Phân lập tuyển chọn vi sinh vật có khả năng phân giải mạnh xenluloza từ phế phụ phẩm nông nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN VĂN BÌNH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MẠNH XENLULOZA TỪ PHẾ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, NĂM 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN VĂN BÌNH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MẠNH XENLULOZA TỪ PHẾ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH: KHOA HỌC MÔI TRƯỜNG Mà SỐ: 60.44.03.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ðINH HỒNG DUYÊN HÀ NỘI, NĂM 2014 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của bản thân, ñược xuất phát từ yêu cầu phát sinh trong công việc ñể hình thành hướng nghiên cứu. Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng tuân thủ ñúng nguyên tắc và kết quả trình bày trong luận văn ñược thu thập ñược trong quá trình nghiên cứu là trung thực chưa từng ñược ai công bố trước ñây. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả luận văn Nguyễn Văn Bình Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii LỜI CẢM ƠN Luận văn này ñược thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh Học ðất – Khoa Môi Trường - Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội. ðể hoàn thành ñược luận văn này tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự ñộng viên, giúp ñỡ của nhiều cá nhân và tập thể. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến TS. ðinh Hồng Duyên ñã tận tình hướng dẫn cho tôi trong thời gian thực hiện luận văn. Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo ñã truyền ñạt lại cho tôi những kiến thức quý báu trong những năm học vừa qua. Cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, Ban quản lý ðào tạo, trường ðại học nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện cho tôi trong quá trình học tập. Sau cùng tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc ñến gia ñình ñã luôn tạo ñiều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học cũng như thực hiện luận văn. Do thời gian có hạn và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học chưa nhiều nên luận văn còn nhiều thiếu sót, rất mong nhận ñược ý kiến góp ý của Thầy/Cô trong và ngoài trường. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả luận văn Nguyễn Văn Bình Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii MỞ ðẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Khối lượng và thành phần phế phụ phẩm nông nghiệp 3 1.1.1. Khái niệm phế phụ phẩm nông nghiệp 3 1.2. Các biện pháp xử lí phế phụ phẩm nông nghiệp 7 1.2.1. ðốt 7 1.2.2. Ủ làm phân 7 1.2.3. Biện pháp vùi trực tiếp vào ñất, trên ruộng 8 1.2.4. Sử dụng làm thức ăn chăn nuôi 9 1.3. Cơ sở khoa học của quá trình phân giải chất thải rắn hữu cơ bằng con ñường sinh học 10 1.3.1. Cấu trúc phân tử và khả năng bền vững của xenluloza 10 1.3.2. Cơ chế phân giải xenlulaza 11 1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng, phát triển và sinh enzym của vi sinh vật 15 1.4. Nghiên cứu về ứng dụng vi sinh vật trong xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp trên thế giới và ở Việt Nam 18 1.4.1. Nghiên cứu trên thế giới 18 1.4.2. Nghiên cứu ở Việt Nam 20 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. ðối tượng nghiên cứu 24 2.2. Phạm vi nghiên cứu 24 2.3. ðịa ñiểm nghiên cứu 24 2.4. Nội dung nghiên cứu 24 2.4.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng giống vi sinh vật từ các mẫu nghiên cứu. 24 2.4.2. ðánh giá ñặc tính sinh học của các chủng vi sinh vật. 24 2.4.3. Sản xuất và ñánh giá chất lượng chế phẩm. 24 2.4.4. ðánh giá khả năng phân hủy rơm rạ của chế phẩm VSV qua kết quả thử nghiệm ở chậu vại và quy mô nhỏ trên ñồng ruộng trong 35 ngày. 24 2.5. Phương pháp nghiên cứu 24 2.5.1. Vật liệu nghiên cứu 24 2.5.2. Phương pháp lấy mẫu 27 2.5.3. Phân lập vi sinh vật từ các mẫu phế thải 27 2.5.4. ðánh giá ñặc tính sinh học của các chủng vi sinh vật 28 2.5.5. Sản xuất chế phẩm vi sinh vật 30 2.5.6. ðánh giá hiệu quả của chế phẩm vi sinh vật 32 2.5.7. Phương pháp xử lý số liệu 33 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1. Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật từ các mẫu nghiên cứu 34 3.1.1. Phân lập VSV có khả năng phân giải Xenluloza 34 3.1.2. ðánh giá hoạt tính enzym ngoại bào của 57 chủng vi sinh vật 35 3.2. ðánh giá ñặc tính sinh học của V5, T1, X10 và N21 39 3.2.1. Hình thái, kích thước của V5, T1, X10 và N21 39 3.2.2. Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 42 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v 3.2.3. ðánh giá khả năng thích ứng pH của V5, T1, X10 và N21 45 3.2.4. ðánh giá khả năng thích ứng nhiệt ñộ của V5, T1, X10 và N21 46 3.2.5. ðánh giá khả năng kháng kháng sinh của V5, T1, X10 và N21 48 3.3. Sản xuất chế phẩm vi sinh vật. 51 3.3.1. ðánh giá tính ñối kháng của V5, T1, X10 và N21. 51 3.3.2. Sản xuất và ñánh giá chất lượng chế phẩm vi sinh vật 52 3.4. Xử lý rơm rạ bằng chế phẩm vi sinh vật 57 3.4.1. Kết quả thí nghiệm chậu vại 57 3.4.2. Kết quả xử lý rơm rạ quy mô ñống ủ lớn 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 1. Kết luận 67 2. Kiến nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ LỤC 75 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Ước tính khối lượng các nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp chính ở Việt Nam 4 Bảng 2.1. ðịa ñiểm lấy mẫu phân lập vi sinh vật xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp 27 Bảng 3.1. Số lượng chủng vi sinh vật phân lập ñược ở các mẫu nghiên cứu 34 Bảng 3.2. Hoạt tính enzym của 57 chủng vi sinh vật 36 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy ñến sinh trưởng và sinh enzym ngoại bào của các chủng V5, T1, X10, N21. 43 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH ñến sinh trưởng và sinh enzyme ngoại bào của 4 chủng V5, T1, X10, T1 45 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến sinh trưởng và sinh enzym ngoại bào của 4 chủng V5, T1, X10, N21. 47 Bảng 3.6. Khả năng kháng kháng sinh của các chủng N21, V5, X10 và T1 49 Bảng 3.7. Chất lượng của chế phẩm vi sinh vật sau sản xuất 55 Bảng 3.8. Chất lượng chế phẩm Emina 56 Bảng 3.9. Kết quả phân tích các chậu vại sau 35 ngày 57 Bảng 3.10. Diễn biến nhiệt ñộ ñống ủ 60 Bảng 3.11. Kết quả phân tích các ñống ủ sau 35 ngày 62 Bảng 3.12. Khối lượng phân hữu cơ sau khi ủ ở các công thức thí nghiệm 63 Bảng 3.13. Chi phí ñể xử lý 1 tấn rơm rạ 64 Bảng 3.14. Lượng khí thải vào môi trường do ñốt rơm rạ ngoài ñồng ruộng 65 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Lượng rơm rạ trung bình thải ra hàng năm của các nước thuộc khu vực ðông Nam Á 5 Hình 1.2. Ước tính lượng rơm rạ ngoài ñồng ruộng ở một số tỉnh vùng ñồng bằng Sông Hồng (ðặng Kim Chi, 2011) 5 Hình 1.3. Quá trình phân hủy xenluloza (Klyosov, 1995) 13 Hình 2.1. Mô hình cấy vạch nghiên cứu tính ñối kháng 30 Hình 3.1. Sự phân bố của VSV trong các nguồn phế thải 35 Hình 3.2. Hoạt tính xenlulaza của V5, T1, X10 và N21 39 Hình 3.3. Khuẩn lạc và hình thái vi khuẩn V5 40 Hình 3.4. Khuẩn lạc và hình thái vi khuẩn T1 40 Hình 3.5. Khuẩn lạc và hình thái sợi xạ khuẩn X10 41 Hình 3.6. Khuẩn lạc và hình thái của chủng nấm N21 42 Hình 3.7. Khả năng gây bệnh lên thực vật của V5, T1, X10 và N21 50 Hình 3.8. Tính ñối kháng của các chủng VSV 52 Hình 3.9. Quy trình sản xuất chế phẩm dạng dịch từ V5, T1 53 Hình 3.10. Quy trình sản xuất chế phẩm dạng bột từ X10 và N21 54 Hình 3.11. Thiết kế ñổng ủ rơm rạ với khối lượng 50kg 59 Hình 3.12. Diễn biến nhiệt ñộ trong ñống ủ 61 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BVMT : Bảo vệ môi trường CMC : Cacboxyl methyl cellulose Cs : Cộng sự ðBSCL : ðồng bằng sông Cửu Long ðC : ðối chứng ðtg : ðồng tác giả Emina : Effective Microorganisms of Institute of Agrobiology IRRI : International Rice Research Institute MT : Môi trường MTNC : Môi trường nuôi cấy N : Nấm NXB : Nhà xuất bản PDA : Potato Doxtrose Agar RA : Ratinaculiapert RWC : Rice-wheat consortium RF : Rectusflexibilis TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam TD và MNPB : Trung du và miền núi phía Bắc VK : Vi khuẩn VSV : Vi sinh vật XK : Xạ khuẩn SP : Species S : Spira [...]... n hành nghiên c u ñ tài: Phân l p, tuy n ch n vi sinh v t có kh năng phân gi i m nh xenluloza t ph ph ph m nông nghi p” H c vi n Nông nghi p Vi t Nam – Lu n văn th c s Khoa h c Nông nghi p Page 1 M c ñích nghiên c u - Phân l p và tuy n ch n ñư c ñư c m t s ch ng vi sinh có kh năng phân gi i m nh xenluloza, protein, tinh b t - S n xu t ch ph m vi sinh v t ñ x lý ph ph ph m nông nghi p Yêu c u c a ñ... ch n các ch ng vi sinh v t có kh năng x lý các ch t h u cơ v n là hư ng ñi m i H c vi n Nông nghi p Vi t Nam – Lu n văn th c s Khoa h c Nông nghi p Page 23 Chương 2 N I DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 ð i tư ng nghiên c u Vi sinh v t có kh năng phân gi i m nh xenluloza 2.2 Ph m vi nghiên c u Ngu n ph ph m nông nghi p ñ phân l p vi sinh v t: huy n Gia Lâm – Hà N i S d ng ch ph m vi sinh v t ñ x lý... men xenluloza Th k 19 các nhà khoa h c ñã phân l p ñư c m t s VSV k khí có kh năng phân gi i xenluloza t phân và d c c a ñ ng v t nhai l i Sin (1951) cho r ng vi khu n cũng có kh năng phân gi i xenluloza nhưng cư ng ñ không m nh b ng n m s i Do v y ñ phân gi i xenluloza t nhiên, các loài VK khác nhau ph i ph i h p v i nhau ñ cùng phân gi i trong m i quan h h sinh Các VK hi u khí có kh năng phân gi i xenluloza. .. b i n m, vi khu n và x khu n ưa nhi t, vi khu n có bào t phát tri n nhi t ñ kho ng 60-700C Các ch ng vi sinh v t ưa nhi t có vai trò quan tr ng trong vi c phân hu các h p ch t h u cơ: vi khu n ưa nhi t có kh năng phân hu m nh protein, lipit, hemixenluloza, x khu n phân hu tích c c tinh b t và làm gi m ñáng k hàm lư ng nư c trong ñ ng , còn n m ưa nhi t có kh năng phân hu xenluloza và hemixenluloza... nông nghi p Vi t Nam 1.4.1 Nghiên c u trên th gi i T th k XIX, các nhà khoa h c ñã nghiên c u và nh n th y m t s vi sinh v t k khí có kh năng phân gi i xenluloza Nh ng năm ñ u c a th k XX ngư i ta phân l p ñư c các loài vi khu n hi u khí cũng có kh năng này Trong các vi khu n hi u khí phân gi i xenluloza thì niêm vi khu n là quan tr ng nh t Năm 1946, Hungate ñã phân l p ñư c loài x khu n có tên là Micromonospora... gây nh hư ng ñ n môi trư ng sinh thái và c nh quan ð nh hư ng hi n nay là dùng các ch ph m vi sinh v t trong x lý ph ph ph m nông nghi p ð có ñư c ch ph m vi sinh v t rút ng n th i gian ph ph ph m ñ ng ru ng thì vi c phân l p, tuy n ch n ch ng vi sinh v t có kh năng s n sinh ra enzym ngo i bào xenlulaza, proteaza, amylaza ñ chuy n hóa các ch t xơ s i thành mùn h u cơ là vi c làm r t quan tr ng c n... phân h u cơ có ch t lư ng t t Trong phân này ch a kho ng 1,7% N, và t l C/N là 12:3 Trung Qu c cũng có r t nhi u nghiên c u v vi c phân l p vi sinh v t và ng d ng trong x lý ph th i h u cơ Năm 2005 Wen-Jing Lu và ñtg ñã phân l p ñư c 5 ch ng vi khu n ưa m xenluloza cao t ph th i rau qu v vi sinh và thân lá hoa thu c gi ng Bacillus, Halobacillus, Aeromicrobium, Brevibacterium Khi ng d ng các ch ng vi. .. i ph th i có kh năng phân h y sinh h c do nó ch a thành ph n h u cơ, vi sinh v t có th phân h y s d ng làm dinh dư ng trong quá trình sinh trư ng và phát tri n c a mình Các ch t th i có kh năng phân h y sinh h c t t như c d i, lá cây…, các ch t có kh năng phân h y sinh h c kém như: rơm, r , thân cây… Ngu n g c phát sinh ph ph ph m nông nghi p t quá trình ch bi n các lo i cây công nghi p, cây lương th... a ñi m nghiên c u Phòng Sinh h c ñ t – Khoa Môi Trư ng – Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i 2.4 N i dung nghiên c u 2.4.1 Phân l p, tuy n ch n các ch ng gi ng vi sinh v t t các m u nghiên c u - Phân l p vi sinh v t có kh năng phân gi i Xenluloza trên môi trư ng chuyên tính - ðánh giá ho t tính enzym ngo i bào c a các ch ng VSV 2.4.2 ðánh giá ñ c tính sinh h c c a các ch ng vi sinh v t - Quan sát ñ c... 74% dân s làm ngh nông do v y ph th i nông nghi p r t l n và thích h p cho vi c làm phân Có nhi u phương pháp làm phân có th áp d ng, t phương pháp ñ ng tĩnh ñơn gi n nh t ñ n h th ng lên men trong các thi t b ph c t p Vi t Nam có khí h u nóng m nên các quá trình phân h y ph th i x y ra r t m nh m vì th vi c x lý ph th i làm phân là bi n pháp r t thích h p Tuy nhiên vi c x lý ph th i Vi t Nam g p m t . phát từ những vấn ñề nêu trên, tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật có khả năng phân giải mạnh xenluloza từ phế phụ phẩm nông nghiệp . Học vi n Nông nghiệp Vi t. TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN VĂN BÌNH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MẠNH XENLULOZA TỪ PHẾ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH:. TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN VĂN BÌNH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MẠNH XENLULOZA TỪ PHẾ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP LUẬN VĂN