Bước đầu khảo sát vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp lipase ngoại bào

Nhờ có tính chọn lọc hóa học, chọn lọc lập thể và chọn lọc đối hình các enzyme lipase trở thành công cụ đắc lực trong lĩnh vực tổng hợp hữu cơ và có những ứng dụng quan trọng trong công

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS TS BÙI VĂN LỆ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2009

Thành quả ngày hôm nay đạt được không chỉ nhờ những nỗ lực của bản thân mà còn nhờ rất nhiều sự giúp đỡ từ phía thầy cô, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp, những người đã động viên, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian vừa qua

Trước tiên, em kính gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy Bùi Văn Lệ, người đã tận tình hướng dẫn, gợi mở và giúp đỡ em hoàn thành luận văn này

Tôi kính gửi lời cảm ơn đến Chị Phạm Vân An – trưởng PTN Vi sinh – GMO, cùng toàn thể anh chị em đang công tác tại PTN Vi sinh – GMO, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

Bên cạnh đó, xin cảm ơn em Minh Tuấn cùng tập thể anh chị

em đang công tác tại Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật và Chuyển hóa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Anh Kiều Phương Nam, một người anh, một người Thầy, đã cho tôi những đóng góp, nhận xét kịp thời và thiết thực

Những kiến thức nền tảng trong suốt những năm học vừa qua là

cơ sở vững chắc giúp tôi thực hiện luận văn này Những kiến thức ấy có được là nhờ sự tận tụy chỉ dẫn của các thầy cô khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Luôn đồng hành, quan tâm và ủng hộ tôi trong công việc cũng như trong cuộc sống, em là người vợ, người bạn, là chỗ dựa tinh thần vững chắc Tôi muốn nói lời cảm ơn đến Em

Với tất cả tấm lòng, con xin ghi nhớ công ơn của Ba Mẹ - các bậc sinh thành dưỡng dục và những người thân trong gia đình luôn ủng hộ, động viên, nâng đỡ và dành cho con tình thương sâu sắc nhất

Xin chân thành cảm ơn!

Tp HCM, 09/09/2009 Trương Minh Mẫn

MỤC LỤC

Trang

Danh mục chữ viết tắt i

Danh mục các hình ii

Danh mục các bảng iv

Danh mục các đồ thị vi

Mở đầu 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ LIPASE 2

1.1.1 Giới thiệu 2

1.1.2 Cấu trúc lipase 3

1.1.3 Cơ chế phản ứng và tính đặc hiệu của lipase 4

1.1.4 Phân loại, đặc tính và một số tính chất của lipase 7

1.1.5 Các nguồn thu nhận enzyme lipase 10

1.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp lipase 11

1.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính lipase 12

1.1.8 Phương pháp xác định hoạt tính lipase 13

1.1.9 Ứng dụng của lipase 13

1.2 ĐỊNH DANH VI SINH VẬT THEO PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG 21

1.2.1 Định danh vi khuẩn 21

1.2.2 Định danh nấm men 22

1.2.3 Định danh nấm mốc 23

1.3 ĐỊNH DANH VI SINH VẬT DỰA VÀO VẬT LIỆU DI TRUYỀN 25

1.3.1 Thước đo tiến hóa 25

1.3.2 Định danh vi khuẩn 27

1.3.3 Định danh nấm men và nấm mốc 29

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 30

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 30

2.2 VẬT LIỆU 30

2.2.1 Thu nhận mẫu 30

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ 31

2.2.3 Môi trường và hóa chất 32

2.3 PHƯƠNG PHÁP 37

2.3.1 Phân lập các chủng vi sinh vật sinh lipase ngoại bào 37

2.3.2 Làm thuần và bảo quản các chủng vi sinh vật thu được 37

2.3.3 Phương pháp nuôi sinh tổng hợp lipase 38

2.3.4 Phương pháp thu nhận enzyme lipase 39

2.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính lipase 39

2.3.6 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford 40

2.3.7 Xác định hoạt tính riêng của enzyme lipase 42

2.3.8 Khảo sát các đặc điểm phân loại 42

2.3.9 So sánh tính tương đồng: 49

2.3.10.Phân tích vật liệu di truyền 49

2.3.11.Khảo sát một số yếu tố của môi trường cảm ứng sinh lipase 54

2.3.12.Khảo sát hoạt tính của enzyme lipase 55

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 57

3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP CÁC CHỦNG SINH LIPASE NGOẠI BÀO 57

3.2 HOẠT TÍNH LIPASE NGOẠI BÀO CÁC CHỦNG THU ĐƯỢC 59

3.3 ĐỊNH DANH VI KHUẨN 64

3.3.1 Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn 64

3.3.2 Phân tích trình tự rDNA 16S 71

3.4 ĐỊNH DANH NẤM MEN 79

3.4.1 Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men W_Q9_Y1 79

3.4.2 Phân tích đoạn trình tự D1/D2 của rRNA tiểu đơn vị lớn (LSU-rRNA; 25/26/28S) 82

3.5 ĐỊNH DANH NẤM MỐC 86

3.5.1 Các đặc điểm hình thái của chủng nấm mốc S_Q3_M2 86

3.5.2 Phân tích đoạn trình tự D1/D2 của rRNA tiểu đơn vị lớn (LSU-rRNA; 25/26/28S) 89

3.6 KHẢO SÁT YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG CẢM ỨNG 93

3.6.1 Nguồn cơ chất cảm ứng 93

3.6.2 Nồng độ cơ chất 95

3.6.3 pH của môi trường cảm ứng 96

3.6.4 Thời gian nuôi cấy 98

3.6.5 Nhiệt độ nuôi cấy 100

3.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA ENXYME LIPASE 101

3.7.1 Đường chuẩn albumin dùng trong phương pháp Bradford 101

3.7.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính lipase 103

3.7.3 Khảo sát tính bền của lipase theo pH 104

3.7.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính lipase 106

3.7.5 Khảo sát tính bền của lipase theo nhiệt độ 108

3.7.6 Ảnh hưởng của cơ chất đến hoạt tính lipase 110

3.7.7 Ảnh hưởng của EDTA và cation đến hoạt tính lipase 112

3.7.8 Ảnh hưởng của chất tẩy đến hoạt tính lipase 114

3.7.9 Khảo sát hoạt tính lipase của 2 chủng ở các điều kiện hoạt động tối ưu116 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 118

4.1 KẾT LUẬN 118

4.2 ĐỀ NGHỊ 119

TÀI LIỆU THAM KHẢO 121

Tài liệu tiếng Việt 121

Tài liệu tiếng Anh 122

Tài liệu từ internet 132

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1: Các ứng dụng trong công nghiệp của các lipase từ vi sinh vật 14

Bảng 2.1: Địa điểm, số lượng mẫu và thời gian lấy mẫu 31

Bảng 2.2: Các cặp mồi dùng trong khuếch đại và giải trình tự rDNA 16S 50

Bảng 2.3: Thành phần thực hiện phản ứng PCR khuếch đại trình tự rDNA 16S 51

Bảng 2.4: Chương trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại trình tự rDNA 16S 51

Bảng 2.5: Cặp mồi dùng trong khuếch đại và giải trình tự đoạn D1/D2 52

Bảng 2.6: Thành phần thực hiện phản ứng PCR khuếch đại trình tự D1/D2 52

Bảng 2.7: Chương trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại trình tự D1/D2 .53

Bảng 3.1: Các chủng vi sinh vật sinh lipase ngoại bào thu nhận được 57

Bảng 3.2: Hoạt tính lipase ngoại bào các chủng vi sinh vật phân lập được 60

Bảng 3.3: Một số đặc điểm hình thái, sinh lý của chủng S_CT_B2, W_TN_B1 và W_TB_B2 64

Bảng 3.4: Sự gia tăng mật độ tế bào theo thời gian của chủng S_CT_B2, kết quả là giá trị trung bình cộng của ba lần lặp lại .66

Bảng 3.5: Sự gia tăng mật độ tế bào theo thời gian của chủng W_TN_B1, kết quả là giá trị trung bình cộng của ba lần lặp lại .67

Bảng 3.6: Sự gia tăng mật độ tế bào theo thời gian của chủng W_TB_B2, kết quả là giá trị trung bình cộng của ba lần lặp lại 68

Bảng 3.7: Đặc điểm sinh hóa của 3 chủng S_CT_B2, W_TN_B1 và W_TB_B2 69

Bảng 3.8: Độ tinh sạch và nồng độ DNA bộ gen vi khuẩn thu được 71

Bảng 3.9: Đặc điểm hình thái của chủng nấm men 80

Bảng 3.10: Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng W_Q9_Y1 81

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng đến sự sinh tổng hợp lipase của 2 chủng S_CT_B2 và W_Q9_Y1 94

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến sự sinh tổng hợp lipase của 2 chủng S_CT_B2 và W_Q9_Y1 95

Bảng 3.13: Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự sinh tổng hợp lipase của 2

Bảng 3.16: Tương quan giữa giá trị ΔOD595 và nồng độ albumin 102

Bảng 3.17: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính lipase của 2 chủng S_CT_B2 và

W_Q9_Y1 103

Bảng 3.18: Ảnh hưởng của pH đến độ bền lipase của chủng S_CT_B2 105

Bảng 3.19: Ảnh hưởng của pH đến độ bền lipase của chủng W_Q9_Y1 105

Bảng 3.20: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính lipase của 2 chủng S_CT_B2 và

W_Q9_Y1 107

Bảng 3.21: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tính bền lipase của chủng S_CT_B2 108

Bảng 3.22: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tính bền lipase của chủng W_Q9_Y1 109

Bảng 3.23: Ảnh hưởng các loại dầu lên hoạt tính lipase của chủng S_CT_B2 110

Bảng 3.24: Ảnh hưởng các loại dầu lên hoạt tính lipase của chủng W_Q9_Y1 110

Bảng 3.25: Ảnh hưởng của EDTA và cation đến hoạt tính lipase của chủng

S_CT_B2 112

Bảng 3.26: Ảnh hưởng của EDTA và cation đến hoạt tính lipase của chủng

W_Q9_Y1 113

Bảng 3.27: Ảnh hưởng của chất tẩy đến hoạt tính lipase của chủng S_CT_B2 114

Bảng 3.28: Ảnh hưởng của chất tẩy đến hoạt tính lipase của chủng W_Q9_Y1 115

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

Trang

Đồ thị 3.1: Đường cong tăng trưởng của chủng S_CT_B2 66

Đồ thị 3.2: Đường cong tăng trưởng của chủng W_TN_B1 67

Đồ thị 3.3: Đường cong tăng trưởng của chủng W_TB_B2 68

Đồ thị 3.4: Ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến sự sinh tổng hợp lipase của 2

Đồ thị 3.9: Đường chuẩn albumin 102

Đồ thị 3.10: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính lipase của 2 chủng S_CT_B2 và

MỞ ĐẦU

Lipase (triacylglycerol acylhydrolase – EC 3.1.1.3) là enzyme xúc tác thủy

phân triacylglycerol thành các diacylglycerol, monoacylglycerol và các chất béo

Lipase được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, hóa chất tẩy rửa, xử

lý chất thải và nhiều ngành quan trọng khác [12], [36], [41], [81]

Trong những năm gần đây, lipase giữ một vị trí quan trong trên thị trường

enzyme thương mại do khả năng xúc tác các phản ứng ở bề mặt phân cách giữa pha

nước và pha khác (dầu, chất béo,…) Lipase chiếm 5% thị phần trên thị trường

thương mại enzyme sau protease và carbohydrase Chúng được tạo ra rộng rãi ở

thực vật, động vật và vi sinh vật Tuy nhiên, cũng giống như đa số các loại enzyme

khác, lipase được sản xuất chủ yếu bởi vi sinh vật [12], [36], [41], [81]

Các ngành công nghiệp cần rất nhiều enzyme để phục vụ cho sản xuất Tuy

nhiên, hiện nay ở Việt Nam các chế phẩm enzyme này chủ yếu vẫn là nhập khẩu,

trong đó enzyme lipase là loại enzyme rất đắt tiền nhưng được ứng dụng trong

nhiều lĩnh vực khác nhau Vì vậy, việc nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp, thu nhận

và tinh sạch lipase có hoạt tính cao từ vi sinh vật là rất cần thiết, nhằm phục vụ cho

tiềm năng sản xuất lipase trong nước với giá thành rẻ, chất lượng và hoạt tính tương

đương với các chế phẩm nhập khẩu

Trước tình hình thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Bước

đầu khảo sát vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp lipase ngoại bào nhằm các

mục tiêu sau:

¾ Xây dựng bộ sưu tập chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp

lipase ngoại bào

¾ Khảo sát đặc tính của một số vi sinh vật, điều kiện cảm ứng sinh tổng

hợp lipase của một số vi sinh vật và khảo sát đặc tính, điều kiện hoạt động của lipase làm cơ sở để chọn lựa chủng vi sinh vật cho từng mục đích sản xuất lipase khác nhau

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1: Mô hình enzyme lipase 3

Hình 1.2: Cấu trúc 3D của lipase từ Pseudomonas aeruginosa 3

Hình 1.3: Phản ứng thủy phân triacylglycerol của enzyme lipase 4

Hình 1.4: Các phản ứng do lipase xúc tác 5

Hình 1.5: Cấu trúc của trình tự mã hoá cho rRNA ở Prokaryote 27

Hình 1.6: So sánh trình tự DNA của một loài vi khuẩn chưa biết tên với Pseudomonas fluorescens, Budvicia aquatica, Edwardsiella tarda, trình tự tương đồng được tô màu đỏ 27

Hình 1.7: Tỷ lệ % nucleotide khác biệt khi so sánh trình tự nucleotide của một loài vi khuẩn chưa biết tên (AH) với Pseudomonas fluorescens (PF), Budvicia aquatica (BA), Edwardsiella tarda (ET) 28

Hình 1.8: Cây phát sinh loài được vẽ từ tỷ lệ % nucleotide khác biệt giữa loài vi loài vi khuẩn chưa biết tên (AH) với Pseudomonas fluorescens (PF), Budvicia aquatica (BA), Edwardsiella tarda (ET) 28

Hình 1.9: Cấu trúc của trình tự mã hoá cho rRNA ở Eukaryote 29

Hình 2.1: Thang chuẩn sử dụng 32

Hình 3.1: Hình ảnh một số chủng vi sinh vật sinh lipase ngoại bào trên môi trường phân lập 59

Hình 3.2: Các chủng vi sinh vật sinh lipase trên môi trường phân lập 63

Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc của 3 chủng vi khuẩn trên môi trường TSA sau 1 ngày nuôi cấy và hình thái tế bào của 3 chủng vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học, độ phóng đại 1500 lần 65

Hình 3.4: Kết quả thu nhận DNA bộ gen và sản phẩm khuếch đại trình tự rDNA 16S 72

Hình 3.5: Cây phát sinh loài tổng quát của chủng S_CT_B2 với các chủng khác trong chi Pseudomonas (số trình tự so sánh là 1188 nucleotide) 74

Hình 3.6: Cây phát sinh loài tổng quát của chủng W_TB_B2 với các chủng khác

trong chi Burkholderia (số trình tự so sánh là 1336 nucleotide) 75

Hình 3.7: Cây phát sinh loài tổng quát của chủng W_TN_B1 với các chủng khác

trong chi Bacillus (số trình tự so sánh là 969 nucleotide) 76

Hình 3.8: Cây phát sinh loài chi tiết của chủng S_CT_B2 với các chủng khác

trong chi Pseudomonas (số trình tự so sánh là 1331 nucleotide) 77

Hình 3.9: Cây phát sinh loài chi tiết của chủng W_TB_B2 với các chủng khác

trong chi Burkholderia (số trình tự so sánh là 1355 nucleotide) 78

Hình 3.10: Cây phát sinh loài chi tiết của chủng W_TN_B1 với các chủng khác

trong chi Bacillus (số trình tự so sánh là 1369 nucleotide) 78

Hình 3.11: Hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng W_Q9_Y1 80

Hình 3.12: Kết quả thu nhận DNA bộ gen và sản phẩm khuếch đại trình tự đoạn

D1/D2 của chủng W_Q9_Y1 82

Hình 3.13: Cây phát sinh loài tổng quát của chủng W_Q9_Y1 với các chủng

khác trong chi Candida (số trình tự so sánh là 323 nucleotide) 84

Hình 3.14: Cây phát sinh loài chi tiết của chủng W_Q9_Y1 với các chủng khác

trong chi Candida (số trình tự so sánh là 409 nucleotide) 85

Hình 3.15: Hình thái của chủng S_Q3_M2 88

Hình 3.16: Kết quả thu nhận DNA bộ gen và sản phẩm khuếch đại trình tự đoạn

D1/D2 của chủng S_Q3_M2 89

Hình 3.17: Cây phát sinh loài tổng quát của chủng S_Q3_M2 với các chủng khác

trong chi Aspergillus (số trình tự so sánh là 487 nucleotide) 91

Hình 3.18: Cây phát sinh loài chi tiết của chủng S_Q3_M2 với các chủng khác

trong chi Aspergillus (số trình tự so sánh là 533 nucleotide) 92

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

16S rDNA : Trình tự DNA mã hoá cho RNA ribosome tiểu phần 16S

ATCC : American Type Culture Collection

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool

bp : base pair

CTAB : Cetyl trimethylammonium bromide

DNA : Deoxyribonucleic acid

dNTP : Deoxyribonucleotide

EC : Enzyme classification

EDTA : Ethylenedinitrilotetraacetic acid

HPLC : High pressure liquid chromatography

IGS : Intergenic spacer,

ITS : Internally transcribed spacer,

LAS : alkyl benzene sulfonate

LSU-rRNA : Large subunit - rRNA

MEGA : Molecular Evolutionary Genetics Analysis

NCBI : National Center for Biotechnology Information,

PCR : Polymerase chain reaction

PUFAs : Polyunsaturarated fatty acid

pNPP : p-nitrophenyl palmitate

PVA : Polyvinyl alcohol

rRNA : ribosome Ribonucleic acid

SDS : Sodium Dodecyl Sulphate

SSU-rRNA : Small subunit - rRNA

Lipase được tổng hợp bởi nhiều vi sinh vật và các sinh vật nhân chuẩn Vi sinh vật sinh tổng hợp lipase bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc và xạ khuẩn được tìm thấy rộng rãi trong các môi trường như: nước thải công nghiệp, nhà máy chế biến dầu thực vật, sữa, đất lẫn dầu, hạt có dầu, thực phẩm thối rữa, than đá, suối nước nóng, Hầu hết lipase ứng dụng thương mại có nguồn gốc từ vi khuẩn [5], [12]

Nhờ có tính chọn lọc hóa học, chọn lọc lập thể và chọn lọc đối hình các enzyme lipase trở thành công cụ đắc lực trong lĩnh vực tổng hợp hữu cơ và có những ứng dụng quan trọng trong công nghệ sinh học như: bổ sung vào trong chất tẩy rửa, ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các thành phần thực phẩm, góp phần làm tăng sự kiểm soát trong công nghiệp giấy và bột giấy, là xúc tác sinh học trong các phản ứng chuyển hóa chọn lọc lập thể, [1], [48]

Lipase có nhiều ứng dụng triển vọng trong các quy trình hóa hữu cơ, sản xuất chất tẩy, tổng hợp chất hoạt động bề mặt, công nghiệp hóa dầu ăn, công nghiệp sữa, công nghiệp nông hóa, sản xuất giấy, chất dinh dưỡng, mỹ phẩm, bào chế thuốc, Tuy nhiên, hiện nay vẫn còn thiếu những enzyme lipase có tính chất đặc hiệu cần thiết [12], [36], [81]

Lipase vẫn là một đối tượng cần được nghiên cứu sâu do vai trò quan trọng của nó, trọng tâm nghiên cứu là xác định tính chất, cấu trúc, đánh giá cơ chế hoạt

động, động học, đọc trình tự, nhân dòng gen và xác định tính chất của enzyme tái tổ hợp Bên cạnh đó, một vấn đề ít được quan tâm là phát triển các hệ thống lên men

để thu lipase thương phẩm [12], [81]

1.1.2 Cấu trúc lipase

Cấu trúc không gian (3D) của lipase từ nấm Rhizomucor miehei và lipase từ

tuyến tụy của người đã được xác định vào năm 1990, từ đó đến nay có hơn 11 cấu trúc lipase nữa được xác định Ngoại trừ lipase từ tuyến tụy của người, tất cả các lipase còn lại đều từ vi sinh vật Các lipase này có khối lượng phân tử (19 – 60) kDa, đều biểu hiện đặc tính xoắn cuộn như xoắn α/β-hydrolase Lõi trong của lipase được cấu thành từ phiến β trung tâm bao gồm 8 chuỗi β khác nhau (β1 – β8) nối với

sự hiện diện của serine ở tâm hoạt động được xem là có tính bảo tồn cao và thường xuất hiện trong chuỗi pentapeptide Gly – Xaa – Ser – Xaa – Gly [7], [20], [49]

1.1.3 Cơ chế phản ứng và tính đặc hiệu của lipase

Lipase xúc tác cho nhiều phản ứng khác nhau bao gồm: phản ứng thủy phân, phản ứng tổng hợp ester, phản ứng chuyển ester (gồm có phản ứng rượu hóa (alcoholysis) và thủy phân glicogen (glycolysis)), phản ứng trao đổi ester (gồm có phản ứng acid hóa (acidolysis) và trao đổi ester) và phản ứng amin hóa (aminolysis)

(hình 1.4) [5], [7], [28], [80], [97]

Các phản ứng do lipase xúc tác đều là các phản ứng thuận nghịch và chiều hướng của phản ứng phụ thuộc vào lượng nước tham gia vào phản ứng Lấy phản ứng thuỷ phân triacylglycerol làm minh họa, ta có:

TAG = triacylglycerols, DAG = diacylglycerols, MAG = monoacylglycerols, FFA = free fatty acids

Hình 1.3: Phản ứng thủy phân triacylglycerol của enzyme lipase [23]

Khi cung cấp đầy đủ nước, phản ứng thủy phân xảy ra (theo chiều thuận) Ngược lại, trong điều kiện thiếu nước, phản ứng ester hóa xảy ra và tổng hợp lại glyceride từ acid béo tự do và glycerol (theo chiều nghịch) Các phản ứng này xảy

ra tại bề mặt phân cách giữa cơ chất và pha nước nên gây khó khăn cho việc phân tích động học và khảo sát hoạt tính của lipase Lipase thủy phân triacylglycerols (TAG) theo từng bậc, tạo ra diacylglycerols (DAG), monoacylglycerols (MAG) và acid béo tự do (FFA), rồi cuối cùng thủy phân hoàn toàn tạo ra glycerol và acid béo

tự do [7], [23], [28], [80]

(a) Phản ứng thủy phân

(b) Phản ứng tổng hợp ester

(c) Phản ứng chuyển ester (alcoholysis và glycolysis)

(d) Phản ứng trao đổi ester (acid hóa và trao đổi ester)

(e) Phản ứng amin hóa (aminolysis)

Hình 1.4: Các phản ứng do lipase xúc tác [5], [7]

Trong số các phản ứng trên, được quan tâm nhiều nhất là phản ứng chuyển ester hóa, acid hóa (acidolysis) và rượu hóa (alcoholysis) Sự chuyển ester hóa là sự

chuyển nhóm acyl giữa 2 ester, có thể là giữa hai triglyceride hoặc giữa một triglyceride và một acid béo Acid hóa (acidolysis) là sự chuyển nhóm acyl giữa một acid và một ester Rượu hóa (alcoholysis) là phản ứng giữa rượu và ester [7], [28], [80]

Trong tự nhiên, lipase có từ nhiều nguồn gốc khác nhau Chính sự đa dạng này đã ảnh hưởng đến tính đặc hiệu trong các phản ứng chúng xúc tác Khi xét đến tính đặc hiệu đối với các acid béo trong phân tử triglyceride thì một số lipase có ái lực với triglyceride chứa các gốc acid béo chuỗi ngắn (acetic, butyric, capric, caproic, caprylic, ), số khác lại đặc hiệu cho triglyceride gồm những acid béo chưa bão hòa (oleic, linoleic, linonic, ) Trong trường hợp là sườn glycerol của triglyceride, lipase có tính đặc hiệu theo vị trí và phân cắt acid béo liên kết với C1 hoặc C3 của phân tử glycerol hoặc ở cả 2 vị trí trên nhưng không tác động đến acid béo ở vị trí C2 của glycerol Bên cạnh đó nhiều lipase không có tính đặc hiệu và sẽ cắt ngẫu nhiên các acid béo từ triglyceride [7], [28], [97]

Do lipase chỉ hoạt động ở bề mặt phân cách giữa hai pha dầu - nước, nên lượng dầu tồn tại ở mặt phân cách sẽ quyết định hoạt tính của lipase Điều này có thể khắc phục theo hướng tăng diện tích ở bề mặt tiếp xúc giữa hai pha bằng cách tạo thể nhũ tương dầu bởi sự khuấy động mạnh với tác nhân nhũ hóa Hoạt tính của lipase có thể tăng rõ rệt khi sử dụng thể nhũ hóa dầu Do đó, cần áp dụng phương pháp nhũ hóa thích hợp để làm tăng diện tích tiếp xúc của các tế bào nhũ hóa [7], [28], [80], [97]

Lipase có ứng dụng thương mại thường là enzyme ngoại bào, được thu từ nhiều vi sinh vật khác nhau Nhiều lipase hoạt động trong dung môi hữu cơ, xúc tác một số phản ứng có lợi gồm tạo ester, chuyển ester, gắn acyl chọn lọc vị trí của glycol và menthol, tổng hợp peptid và các hóa chất khác Triển vọng là lipase sẽ trở thành một enzyme công nghiệp quan trọng như protease và carbohydrase hiện nay [5], [81]

1.1.4 Phân loại, đặc tính và một số tính chất của lipase

1.1.4.1 Phân loại và đặc tính

Enzyme thủy phân lipid có nguồn gốc từ vi sinh vật được xếp làm 8 họ [1], [20], [28]:

− Họ I, được chia làm 6 họ phụ, gọi là lipase “thật”: lipase từ Pseudomonas,

từ các vi khuẩn Gram dương như Bacillus, Staphylococcus và lipase khác như lipase từ Propionibacterium và Streptomyces

− Họ II, gồm các enzyme lipase thiếu chuỗi pentapeptide kinh điển Gly – Xaa – Ser – Xaa – Gly nhưng lại có chuỗi Gly – Asp – Ser – Leu thay thế

Trong họ này có các enzyme esterasre của Streptomyces scabies,

Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Photorhabdus luminescens và Aeromonas hydrophila

− Họ III, gồm các lipase ngoại bào của Streptomyces và Moraxella

− Họ IV, gồm các enzyme tương tự như các lipase nhạy cảm hormone ở động vật có vú

− Họ V, gồm các enzyme có nguồn gốc từ các vi khuẩn chịu nhiệt trung bình

(như Pseudomonas oleovorans, Haemophilus influenza, Acetobacter

pasteurianus), từ vi sinh vật chịu lạnh (như Moraxella sp., Psychrobacter immobilis) và những vi sinh vật chịu nóng (Sulfolobus acidocaldarius)

− Họ VI, gồm những esterase nhỏ nhất có khối lượng phân tử (23 – 26) kDa

− Họ VII, gồm những esterase vi khuẩn lớn có khối lượng phân tử khoảng

55 kDa

− Họ VIII, gồm những enzyme tương tự như các β-lactamase nhóm C

Các enzyme thủy phân lipid hiện nay đang thu hút được nhiều sự quan tâm vì chúng có tiềm năng trong nhiều ứng dụng Phần lớn lipase sử dụng trong công nghiệp là enzyme từ vi khuẩn hoặc từ nấm [20]

1.1.4.2 Một số tính chất của lipase

Động học: Trong nhiều trường hợp, lipase tuân theo động học

Michaelis-Menten, động học Michaelis-Menten được xác định qua hai thông số Km và vmax,

vmax là tốc độ tối đa của phản ứng và Km là chỉ số đo ái lực của enzyme đối với cơ chất đặc hiệu Giá trị Km thấp thể hiện ái lực cao, giá trị Km trải rộng nhưng đối với hầu hết các enzyme công nghiệp liên quan Km trải từ 10-1 đến 10-5 Các thông số

Michaelis-Menten Km và vmax của lipase tinh sạch từ chủng P cepacia là 12 mM

và 30 mmol/phút, đối với cơ chất pNPP [5], [81]

Độ bền với nhiệt: Tốc độ phản ứng tăng gấp đôi khi nhiệt độ tăng lên 10 0C, nếu enzyme bền ở nhiệt độ cao thì hiệu suất phản ứng có thể tăng lên rất nhiều khi thực hiện ở một nhiệt độ tương đối cao Do đó, độ bền với nhiệt là một tính chất mong muốn của lipase

Lipase bền nhiệt được tách chiết từ nhiều nguồn như: Bacillus sp., B

coagulans và B cereus, B stearothermophilus, Geotrichum sp., Aeromonas sobria,

P flourescens và P aeruginosa Một trong những enzyme bền với nhiệt đáng chú ý

được tách từ chủng Bacillus, enzyme này có hoạt tính tối đa ở 60 0C và giữ 100% hoạt tính ban đầu khi ủ 30 phút ở 75 0C Thời gian bán hoạt động của enzyme là 8 h

ở 75 0C, enzyme giữ ít nhất 90% hoạt tính ban đầu sau khi ủ 15 h ở 60 0C Ngoài ra còn nhiều lipase bền nhiệt khác cũng được công bố

Độ bền nhiệt của lipase có liên quan tới cấu trúc của nó, độ bền nhiệt bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như pH, sự có mặt của ion kim loại, do đó đã có nhiều thí nghiệm được thực hiện gây đột biến lipase để cải thiện độ bền nhiệt So với enzyme tự nhiên, độ bền nhiệt và hoạt động của nhiều lipase tái tổ hợp có thể được nâng cao đáng kể [5], [81]

Độ bền pH: pH tối ưu của lipase tái tổ hợp LipA chủng Ralstonia sp M1 là

10,75 và enzyme có độ bền ở dải pH kiềm (8,0 – 10,5) Lipase tự nhiên chủng

Ralstonia sp M1 có pH tối ưu tương tự pH 10 và bền ở dải pH rộng hơn (7,5 – 11)

Lipase chủng Acinetobacter sp RAG-1 bền ở dải pH (5,8 – 9,0) với hoạt tính tối đa

ở pH 9,0 Acinetobacter sp SY-01 lipase có hoạt tính tối đa ở pH 10 và bền ở dải

pH (9 – 11) B thermocatenulatus lipase BTL2 cho thấy hoạt tính tối đa ở pH (7,5 –

9,0) và độ bền ở dải pH (7 – 11), có được hoạt tính tối đa và độ bền ở dải pH kiềm

là điều kiện quan trọng cho lipase để làm phụ gia bột giặt và chất xúc tác [5], [81]

Ảnh hưởng của ion kim loại: lipase ngoại bào chủng P aeruginisa

MB5001 bị ức chế mạnh bởi 1 mM ZnSO4 (ức chế 94%) nhưng được tăng hoạt bởi

10 mM CaCl2 (tăng 1,24 lần) và 200 mM acid taurocholic (tăng 1,6 lần) hay lipase

chủng P aeruginosa KKA-5 giữ nguyên hoạt tính với sự có mặt của Ca2+ và Mg2+nhưng bị ức chế nhẹ bởi Mn2+, Cd2+ và Cu2+ Muối ion kim loại nặng (Fe2+, Zn2+,

Hg2+, Fe3+) ức chế mạnh lipase, gợi ra rằng chúng có thể thay đổi cấu hình enzyme

Trong một nghiên cứu tương tự khác với ion kim loại (1 mM) và chất tạo

gọng kìm, hoạt tính lipase từ chủng P pseudoalcaligenes F-111 bị ức chế 60% bởi

Fe3+ nhưng không bị ức chế bởi Ca2+, Hg2+, Zn2+, Mn2+, Cu2+, Mg2+, Co2+, Cd2+ và

Pb2+, chất tạo gọng kìm kim loại (EDTA, o-phenanthrolin) không ảnh hưởng quan

trọng tới hoạt tính lipase kiềm hay lipase tinh sạch từ chủng Pe roqueforti

IAM7268 không bị ảnh hưởng bởi Ca2+, Mg2+, Mn2+, Na2+, K+, Cu2+, EDTA, acid chloro mercuribenzoic và iodoacetate, ngược lại, enzyme bị ức chế bởi Ag+, Fe2+,

p-Hg2+ và isopropyl fluorophosphates [5], [81]

Ảnh hưởng của giao diện: Các phản ứng do lipase xúc tác xảy ra tại giao

diện, do đó, giao diện và chất lượng của giao diện có ảnh hưởng quan trọng lên tốc

độ phản ứng có thể quan sát được Lắc cơ học mạnh và đánh huyền phù trong cốc phản ứng sẽ tạo đủ giao diện cần thiết [5], [81]

Các dạng lipase từ một chủng vi sinh vật: lipase thu từ chủng C rugosa

tồn tại ở nhiều dạng khác nhau, sự có mặt của Tween 80 và Tween 20 trong môi trường nuôi cấy thay đổi tỷ lệ tương đối của các dạng lipase khác nhau trong môi trường so với không bổ sung Hai dạng lipase (lipase I và II) được sinh tổng hợp bởi

Rhizop niveus khác nhau ở trọng lượng phân tử, lipase I bị thủy phân hạn chế trở

thành lipase II G candidum ATCC 34614 tổng hợp 4 dạng lipase khác nhau, trong

đó lipase chính (Lipase I) không đặc hiệu vị trí còn lipase IV có tính đặc hiệu vị trí bất thường [81]

Trong những dạng lipase từ C antarctica được biết đến, lipase B có tính đặc

hiệu đồng phân đối với đồng phân R của ketoprofen trong một dung môi không phân cực như isopentyl methyl keton cũng như trong S(+)-carvone Martinelle và

cộng sự (1995) đã nghiên cứu sự hoạt hóa giao diện của các C antarctica lipase A

và B (CALB) và so sánh chúng với H lanuginose lipase CALB biểu thị không hoạt

hóa giao diện do thiếu cấu trúc nắp điều khiển sự tiếp xúc với trung tâm hoạt hóa

Lipase A và B chủng C rugosa xúc tác phản ứng thủy phân lipid p-nitrophenyl

ester, lipase A có hoạt tính cao nhất đối với caprylat, trong khi đó lipase B có hoạt tính cao nhất đối với laurat, hai enzyme này tương đồng với nhau ở nhiều mặt Dịch

lipolytic thương mại của C viscosum chứa hai dạng khác nhau [5], [81]

1.1.5 Các nguồn thu nhận enzyme lipase

Lipase được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau (Phụ lục I, II): lipase từ

thực vật, lipase từ động vật và lipase từ vi sinh vật, đặc biệt là từ vi khuẩn và nấm,

đã có một vài lipase thu nhận từ vi sinh vật có giá trị thương mại (Phụ lục III) [5],

[81]

Nguồn lipase từ động vật quan trọng nhất là từ tụy tạng của bò, cừu và lợn Lipase từ tụy tạng lợn là một trong những lipase được biết đến sớm nhất và khá thông dụng Hạn chế của lipase từ tụy tạng là chúng chứa những hợp chất có mùi và

vị khó chịu như trypsine, tạo vị đắng nên không được ưa chuộng Bên cạnh đó, nguồn lipase này còn có khả năng lây truyền virus từ động vật sang người nên hiện nay xu hướng sử dụng lipase từ vi sinh vật đang được ưa chuộng do đặc tính đa dạng, dễ tách chiết và nguyên liệu vô hạn [5], [81]

1.1.5.1 Lipase từ vi khuẩn

Lipase từ vi khuẩn được nghiên cứu từ khá sớm và đầy đủ (Jaeger và cộng sự (1999)) Đa số lipase của vi khuẩn là các glycoprotein, nhưng một số lipase ngoại bào là lipoprotein hay còn gọi là lipase thật (EC 3.1.1.3) Các nghiên cứu cũng chỉ

ra rằng lipase vi khuẩn được biết cho tới nay thường không đặc hiệu và chỉ có một

số ít có tính bền nhiệt Trong số các vi khuẩn thì Acromobacter sp., Alcaligenes sp.,

Arthrobacter sp., Pseudomonas sp và Chromobacterium sp đã được đưa vào sản

xuất lipase công nghiệp [7], [20], [49], [70], [80]

1.1.5.2 Lipase từ nấm

Lipase từ nấm đã được nghiên cứu từ những năm 1950 Ưu điểm của loại lipase này là dễ thu nhận, tính ổn định theo pH và nhiệt độ, tính đặc hiệu với cơ chất

và khả năng hoạt động trong dung môi hữu cơ

Lipase thương mại thường được sản xuất bởi Aspergillus niger, Candida

cylindracea, Hummicola lanuginosa, Mucor miehei, Rhizopus arrhizus, Rhizopus delemar, Rhizopus japonicus, Rhizopus niveus và Rhizopus oryzae

Lipase sản xuất bởi Candida rugosa đã nhanh chóng trở thành một trong

những enzyme được dùng nhiều nhất trong công nghiệp do hoạt tính cao về khả năng thủy phân cũng như tổng hợp [7], [17], [35], [67], [80], [97]

1.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp lipase

Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để xác định sự ảnh hưởng tới năng suất sinh tổng hợp lipase bởi các yếu tố như: nồng độ nguồn carbon và nitơ, pH dịch nuôi cấy, nhiệt độ phát triển, nồng độ oxy hòa tan, [5], [7], [37], [81]

Nguồn carbon và chất cảm ứng: Nguồn carbon dạng lipid nói chung có tác

dụng gia tăng sự sinh tổng hợp lipase ở vi sinh vật, tuy nhiên có một vài tác giả đã cho sinh tổng hợp lipase với năng suất cao nhưng không có dầu mỡ Triglyceride là chất quan trọng cho sự sinh tổng hợp lipase do nó vừa đóng vai trò là chất cảm ứng cũng như là chất ức chế sự sinh tổng hợp enzyme lipase Trong số các triglyceride, dầu olive được nhận thấy là một chất cảm ứng tốt cho sự sinh tổng hợp lipase của

đa số các vi sinh vật Tuy nhiên, khi bổ sung lipid ở dạng tự nhiên vào môi trường nuôi sẽ làm giảm sự sinh trưởng và tổng hợp lipase của vi sinh vật Trong khi đó dạng nhũ tương hóa của dầu bởi gum arabic hoặc polyvinyl alcohol (PVA) lại kích thích quá trình sinh trưởng và tổng hợp lipase của vi sinh vật [5], [7], [37], [81]

Nguồn Nitơ: Cũng giống như nguồn carbon, nguồn nitơ ảnh hưởng rất mạnh

lên năng suất sinh tổng hợp lipase của các chủng vi sinh vật Cordenons và cộng sự (1996) đã khảo sát nhiều nguồn nitơ khác nhau để sinh tổng hợp lipase ngoại bào từ

Aci calcoacetius Amino acid và trypton cho năng suất tổng hợp lipase cao gấp (2 –

3) lần so với ammoni, cao nấm men và protease pepton Tuy nhiên, năng suất lipase

và độ bền có thể được cải thiện khi bổ sung nguồn nitơ hữu cơ [5], [7], [37], [81]

Nhiệt độ: Nhiệt độ của môi trường nuôi là một thông số quan trọng cho sự

sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp lipase của vi sinh vật Nếu như nhiệt độ dưới mức tối ưu thì vi sinh vật phát triển chậm và lượng lipase tạo ra bị hạn chế Ngược lại, nếu nhiệt độ quá cao, có thể làm chết tế bào hoặc ảnh hưởng tới hoạt tính lipase, kết quả là giảm năng suất tạo thành sản phẩm [5], [7], [37], [81]

pH: pH của môi trường là yếu tố quan trọng cho sự tổng hợp lipase Nếu như

đối với Pseudomonas aeruginosa hoạt tính lipase tạo ra cao nhất ở pH môi trường

là 9,0 thì pH tối ưu cho sự phát triển của Pseudomonas aeruginosa lại hơi acid (4,0

– 7,0) Do đó, trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp lipase cần điều chỉnh pH cho thích hợp ở từng giai đoạn [5], [7], [81]

Ion kim loại: quá trình sinh tổng hợp lipase của một số chủng vi sinh vật có

thể được tăng cường hoặc bị ức chế tùy từng loài bởi một số ion kim loại như:

Mg2+, Ca2+, Cu2+, Na2+, Co2+, Fe2+, K+, Mn2+, Mo2+, Zn2+ khi được bổ sung vào môi trường [5], [7], [81]

Chế độ không khí: ảnh hưởng khác nhau tùy thuộc vào từng loại vi sinh vật

hạt thầu dầu có pH tối ưu (4,0 – 4,2) Lipase kiềm thu nhận từ Pseudomonas

nitroreducens có pH tối ưu là 11 [5], [7], [81]

1.1.7.2 Nhiệt độ

Lipase chiết xuất từ tụy tạng bị mất hoạt tính ở 40 0C, nhưng một số lipase ở

vi sinh vật lại có tính bền nhiệt Trong khi lipase của Aspergillus niger, Rhizopus

japonicus và Candida viscosum bền ở 50 0C, lipase của một số vi sinh vật chịu nhiệt

có thể hoạt động ở nhiệt độ lên đến (60 – 70) 0C như của Pseudomonas

nitroreducens Lipase của Aspergillus terreus giữ được 100% hoạt tính ở 60 0C trong 24 giờ [5], [7], [81]

1.1.7.3 Chất tăng hoạt và kìm hãm

Enzyme lipase hoạt động không cần cofactor, tuy nhiên sự hiện diện của một

số các cation kim loại như Ca2+, Na+ sẽ làm tăng hoạt tính của lipase Hoạt tính của lipase bị bất hoạt bởi Co2+, Ni2+, Hg2+ và Sn2+, bị kìm hãm nhẹ bởi Zn2+, Mg2+ và EDTA [5], [7], [81]

1.1.7.4 Cơ chất

Tính chuyên biệt của lipase được hình thành do cấu trúc không gian của enzyme và cơ chất, các yếu tố ảnh hưởng đến liên kết giữa enzyme với cơ chất Tính chuyên biệt về cơ chất của lipase rất quan trọng trong phân tích và ứng dụng cho mục đích công nghiệp Tính chuyên biệt về cơ chất thể hiện ở cả hai phần acid béo và nhóm rượu của cơ chất như đã trình bày ở trên Đa số các vi sinh vật tổng hợp nhiều loại lipase ngoại bào với tính chuyên biệt cơ chất khác nhau [5], [7], [81]

1.1.8 Phương pháp xác định hoạt tính lipase

Hoạt tính enzyme lipase được xác định dựa trên lượng acid béo tự do được giải phóng Một số phương pháp thông dụng như phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 420 nm sử dụng p-nitrophenylester là cơ chất, định phân lượng acid béo

tự do với NaOH, phương pháp sử dụng đồng vị phóng xạ, xác định vòng phân giải với tributyrin, định lượng acid béo tự do bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Trong các phương pháp trên thì phương pháp xác định vòng phân giải với tributyrin và định phân lượng acid béo tự do với NaOH là hai phương pháp thông dụng để định tính khả năng sản suất lipase và xác định hoạt tính của enzyme lipase [5], [7], [81]

1.1.9 Ứng dụng của lipase

Trong khoảng cuối thế kỷ 20, lipase được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học, dược phẩm, protein đơn bào, xử lý chất thải và các chế phẩm sinh học khác Lipase trở thành một phần quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm hiện đại và được sử dụng rộng rãi trong quá trình chế biến nhiều loại sản phẩm như:

nước trái cây, rau quả, các sản phẩm từ sữa, Lipase cũng được dùng trong ngành công nghiệp thuộc da và giặt tẩy [1], [7], [12], [36], [41], [52], [80], [81]

Những ứng dụng chính của lipase được tóm tắt trong Bảng 1.1 Hầu hết

lipase công nghiệp có nguồn gốc từ vi khuẩn và nấm

Nguyên nhân chính làm cho lipase vi sinh vật có tiềm năng lớn trong công nghệ sinh học là:

− Ổn định trong các dung môi hữu cơ

− Hoạt động không cần cofactor

− Có nhiều cơ chất đặc trưng

− Biểu hiện tính chọn lọc đối hình cao

Bảng 1.1: Các ứng dụng trong công nghiệp của các lipase từ vi sinh vật [12], [81]

Công nghiệp Hoạt tính Sản phẩm hay ứng dụng Chất tẩy Thủy phân chất béo Loại các vết bẩn dầu từ vải

Thực phẩm sữa Thủy phân chất béo của sữa, làm

chín phomát, biến đổi chất béo của bơ

Tăng cường các chất mùi thơm trong sữa, phomát và bơ

Các loại bánh Cải thiện mùi thơm Kéo dài thời gian sử dụng

Nước giải khát Cải tiến mùi hương Các loại nước giải khát

Bao bì thực

phẩm

Cải tiến chất lượng Mayonnaise, các loại bao bì và

các loại chỉ khâu Thực phẩm

chức năng

Chuyển đổi sự ester hóa Thực phẩm chức năng

Thịt và cá Tăng cường hương vị Các sản phẩm thịt và cá, loại bỏ

chất béo Các chất béo và

Hóa chất Chọn lọc đối kháng, tổng hợp Các khối kết tinh, hóa chất

Công nghiệp Hoạt tính Sản phẩm hay ứng dụng Dược phẩm Chuyển đổi sự ester hóa, thủy

phân

Các lipid đặc trưng, các chất trợ tiêu hóa

Mỹ phẩm Tổng hợp Chất nhũ tương hóa, chất tạo ẩm

Giấy Thủy phân Cải thiện chất lượng giấy

Chất làm trắng Thủy phân Loại bỏ chất béo

1.1.9.1 Công nghiệp chất tẩy [1], [7], [12], [81]

Ứng dụng thương mại quan trọng nhất của lipase là làm phụ gia trong công nghiệp chất tẩy rửa và bột giặt gia đình, hàng năm có khoảng 1 000 tấn lipase được cho vào 13 tỉ tấn chất tẩy rửa Để tăng khả năng tẩy rửa, các chất tẩy hiện đại đều chứa một hoặc nhiều loại enzyme như protease, amylase, cellulase và lipase

Lipase được chọn trong công nghiệp giặt tẩy phải thỏa mãn các yêu cầu sau đây: (1) hoạt tính đặc hiệu cơ chất thấp, nghĩa là có khả năng thủy phân nhiều cơ chất khác nhau; (2) có khả năng chịu được các điều kiện giặt khắt khe (pH (10-11), (30 – 36) 0C); (3) có khả năng chịu được tác động của các chất hoạt động bề mặt gây phân hủy và các enzyme (thí dụ các alkyl benzene sulfonate (LAS), protease,

là các thành phần quan trọng của nhiều loại bột giặt) Lipase với những đặc tính mong muốn phải qua một tổ hợp sàng lọc liên tục và trên cơ sở kỹ thuật protein

Năm 1994, Novo Nordisk đã đưa ra thị trường lipase tái tổ hợp thương mại

“Lipolase” có nguồn gốc từ nấm Thermomyces lanuginosus và được biểu hiện ở A

oryzae Năm 1995, hai lipase vi khuẩn được đưa vào thị trường là “Lumafast” từ P mendocina và “Lipomax” từ P alcaligenes do công ty Genencor International sản

xuất

Hiện nay, lipase được sử dụng trong giặt tẩy được tổng hợp từ nhiều nguồn

khác nhau như: Candida, Chromobacterium, Acinetobacter radioresistens,

Pseudomonas,

1.1.9.2 Công nghiệp thực phẩm [1], [7], [12], [81]

Dầu và mỡ là thành phần quan trọng trong thực phẩm Vị trí gắn của acid béo với khung glycerol và độ bão hòa của acid béo quyết định giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan cho thực phẩm Lipase cho phép chúng ta biến đổi các tính chất của lipid bằng cách thay đổi vị trí của chuỗi acid béo và thay thế một hoặc nhiều acid béo bằng các acid mới Con đường này, lipid ít mong muốn và tương đối rẻ có thể được biến đổi thành mỡ có giá trị cao

Bơ cocoa, một mỡ có giá trị cao, chứa palmitic và stearic acid, có điểm nóng chảy vào khoảng 37 0C Bơ cocoa tan chảy trong miệng sinh ra một cảm giác lạnh thích thú như chocolate Công nghệ dựa vào lipase liên quan tới các phản ứng thủy phân hỗn hợp và tổng hợp được thương mại hóa để nâng cao một vài loại mỡ kém chất lượng thành chất thay thế bơ cocoa Một kiểu quá trình sử dụng lipase từ

Rhizomucor miehei cố định cho phản ứng chuyển ester thay thế palmitic acid trong

dầu cọ với stearic acid

Các acid béo không bão hòa (polyunsaturarated fatty acid – PUFAs) được sử dụng nhiều làm dược phẩm, thuốc an thần và phụ gia thực phẩm Nhiều PUFAs cần thiết cho tổng hợp các màng lipid bình thường và protaglandings Lipase vi khuẩn được sử dụng để thu nhận PUFAs từ lipid động vật và thực vật như dầu cá mòi, dầu

cá ngừ, dầu cây borage PUFAs tự do và dạng mono- hay diglycerides của nó được

sử dụng tiếp để sản xuất một số loại dược phẩm bao gồm thuốc chống béo phì, chống viêm nhiễm, chống tắc nghẽn Hơn nữa, lipase được sử dụng để phát triển mùi vị của phomát, bánh và nước uống Lipase cũng được sử dụng để loại mỡ ra khỏi những sản phẩm thịt và cá

1.1.9.3 Công nghiệp giấy và bột giấy [1], [7], [12], [81]

Một lĩnh vực ứng dụng khác cũng không kém phần quan trọng của lipase là loại bỏ “pitch” (dầu hắc ín hay các hợp chất kỵ nước trong bột gỗ chủ yếu là triglyceride và sáp), gây ra nhiều khó khăn trong sản xuất bột giấy và giấy Lipase được sử dụng để tẩy dầu hắc ín trong bột giấy Công ty giấy Nippon Paper

Industries, Nhật Bản, đã phát triển một phương pháp sử dụng lipase thu từ Canada

rugosa để loại dầu hắc ín, thủy phân tới 90% triglyceride có trong gỗ

Triglyceride, steryl ester, resin acid, acid béo tự do và sterol là những chất được tìm thấy trong gỗ gây ra những tác động xấu lên hoạt động của máy chế tạo giấy và chất lượng giấy Do đó, 19 loại enzyme lipase thương mại đã được khảo sát

hoạt tính về khả năng phân giải steryl ester và thấy rằng lipase của Pseudomonas sp., Chromobacterium viscosum và Candida rugosa có hoạt tính esterase cao nhất

Cả 3 loại enzyme trên đều có khả năng thủy phân hoàn toàn steryl ester khi có mặt của chất tẩy

1.1.9.4 Công nghiệp sữa [7], [37], [80]

Lipase được dùng trong ngành công nghiệp sữa để thủy phân chất béo trong sữa, tạo mùi cho phomát, đẩy nhanh quá trình chín của phomát, sản xuất các sản phẩm khác từ phomát và thủy phân lipid trong bơ Nếu việc giải phóng các acid béo chuỗi ngắn (C4 – C6) giúp tạo mùi thì các acid béo chuỗi dài (C12 và C14) lại giúp tăng hương vị cho thực phẩm

Hiện nay, lipase vi sinh vật đang được nghiên cứu và phát triển cho ngành

công nghiệp sản xuất phomát như lipase của Mucor miehei, Aspergillus niger và

Aspergillus oryzae Các loại phomát chất lượng tốt hiện nay đều được sản xuất nhờ

sử dụng lipase hoặc hỗn hợp nhiều loại enzyme của vi sinh vật

1.1.9.5 Biosensor (cảm biến sinh học) [7], [36], [41]

Một lĩnh vực mới đầy tiềm năng trong việc ứng dụng của lipase vi sinh vật là biosensor Với những tiến bộ của khoa học kỹ thật đã sử dụng mẫu dò là enzyme được đánh dấu để tránh tình trạng không ổn định và các chất đồng vị nguy hiểm khi

sử dụng mẫu dò là DNA được đánh dấu Khi sàng lọc nhiều loại enzyme thủy phân thì lipase tỏ ra có tính ứng dụng cao trong lĩnh vực này

Phương pháp này cho phép chẩn đoán nhanh và chính xác một số bệnh liên quan đến tim mạch như hàm lượng cholesterol trong máu Các lipase không đặc

hiệu, đặc biệt là lipase của Candida rugosa, đã được phát triển thành mẫu dò

1.1.9.6 Sản xuất nhiên liệu sinh học [7], [36], [41], [80]

Ngày nay việc tìm ra nguồn nguyên liệu mới không gây ô nhiễm môi trường, giá thành rẻ đang trở thành vấn đề cấp bách cho toàn thế giới đặc biệt khi nguồn nguyên liệu hóa thạch đang trên đà cạn kiệt Các nhà khoa học khám phá ra cách sử dụng dầu thực vật như là nguồn thay thế, dầu thực vật khi sử dụng không sinh ra sulphur oxide và giảm lượng bồ hóng còn một phần ba so với dầu mỏ Do tính thân thiện với môi trường, nhiên liệu sinh học được kỳ vọng là nguồn nguyên liệu chính trong tương lai

Lipase cố định từ Pseudomonas cepacia dùng trong phản ứng chuyển ester

hóa giữa dầu nành với ethanol và methanol tạo ra alkyl ester (biodiesel) Lipase thương mại Novozym 435 cũng dùng xúc tác phản ứng chuyển ester hóa của dầu nành để sản xuất biodiesel trong môi trường không dung môi

1.1.9.7 Mỹ phẩm [7], [41]

Công ty quốc tế Unichem (Tây Ban Nha) đã thành công trong sản xuất isopropyl myristate, isopropyl palmitate và 2-ethylhexylpalmitate có công dụng làm

dịu trong các sản phẩm chăm sóc da của mình Lipase cố định từ Rhizomucor

meihei được sử dụng làm chất xúc tác trong quá trình sản xuất các chất trên

Unichem cũng cho biết sử dụng enzyme trong sản xuất mỹ phẩm thay vì dùng acid theo thông lệ cho sản phẩm chất lượng tốt hơn và giảm bớt các khâu tinh chế

Retinoid (Vitamin A và các dẫn xuất) là sản phẩm thương mại mang đến nhiều lợi nhuận cả trong mỹ phẩm lẫn dược phẩm được xúc tác bởi enzyme lipase

cố định Lipase còn được dùng để sản xuất các sản phẩm chăm sóc tóc, chất làm bóng trong mỹ phẩm,

1.1.9.8 Y học [7], [36], [41]

Lipase có khá nhiều ứng dụng trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe con người như tham gia vào quá trình tổng hợp Niknomycin-B, thuốc chống viêm như: Naproxen, ibuprofen, suprofen và ketoprofen, tác nhân chống virus dương lamividine,

Lipase được sử dụng từ khá sớm trong các liệu pháp chữa trị chứng khó tiêu, đầy hơi, dị ứng bởi thức ăn, Lipase từ thực vật được dùng để bào chế các loại thuốc hỗ trợ tiêu hóa như Similase, Vitaline Herbal Formulas được sản xuất bởi Health Care Professionals, Oregon, Hoa Kỳ

Lipase thu nhận từ Candida rugosa dùng sản xuất lovastatin, một loại thuốc

làm giảm lượng cholesterol trong máu Lipase còn được sử dụng là chất kích hoạt nhân tố hoại tử khối u và được dùng trong một số liệu pháp chữa trị các khối u ác tính

1.1.9.9 Tổng hợp hữu cơ [1], [12], [81]

Sử dụng lipase trong tổng hợp hữu cơ đang trở nên quan trọng hơn Lipase được sử dụng để xúc tác một loạt các chuyển hóa đặc hiệu đồng phân, đặc hiệu vùng và đặc hiệu hóa

1.1.9.10 Chuyển hóa sinh học trong môi trường nước [12], [81]

Phản ứng thủy phân ester bởi lipase thường được thực hiện trong dung môi

có nước hai pha Phản ứng thủy phân p-nitrophenyl palmitate (pNPP) trong

n-heptane bởi dịch lipase từ P cepacia đã sử dụng lipase cố định trên nền sol-gel kỵ

nước để chuyển hóa nhiều hóa chất

Đột biến cũng được sử dụng để nâng cao tính đặc hiệu đồng phân của lipase Thí dụ, trong một trường hợp, tính đặc hiệu đồng phân của phản ứng thủy phân

ester đồng phân do lipase xúc tác (lipase từ P aeruginosa) đã tăng từ 2% lên 81% chỉ sau 4 chu kỳ gây đột biến Lipase-acryl transferase từ C parapsilosis biểu thị

xúc tác phản ứng sinh tổng hợp acid hydroxamic béo trong một môi trường có nước hai pha Cơ chất trong phản ứng là chất cho acyl (acid béo hoặc methyl ester của acid béo) và một hydroxylamine Sự chuyển hóa nhóm acyl từ ester cho sang hydroxylamine (aminolysis) được xúc tác ưu tiên so với phản ứng của các acid béo

tự do

1.1.9.11 Chuyển hóa sinh học trong môi trường hữu cơ [12], [81]

Enzyme trong môi trường hữu cơ không có pha nước tự do được biết biểu thị các tính chất bất thường có lợi và tạo ra các hệ thống enzyme không nước để tổng

hợp và chuyển hóa sinh học Lipase được nghiên cứu rộng rãi cho chuyển hóa không nước khác nhau

1.1.9.12 Gắn nhóm acyl đặc hiệu vùng [12], [81]

Lipase acyl hóa một số steroid, đường và dẫn xuất đường với tính chọn lọc đồng phân cao Đường monoacyl hóa được sản xuất trong pyridine không nước từ

triethyl carboxylates và các monosaccharide khác nhau Tuy nhiên, lipase từ A

niger xúc tác khử acyl đặc hiệu vùng của methyl b-D- glucopyranoside đã gắn acyl

1.1.9.13 Tổng hợp ester [12], [81]

Lipase được sử dụng thành công làm chất xúc tác tổng hợp ester Các ester được sản xuất từ acid béo chuỗi ngắn có ứng dụng làm các chất thơm trong công nghiệp thực phẩm Methyl và ethyl ester của acid béo chuỗi dài được sử dụng làm giàu diesel From và cộng sự (1997) đã nghiên cứu ester hóa acid lactic và cồn với

lipase từ C antarctica trong hexane Phản ứng ester hóa của 5 đồng phân vị trí của

các acetylenic acid béo (chuỗi dài khác nhau) với n-butanol được nghiên cứu bởi Lie và cộng sự (1998) sử dụng 8 lipase khác nhau Arroyo và cộng sự (1999) ghi nhận rằng giá trị hoạt tính nước cân bằng trước tối ưu là cần thiết để thu nhận một tỉ

lệ cao ester hóa (R, S) – ibuprofen Janssen và cộng sự (1999) thông báo về ester

hóa của sulcatol vào acid béo trong tuluene, được xúc tác bởi lipase từ C rugosa

(CRL) Krishnakant và Madamwar (2001) đã sử dụng lipase cố định trên silica và Organogesls dựa vào vi nhũ, để tổng hợp ester

1.1.9.14 Công nghiệp hóa dầu [12], [81]

Sử dụng lipase trong qui trình hóa dầu tiết kiệm năng lượng và giảm thiểu phân hủy do nhiệt trong các phản ứng alcoholysis, asidolysis, thủy phân và glycerolysis Mặc dù lipase có tác dụng thủy phân các liên kết ester của triacylglycerol, lipase có thể xúc tác phản ứng ngược (tổng hợp ester) trong môi trường ít nước Thủy phân và ester hóa có thể xảy ra đồng thời trong một quá trình được biết như trao đổi ester Phụ thuộc vào cơ chất, lipase có thể xúc tác phản ứng acidolysis, alcoholysis và chuyển ester hóa

1.2 ĐỊNH DANH VI SINH VẬT THEO PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN

THỐNG

1.2.1 Định danh vi khuẩn

Phương pháp truyền thống để định danh vi sinh vật thường dựa vào các chỉ tiêu phân loại như: đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý, đặc điểm biến dưỡng và đặc điểm sinh thái [8], [75]

− Các đặc điểm hình thái của một chủng vi sinh vật bao gồm: hình dạng và kích thước tế bào, hình dạng và màu sắc khuẩn lạc, khả năng di động và

sự hiện diện của các cơ quan như: tiêm mao, tiên mao, bào tử, màng nhầy

và các thể vùi…

− Đặc điểm sinh lý và đặc điểm biến dưỡng năng lượng bao gồm: khả năng

sử dụng nguồn carbon và nitrogen, phương thức biến dưỡng năng lượng, các sản phẩm tạo ra trong quá trình trao đổi chất, mối quan hệ với oxy, khả năng chịu áp suất thẩm thấu, khoảng nhiệt độ và pH thích hợp…Trong đó các thử nghiệm sinh hóa về đặc điểm sinh lý và đặc điểm biến dưỡng năng lượng là các chỉ tiêu cơ bản nhất trong phân loại vi sinh vật [75]

Các kết quả thử nghiệm sinh hóa của hàng trăm loài vi sinh vật tại nhiều phòng thí nghiệm khác nhau trên thế giới được tổng hợp thành những bảng sinh hoá định danh vi sinh vật Bảng sinh hóa bao gồm các đặc điểm sinh hóa đặc trưng nhất

để phân biệt các loài vi sinh vật Mỗi đặc điểm sinh hóa được biểu thị bằng một trị

số là tỉ lệ phần trăm thử nghiệm sinh hóa cho kết quả dương tính theo thống kê ở một loài vi sinh vật Như vậy, trị số 100 có nghĩa là 100% trường hợp của loài này

đã được thử đều cho kết quả dương tính Tuy nhiên, trong thực tế các kết quả thử nghiệm sinh hóa biểu thị quy ước bằng các ký hiệu như: (+): dương tính; (-): âm tính; (+/-): khoảng trên 70% là dương tính và (-/+): khoảng trên 70% là âm tính [14], [65]

Thông thường, để định danh được loài vi sinh vật mục tiêu theo phương pháp truyền thống ta phải dựa vào các khóa phân loại (hay bảng sinh hóa) Khoá phân

loại prokarytote đầy đủ nhất, được sử dụng rộng rãi là khoá phân loại Bergey’s (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, ninth edition) [14], [46], [65], [75]

Tuy nhiên, trong một số trường hợp cần phải dựa vào đặc điểm của vật liệu

di truyền để có thể định danh một cách chính xác chủng vi sinh vật mục tiêu

1.2.2 Định danh nấm men

1.2.2.1 Khảo sát các đặc điểm hình thái [3], [9], [10], [38], [61], [79]

Nấm men là vi sinh vật, có kích thước rất nhỏ, ta không thể quan sát chúng bằng mắt thường mà phải quan sát dưới kính hiển vi Nấm men thường được quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại vài chục đến vài ngàn lần Các loài nấm men khác nhau thì khác nhau về hình thái tế bào, dạng bào tử, khuẩn ty

Hình thái tế bào nấm men thường có hình cầu, hình elip, hình bầu dục, hình que,… kích thước tế bào nấm men cũng lớn hơn tế bào vi khuẩn Khi quan sát tế bào nấm men dưới kính hiển vi cần xác định dạng nẩy chồi đa hướng, nẩy chồi hai đầu, nẩy chồi đơn hướng hay kiểu sinh sản phân đôi tế bào

Bào tử túi của các loài nấm men khác nhau về số lượng bào tử trong nang, màu sắc và hình dạng bào tử (hình cầu, hình thận, hình nón, hình sao thổ hay hình kim)

Một số loài nấm men tạo khuẩn ty giả trong điều kiện thiếu oxy Các loài nấm men khác nhau thì dạng khuẩn ty cũng khác nhau (khuẩn ty có vách ngăn đôi

và có nẩy chồi, khuẩn ty thật tách thành các đốt)

1.2.2.2 Khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa [3], [9], [10], [38], [61], [79]

Các loại nấm men có đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác nhau Vì vậy, đây là yếu tố quan trọng để định danh nấm men

Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu của các loài nấm men thì không giống nhau Hầu hết chúng phát triển tốt ở nhiệt độ (20 – 28) 0C Tuy nhiên, có loại lại tăng trưởng mạnh ở nhiệt độ (4 – 15) 0C hay (35 – 37) 0C

Tùy thuộc vào cấu trúc màng khác nhau mà nấm men có thể chịu được áp suất thẩm thấu cao hay thấp Điều này giải thích vì sao có loài sống được trên môi

trường có nồng độ đường hay muối cao có loài lại không tồn tại được trên môi trường đó

Khả năng biến dưỡng của nấm men cũng được sử dụng trong định danh vì các loài nấm men có khả năng đồng hóa nguồn carbon, nguồn nitơ, khả năng lên men, phân giải ure,… không giống nhau

Mỗi loài nấm men đều có nhiều loại enzyme khác nhau, chủng loại của các enzyme này quyết định các đặc điểm kiểu hình, các đặc tính sinh lý, sinh hóa của nấm men Môi trường sống và mối tương tác với môi trường tạo áp lực chọn lọc để mỗi loại nấm men tiến hóa có được những enzyme cần cho sự tồn tại và tăng trưởng tốt nhất của nấm men trong môi trường

1.2.3 Định danh nấm mốc

1.2.3.1 Yêu cầu chung [3], [11], [69], [73], [78]

– Các chủng cần định danh phải được nuôi cấy trên các môi trường, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy theo đúng quy định của các khoá phân loại đối với từng chi nấm mốc

1.2.3.2 Quy trình định danh [3], [11], [69], [73], [78]

™ Quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên thạch

– Hình dạng

– Kích thước (đường kính, bề dày)

– Dạng mặt (nhung mượt, mịn, len xốp, dạng hạt, lồi lõm, có khía hay không…)

– Màu sắc khuẩn lạc mặt trên và mặt dưới

– Dạng mép khuẩn lạc (mỏng, dày, phẳng, nhăn nheo…)

– Giọt tiết nếu có (nhiều, ít, màu sắc)

– Mùi khuẩn lạc (có, không mùi)

– Sắc tố hoà tan (màu của môi trường xung quanh khuẩn lạc) nếu có

– Các cấu trúc khác: bó sợi, bó giá (synnematous or sporodochial conidiomata) các cấu trúc mang bào tử trần (fruit body - conidiomata)

như đĩa giá (acervuli) hoặc túi giá (pycnidia), đệm nấm (stroma), hạch nấm (sclerotia) vv

™ Quan sát các đặc điểm vi học

– Sợi nấm (hyphae) có vách ngăn, không có vách ngăn, có mấu

– Bào tử trần (conidia): kiểu phát sinh bào tử trần (ở nấm bất toàn), hình dạng, kích thước, màu sắc, bề mặt (nhẵn, có gai, gồ ghề) cách sắp xếp đơn độc chuỗi gốc non (basipetal) chuỗi gốc già (acropetal) khối cầu vv…

– Bộ máy mang bào tử (spore apparatus): nang bào tử và nang bào tử nhỏ (nếu có) (sporangia & sporangiola) hình dáng, kích thước, màu sắc, bề mặt của nang, cuống nang, không hoặc có nhánh (nhánh mọc vòng, mọc cách, hợp trục vv…); bào tử nang (hình dạng, kích thước, bề mặt, …) ở nấm tiếp hợp

– Bộ máy mang bào tử trần (conidiogenous apparatus): giá bào tử trần (conidiophore) - kích thước, đường kính, chiều dài, bề mặt (nhẵn, có gai,

có nốt sần, vv…) màu sắc, có vách ngang hoặc không, có hoặc không có cấu trúc đặc biệt như tế bào chân (foot cell) sợi cứng (setae) tăng trưởng

ở gốc hoặc ở ngọn có hoặc không có dạng hình thái đặc biệt như bó giá, đệm giá Các nhánh (của bào tử trần) số lượng nhánh, kích thước bề mặt, màu sắc, cách sắp xếp (đối xứng, không đối xứng sát nhau hoặc tẽ rộng,

vị trí dọc giá bào tử trần hoặc tập trung ở ngọn giá) vv…

– Tế bào sinh bào tử trần (conidiogenous cell) : Kiểu tế bào sinh bào tử trần (thể bình, dạng có khuyên ở đỉnh, dạng sinh bào tử trần đồng thời, như dạng bình (phialo type); dạng phân đốt (annello type)) Dạng sinh bào tử trần không đồng thời (aleurio- type), bào tử đính kiểu nẩy chồi (blasto - type), dạng sinh bào tử trần qua lỗ để lại sẹo (poro - type) vv hình dạng, kích thước, màu sắc, cách sắp xếp (đơn độc hoặc thành cụm, thành vòng),

vị trí (trên sợi nấm, dọc theo giá bào tử trần, các nhánh hoặc ở đính giá) vv…

– Thể quả túi (ascocarp) như cleistothecium, cần khảo sát vị trí, số lượng, hình dạng, kích thước, màu sắc, bề mặt của thể quả, quan sát túi bào tử (ascus) bào tử túi (ascospore) về hình dạng, kích thước bề mặt

– Nếu có chủng nấm mốc mẫu của loài (hoặc thứ) vừa xác định thì tiến hành so sánh các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm vi học của chủng mẫu với các đặc điểm tương ứng của chủng cần định danh Nếu các đặc điểm của 2 chủng phù hợp với nhau thì có thể khẳng định chắc chắn loài (hoặc thứ) của chủng nấm mốc cần định danh

1.3 ĐỊNH DANH VI SINH VẬT DỰA VÀO VẬT LIỆU DI TRUYỀN

1.3.1 Thước đo tiến hóa

Thước đo tiến hóa dùng để đo sự thay đổi về mặt tiến hóa dựa trên các đại phân tử của tế bào Sự khác nhau về trình tự nucleotide hay amino acid của các đại phân tử được tách chiết sẽ cho biết khoảng cách tiến hóa giữa hai sinh vật đó Số lượng thay đổi tỷ lệ với số lượng thay đổi do đột biến bền vững trên phân tử DNA Khi có các đột biến khác nhau trên các quần thể khác nhau thì xảy ra hiện tượng tiến hóa sinh học và dẫn đến kết quả cuối cùng là sự đa dạng sinh học [8], [9], [10], [27], [88]

Muốn xác định mức tiến hóa chính xác giữa các sinh vật thì cần phải chọn một đại phân tử phù hợp để nghiên cứu trình tự của DNA Đại phân tử này đảm bảo các yêu cầu sau [8], [9], [27], [88]:

+ Phân tử phải có mặt ở tất cả các sinh vật

+ Có cùng chức năng trong các sinh vật

+ Phân tử không được di truyền qua lại giữa các loài

+ Trình tự của phân tử này có độ bảo tồn và biến động thích hợp

+ Phân tử phải có kích thước đủ lớn để chứa nhiều thông tin

Có rất nhiều phân tử được đề xuất làm thước đo tiến hóa và cũng có nhiều nghiên cứu về trình tự để thiết lập cây phát sinh chủng loài từ các phân tử này Các phân tử được đề xuất bao gồm: Cytochrome, hemoglobin, ferredoxin, gene mã hóa cho một số protein và RNA ribosome Trong các phân tử này thì phân tử phù hợp nhất là các gene mã hóa cho RNA ribosome – một thành phần quan trọng trong hệ thống dịch mã [8], [88], [91]

RNA ribosome chiếm tới 80% tổng số RNA của tế bào Tùy vào hệ số lắng S (sedimentation) rRNA được chia thành nhiều loại: ở sinh vật Eukaryote có rRNA 25/26/28S của tiểu đơn vị lớn (LSU), 16/18S của tiểu đơn vị nhỏ (SSU), 5,8S và 5S, còn các rRNA ở prokaryote là 23S, 16S và 5S [8], [88], [91]

Bởi vì rRNA đóng vai trò quan trọng, đảm nhận một chức năng duy nhất ở tất cả các sinh vật, có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn có những vùng trình tự ribonucleotide khác biệt giữa các loài và trình tự đặc trưng cho từng nhóm sinh vật Do vậy, rRNA được xem là một thước đo tiến hoá ở sinh vật và cũng chính là công cụ hữu ích cho phân loại và định danh vi sinh vật Kỹ thuật này không chỉ dựa vào trình tự rRNA mà thường dựa vào rDNA (trình tự mã hoá cho rRNA), vì DNA là vật liệu dễ thu nhận và có tính bền cao hơn RNA [8], [88], [91]

Trong các loại rRNA thì phân tử rRNA 16S thích hợp nhất cho mục tiêu phân loại ở prokaryote và rRNA 18S cho eukaryote vì kích thước vừa phải của nó (khoảng 1500 ribonucleotide của rRNA 16S ở prokaryote và khoảng 2300 ribonucleotide của rRNA 18S ở eukaryote) Tuy nhiên, ở eukaryote thì trình tự đoạn

D1/D2 của rRNA tiểu đơn vị lớn (LSU-rRNA; 25/26/28S) và vùng ITS-5.8S ITS lại được sử dụng phổ biến trong mục tiêu phân loại [8], [9], [10], [42], [59], [60], [62], [88], [97]

rRNA-1.3.2 Định danh vi khuẩn

Phương pháp định danh vi sinh vật dựa vào đặc điểm di truyền là một phương pháp hiện đại cho kết quả chính xác trong thời gian ngắn, thao tác đơn giản Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và hoá chất đắt tiền

Như được đề cập ở trên, phân tử rDNA 16S được sử dụng làm thước đo tiến hóa ở prokaryote do đó nó được sử dụng phổ biến trong định danh vi khuẩn Một vài vùng trên rRNA 16S của tất cả prokaryote có tính bảo tồn cao, trong khi đó tại

một số vùng khác lại có một số khác biệt (Hình 1.6) [8], [99]

Khi một trình tự rDNA 16S được giải mã hoàn toàn ta có thể định danh được loài vi sinh vật mục tiêu nhờ so sánh trình tự rDNA 16S của loài vi sinh vật đang quan tâm với tất cả các trình tự rDNA 16S của tất cả các loài vi sinh vật lưu trữ trong ngân hàng gen nhờ vào công cụ BLAST, hay kết hợp sử dụng các phần mềm

để so sánh mức độ tương đồng của các trình tự (Hình 1.7) Từ những cơ sở dữ liệu

này ta có thể vẽ được cây phát sinh loài, thể hiện mối quan hệ tiến hoá của các loài

và vị trí của loài vi sinh vật cần định danh (Hình 1.8) [8], [99]

Hình 1.5: Cấu trúc của trình tự mã hoá cho rRNA ở Prokaryote [8]

Pseudomonas fluorescens (PF) gctaataccgcatacgtcctacgggagaaagcagggg Loài vi chưa biết tên (AH) .gctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagcggggg

Budvicia aquatica (BA) gctaataccgcgtaacgtcgaaagaccaaagcggggg

Edwardsiella tarda (ET) gctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagtggggg

Hình 1.6: So sánh trình tự DNA của một loài vi khuẩn chưa biết tên với

Pseudomonas fluorescens, Budvicia aquatica, Edwardsiella tarda, trình tự tương

đồng được tô màu đỏ [99]