hexanoyl-DL-homoserine lactone) là phân tử tín hiệu “Quorum sensing” hiện diện ở Edw. ictaluri. Do đó, chúng tôi sử dụng hai phân tử này bổ sung vào môi trường phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu “Quorum sensing”.
Chúng tôi tiến hành phân lập hệ vi sinh trong các mẫu thu từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, nước và bùn ao nuôi cá tra bằng cách nuôi trong môi trường chỉ có hỗn hợp hai loại phân tử AHL là nguồn nitrogen và cacbon duy nhất. Để kiểm tra ảnh hưởng của pH môi trường đến sự tồn tại của phân tử AHL, chúng tôi tiến hành đo giá trị pH cuối mỗi chu kỳ phân lập.
pH và nhiệt độ là hai yếu tố môi trường ảnh hưởng đến độ bền của phân tử AHL, pH kiềm (>7,5) và nhiệt độ cao (t >37oC) sẽ làm mở vòng lactone và tạo ra hợp chất N-acyl-homoserine không thể hiện được đặc tính của AHL. Theo nghiên cứu của các tác giả Decho và ctv. (2009) và Yates và ctv. ( 2002) cho thấy khoảng 70% N-propionyl-homoserine lactone (C3-HSL) bị thủy phân ở pH6, C4-HSL phân hủy hoàn toàn ở pH8. Vì vậy, AHL phải chứa chuỗi acyl có ít nhất bốn cacbon để đủ bền và hoạt động trong điều kiện pH bất lợi của môi trường. Đồng thời, Boyer và
ctv. (2009) đã chứng minh chuỗi acyl mạch dài (số cacbon ≥ 8) ít mẫn cảm với môi trường pH kiềm và nhiệt độ cao hơn chuỗi acyl mạch ngắn của AHL.
Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn Thạc sĩ
Giá trị pH cuối chu kỳ 1 của mẫu hệ vi sinh vật thu từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và cá tra giống thấp có thể là do trong môi trường còn dư lượng các hợp chất hữu cơ thu nhận từ dịch nghiền của hệ tiêu hóa. Do đó, trong quá trình biến dưỡng các vi sinh vật đã sử dụng các hợp chất hữu cơ và chuyển hóa hay tiết các sản phẩm trung gian mang tính acid dẫn đến môi trường có giá trị pH thấp. Ngoài ra, giá trị pH thấp của mẫu hệ tiêu hóa cá thịt và cá giống là do hệ vi sinh trong đường ruột chủ yếu là nhóm vi khuẩn lactic acid, trong quá trình biến dưỡng chúng đã tiết ra các hợp chất acid hữu cơ làm giảm pH môi trường. Adams (1999), Hagi và ctv. (2004) đã khảo sát thành phần hệ vi sinh trong đường ruột của bốn loài cá nước ngọt (cá chép, cá mè, cá da trơn, cá diếc) chủ yếu là hệ vi sinh thuộc nhóm vi khuẩn lactic.
Mật độ vi khuẩn trong bốn loại mẫu nguyên liệu dùng phân lập giảm qua các chu kỳ phân lập. Hình thái khuẩn lạc rất đa dạng và phong phú từ các mẫu nguyên liệu ban đầu. Tuy nhiên, qua 4 chu kỳ phân lập thì số lượng khuẩn lạc giảm xuống đáng kể. Điều này chứng tỏ rằng chỉ có những vi sinh vật nào có khả năng phân hủy AHL thì mới có thể tồn tại và phát triển trong môi trường nghèo dinh dưỡng này.
Để kiểm tra khả năng phân hủy phân tử tín hiệu “Quorum sensing” của các chủng vi khuẩn đã sàng lọc chúng tôi chọn phân tử N- hexanoyl- L- homoserine lactone (HHL) làm hợp chất thử nghiệm, vì đây là loại phân tử AHL đặc hiệu được nhận biết bởi chủng vi khuẩn chỉ thị CV026. Từ 558 dòng vi khuẩn thu được qua 4 chu kỳ phân lập, chúng tôi chọn được 128 dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy phân tử HHL ở các mức độ khác nhau. Theo tiêu chí sàng lọc chúng tôi tuyển chọn 64 dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy HHL mạnh và trung bình trong đó các dòng vi khuẩn có nguồn gốc từ mẫu cá tra giống có khả năng phân hủy HHL cao nhất (chiếm 29,06%).
Từ 64 dòng vi khuẩn được chọn lọc, chúng tôi tiến hành kiểm tra sơ bộ khả năng đối kháng với Edw. ictaluri bằng phương pháp thạch khuếch tán, kết quả thu được 28 dòng có khả năng đối kháng mạnh và trung bình. Tiếp tục kiểm tra khả năng đối kháng bằng 3 phương pháp khác nhau, cho thấy phương pháp đường
3 phương pháp còn lại: khoảng đối kháng của phương pháp thạch khuếch tán dao động từ 7mm đến 34mm, phương pháp BLIS dao động từ 3 đến 27mm và phương pháp đĩa giấy khuếch tán dao động từ 2 đến 25mm trong tổng số mẫu có đối kháng đã chọn. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Ngô Văn Hải (2007). Ngoài ra, phương pháp đường vuông góc là phương pháp đơn giản dễ làm, thích hợp nhất cho việc sàng lọc nhanh vi khuẩn probiotic và nghiên cứu các hợp chất kháng khuẩn vì các hơp chất kháng khuẩn là những chất ngoại bào được tiết ra trong quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu của các tác giả Vine và ctv. (2006) và Gatesoupe (1999) cho rằng vi khuẩn có khả năng tiết ra các hợp chất ức chế ngoại bào gồm các chất như kháng sinh, acid hữu cơ, hydro peroxide, carbon dioxide, siderophores và bacteriocin. Các hợp chất này là những độc tố hoặc những chất ức chế sự phát triển của những vi sinh vật khác.
Monthon và Songtham (2008) kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp đường vuông góc cho kết quả thử nghiệm tốt hơn phương pháp thạch khuếch tán là do các hợp chất kháng khuẩn được tiết ra trong suốt thời gian thí nghiệm (48 giờ). Còn đối với phương pháp thạch khuếch tán, vi khuẩn bị tác động trong quá trình chuẩn bị giếng. Đối với phương pháp đĩa giấy khuếch tán, một phần các hợp chất kháng khuẩn bị tác động và mất đi bởi quá trình ly tâm thu dịch nổi. Mặt khác, hàm lượng các hợp chất kháng khuẩn chỉ tạo ra trong giai đoạn phát triển 24 giờ trước khi ly tâm thu dịch nổi. Tương tự, đối với phương pháp BLIS vi khuẩn chỉ tiết ra các hợp chất kháng khuẩn trong giai đoạn sinh trưởng 24 giờ trước khi sinh khối bị loại ra khỏi môi trường thạch và diệt tế bào vi khuẩn sống còn sót lại bằng Chloroform.
Sau khi kiểm tra khả năng đối kháng, chúng tôi tiến hành kiểm tra tính an toàn bằng thử nghiệm khả năng sinh hemolysin. Kết quả thu được 16 chủng sinh α- hemolysine, 6 chủng sinh β-hemolysine và 6 chủng sinh γ-hemolysine. Hoạt tính gây dung huyết thường liên quan đến tính gây bệnh của nhiều loài vi khuẩn, bởi vì hemolysin được cho là đóng góp thêm vào yếu tố độc tính của các loài này [93]. Do đó bước thử nghiệm này được thực hiện nhằm loại bỏ những chủng có tiềm
Chương 3: Kết quả và bàn luận Luận văn Thạc sĩ
năng gây bệnh để đảm bảo tính an toàn cho người sử dụng qua chuỗi thức ăn. Theo tổ chức FAO/ WHO (2002) nên sử dụng những chủng vi khuẩn làm probiotic khi những chủng này không có hoạt tính hemolysin.
Từ 6 chủng có khả năng sinh γ-hemolysine nghĩa là không có tiềm năng gây bệnh cho người và động vật, chúng tôi tiếp tục tiến hành khảo sát một số đặc tính sinh lý của các chủng vi khuẩn đã được chọn lọc.
Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng trong nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, nhiệt độ có ý nghĩa không nhiều khi vi khuẩn probiotic hiện diện trong đường tiêu hóa của vật nuôi, nhưng lại rất quan trọng khi vi khuẩn tồn tại trong điều kiện bảo quản và trong trường hợp đưa vào thành phần thức ăn. Đối với các vi sinh vật được tuyển chọn làm probiotic nên có khả năng sống trong phạm vi nhiệt độ rộng từ 150C đến 450C [18].
Sáu chủng vi khuẩn được tuyển chọn có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ từ 200C đến 400C phù hợp với kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Ngọc Lan và Lê Thanh Bình (2003). Các tác giả này khảo sát các chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic có khả năng sinh trưởng và phát triển trong ngưỡng nhiệt độ từ 150C đến 450C.
Năm chủng vi khuẩn phát triển tốt ở nồng độ muối trong khoảng từ 0% đến 6% và chủng N4TAG22a1 phát triển tốt trong khoảng từ 0,5% đến 6% nhưng phát triển chậm ở 0%. Yavuzdurmaz (2007) chứng minh rằng vi khuẩn làm probiotic chịu đựng được các nồng độ muối khác nhau từ 0,5% đến 6,5%.
Trong môi trường nuôi trồng thủy sản có sự biến động tương đối rộng của các giá trị pH. Do vậy, một đặc tính rất quan trọng khác của các vi sinh vật probiotic là khả năng sống trong môi trường có độ pH khác nhau.
Sáu chủng vi khuẩn phát triển tốt trong khoảng từ pH4 đến pH9 trong thời gian 24 giờ nuôi cấy. Kết quả này phù hợp với kết quả của Trần Quốc Việt (2009), tác giả này cho rằng mật độ tế bào vi khuẩn không thay đổi nhiều khi pH môi
pH7 và đồng thời chịu đựng được điều kiện khắc nghiệt của dạ dày trong khoảng 3 giờ ở hai giá trị pH2 và pH3.
Zhou và ctv. (2007) cho rằng giá trị pH2 và pH3 được xem là giới hạn quyết định trong sàng lọc các chủng vi sinh vật có tiềm năng sử dụng làm probiotic. Prasad và ctv. (1998) cho rằng thời gian thức ăn tồn tại trong dạ dày khoảng 3 giờ. Đồng thời theo báo cáo của FAO (1980) cho rằng pH trong dạ dày cá bơn giống (Scophthalmus maximus) dao động trong khoảng pH từ 3,9 đến 5,3, trong ruột dao động trong khoảng từ 7,4 đến 7,9 và trong trực tràng dao động trong khoảng từ 7,6 đến 8,5. Đối với cá da trơn, giá trị pH trong dạ dày từ 2 đến 4 và ở đoạn ruột từ 7 đến 9. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng chịu pH dạ dày từ 2 đến 3 trong thời gian 6 giờ nuôi cấy. Kết quả này phù hợp với tiêu chí chọn vi khuẩn làm probiotic của Prassad và ctv. (1998) và Zhou và ctv. (2007).
Khả năng tồn tại trong ruột non và dạ dày là đặc tính quan trọng của probiotic [80]. Zhou và ctv. (2007) đã chỉ ra rằng probiotic chỉ phát huy tác dụng có lợi lên vật chủ khi chúng tồn tại trong ruột non. Thông thường, muối mật trong ruột non của động vật dao động trong khoảng từ 1 đến 3% [123]. Gilliland và ctv. (1984), Prassad và ctv. (1998) cho rằng vi khuẩn probiotic chịu đựng được nồng độ muối mật ở ruột non là 0,3% trong khoảng 4 giờ.
Dựa vào các nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng chịu đựng muối mật của 6 chủng vi khuẩn tuyển chọn ở nồng độ từ 0,5% đến 2%. Kết quả cho thấy 6 chủng vi khuẩn đều phát triển tốt ở nồng độ muối mật 0,5% đến 2%. Trong đó, chủng B4TAG19A có khả năng phát triển tốt nhất.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi là phù hợp với kết quả nghiên cứu của Olsson và ctv. (1998) về khả năng chịu đựng của vi khuẩn probiotic ở các điều kiện khắc nghiệt trong hệ tiêu hóa cá.
Sáu chủng chọn lọc sau khi định danh bằng các phản ứng sinh hóa và sinh học phân tử, sau khi loại bỏ chủng N4TAG22a1 là vi khuẩn gây bệnh cho cá, 5 chủng vi