Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy hợp chất chứa clo tại Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Nguyễn Thị Nhật Ánh PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HỢP CHẤT C

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Nhật Ánh

PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HỢP

CHẤT CHỨA CLO TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội – 2013

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc nhất

đến PGS TS Nguyễn Quang Huy, người Thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho

em những kĩ năng nghiên cứu cũng như những kiến thức cần thiết trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài Bên cạnh đó Thầy đã tạo điều kiện học tập và nghiên cứu tốt nhất cho em để em có thể hoàn thành tốt luận văn này

Tiếp đến em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn và cung cấp cho em những kiến thức bổ ích trong suốt khóa học

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, các anh chị, các bạn, các em sinh viên trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa Sinh, phòng Enzyme học và Phân tích hoạt tính sinh học, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Protein và Enzym, Trung tâm Nghiên cứu khoa học sự sống đã hướng dẫn và giúp

đỡ em trong thời gian em nghiên cứu tại các phòng thí nghiệm

Đề tài được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài mã số KLEPT 01-12

do PGS.TS Nguyễn Quang Huy chủ trì được ĐHQG Hà Nội, Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzym và protein, nhân dịp này em xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên và ủng hộ em trong suốt thời gian học tập cũng như quá trình hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Học viên

Nguyễn Thị Nhật Ánh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Hợp chất halogen và hợp chất clo hữu cơ 3

1.1.1 Sự phổ biến của hợp chất halogen trong tự nhiên 3

1.1.2 Ứng dụng của hợp chất clo hữu cơ 4

1.1.3 Sự ô nhiễm môi trường các hợp chất clo hữu cơ 7

1.1.4 Tác động của hợp chất clo hữu cơ đối với môi trường và con người 7

1.1.5 Cách thức gây độc của các hợp chất clo hữu cơ đối với cơ thể 9

1.2 Tình hình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc halogen ở Việt Nam 10

1.3 Một số phương pháp xử lý ô nhiễm hợp chất clo hữu cơ 12

1.3.1 Phương pháp vật lý 12

1.3.2 Phương pháp hóa học……… 12

1.3.3 Phương pháp sinh học 14

1.4 Vi sinh vật phân hủy hợp chất clo hữu cơ 16

1.5 Tình hình nghiên cứu sự phân hủy hợp chất halogen bằng vi sinh vật tại Việt Nam 18

1.6 Một số hợp chất clo hữu cơ 19

1.6.1 Hợp chất 1,2 - Dichloroethane (1,2 - DCE) 19

1.6.2 Hợp chất 2,2-Dichloropropionate Sodium (2,2-DCPS) 20

1.6.3 Hợp chất 3,4-Dichloroaniline (3,4-DCA) 21

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Nguyên liệu 23

2.2 Hóa chất – Dụng cụ 23

2.2.1 Môi trường nuôi cấy 23

2.2.2 Hóa chất 24

2.3 Máy móc, thiết bị 24

2.4 Phương pháp nghiên cứu 24

2.4.1 Phương pháp thu mẫu 24

2.4.2 Phân lập vi sinh vật 24

2.4.3 Phương pháp bảo quản giống 25

2.4.4 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng hợp chất clo……… 26

2.4.5 Phương pháp phân loại các chủng nghiên cứu 26

2.4.6 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hóa của các chủng nghiên cứu 27

2.4.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường và khả năng sử dụng một số hợp chất clo lên các chủng nghiên cứu 28

2.4.8 Đánh giá khả năng phân hủy hợp chất clo 30

2.4.9.Phương pháp thống kê sinh học……… ……30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng một số hợp chất clo 32

3.2 Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng hợp chất clo 36

3.3 Đặc điểm hình thái của các chủng nghiên cứu 37

3.3.1 Nhuộm Gram 37

3.3.2 Chụp hiển vi điện tử quét 3 chủng nghiên cứu 38

3.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh hóa các chủng nghiên cứu bằng sử dụng kit thử API 39

3.5 Phân loại các chủng nghiên cứu bằng phương pháp giải trình tự gen 16S ARNr 43

3.6 Ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường lên khả năng sinh trưởng của các chủng nghiên cứu 45

3.6.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy……… 44

3.6.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 47

3.6.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 48

3.7 Khả năng sử dụng các hợp chất clo khác 50

3.8 Đánh giá khả năng phân hủy Cl- 51

3.8.1 Đường chuẩn Cl-……….50

3.8.2 Khả năng phân hủy hợp chất 2,2 DCP của chủng NP2 511

3.8.3 Khả năng phân hủy hợp chất 1,2 DCE của chủng DE1 53

KẾT LUẬN 55

KIẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Công thức một số thuốc là hợp chất halogen hữu cơ 5

Hình 2 Tác động của thuốc BVTV đến môi trường 7

Hình 3 Công thức hóa học của 1,2-DCE 19

Hình 4 Công thức hóa học của 2,2-DCPS 21

Hình 5 Công thức hóa học của 3,4-DCA 21

Hình 6 Ảnh khuẩn lạc trên môi trường MGB cơ chất 3,4-DCA……… 32

Hình 7 Ảnh khuẩn lạc trên môi trường MGB cơ chất 2,2-DCPS 34

Hình 8 Ảnh khuẩn lạc trên môi trường MGB cơ chất 1,2-DCE 36

Hình 9 Ảnh phát triển khuẩn lạc trên môi trường MGB bổ sung Bromothymol blue và hợp chất clo tương ứng của 3 chủng NP2, NA4 và DE1 37

Hình 10 Ảnh hình thái các chủng vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100……… 37

Hình 11 Ảnh hình thái các chủng vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 10000 39

Hình 12 Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng NA4 43

Hình 13 Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng NP2 44

Hình 14 Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng DE1 44

Hình 15 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự sinh trưởng của chủng NP2 45

Hình 16 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự sinh trưởng của chủng NA4 46

Hình 17 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự sinh trưởng của chủng DE1 46

Hình 18 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của 2 chủng NP2 và NA4 47

Hình 19 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của chủng DE1 48

Hình 20 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự sinh trưởng của chủng NA4 49

Hình 21 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự sinh trưởng của chủng NP2 49

Hình 22 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự sinh trưởng của chủng DE1 50

Hình 23 Đường chuẩn biểu thị sự phụ thuộc tuyến tính 51

Hình 24 Khả năng phân hủy cơ chất 2,2-DCP của chủng NP2 52

Hình 25 Khả năng phân hủy cơ chất 1,2-DCE của chủng DE1 53

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Ứng dụng của một số hợp chất clo hữu cơ 4 Bảng 2 Một số loại thuốc BVTV có nguồn gốc Clo đang được sử dụng………… 5 Bảng 3 Giới hạn tối đa cho phép của dư lượng hoá chất bảo vệ thực vật nguồn gốc

clo hữu cơ trong đất 11

Bảng 4 Đặc điểm khuẩn lạc phân lập trên môi trường MGB bổ sung cơ chất 3,4-

các loại cơ chất khác nhau………50

MMY Minimal media containing yeast extract

CMAI Chemical Market Associates Inc

MỞ ĐẦU

Hợp chất nhóm halogen là những hợp chất được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp, nông nghiệp, y học… Bên cạnh những lợi ích mang lại thì việc sử dụng tràn lan và thải ra môi trường mà không có phương pháp xử lý triệt để đã và đang gây ra những hậu quả nghiêm trọng đến môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe con người Việc áp dụng các phương pháp vật lý, hóa học để giải quyết tình trạng ô nhiễm gây

ra bởi các hợp chất halogen cho hiệu quả cao song chi phí đắt cũng như đòi hỏi công nghệ hiện đại Phương pháp sinh học sử dụng khả năng phân giải của vi sinh vật tự nhiên được đánh giá là tiềm năng cao không chỉ cho hiệu quả nhanh chóng

mà còn mang tính bền vững, ít tốn kém, thân thiện với môi trường Trong tự nhiên tồn tại các nhóm vi sinh vật có khả năng sử dụng hợp chất halogen để thực hiện các quá trình trao đổi chất, duy trì các hoạt động sống của cơ thể, chuyển hóa các hợp chất halogen từ dạng độc hại trở nên ít độc hơn hoặc không còn độc với môi trường sinh thái và con người

Việt Nam là nước sản xuất nông nghiệp với khí hậu nhiệt đới nóng và ẩm thuận lợi cho sự phát triển của cây trồng song cũng thuận lợi cho sự phát sinh, phát triển của sâu bệnh, cỏ dại gây hại mùa màng, do vậy hàng năm Việt Nam sử dụng một lượng lớn hóa chất bảo vệ thực vật mà chủ yếu là các hợp chất nguồn gốc clo hữu cơ Việc sử dụng tràn lan các hợp chất này dẫn đến tồn dư các loại hợp chất này lớn đã gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng Ở Việt Nam hiện chưa có nhiều nghiên cứu cơ bản về việc ứng dụng vi sinh vật có hoạt tính phân giải hợp chất halogen để giải quyết ô nhiễm môi trường, đồng thời nhận thấy tiềm năng của phương pháp sinh học do đó chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài

“PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HỢP CHẤT CHỨA CLO TẠI VIỆT NAM” với mục tiêu phân lập, xác định các đặc điểm sinh học các

chủng có hoạt tính sử dụng hợp chất chứa clo tại Việt Nam

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hợp chất halogen và hợp chất clo hữu cơ

Các hợp chất halogen hữu cơ là một lớp lớn các chất hóa học tự nhiên và tổng hợp, có chứa một hoặc nhiều gốc halogen gồm Flo, Clo, Brom, Iot kết hợp với cacbon và các yếu tố khác

Hợp chất hữu cơ halogen được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực quan trọng của đời sống như công nghiệp, nông nghiệp, y học,… Ngày nay cùng với sự phát triển của nền nông nghiệp hiện đại là thực trạng sử dụng nhiều các hóa chất bảo vệ thực vật có thành phần chính là hợp chất halogen mà chủ yếu là hợp chất có chứa clo Bên cạnh lợi ích to lớn như diệt trừ sâu bệnh, tăng năng suất… thì việc sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật này lại ảnh hưởng xấu đến môi trường, phá hủy sự bền vững của hệ sinh thái do tính độc hại, khó bị phân hủy, tích tụ trong đất, nước, động vật, thực vật, nghiêm trọng hơn còn gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người

1.1.1 Sự phổ biến của hợp chất halogen trong tự nhiên

Số lượng các hợp chất halogen tự nhiên đã được phát hiện tăng từ 30 loại năm 1968 lên gần 3.900 loại trong đầu những năm 2000 Chúng được tổng hợp từ các sinh vật biển, vi khuẩn, nấm, thực vật, côn trùng và một số động vật có vú Ví

dụ tảo, nấm, một số cây, thực vật phù du sản xuất ra chloromethane, mối sản xuất ra chloroform Một số loại rau sản xuất bromomethane Trong rong biển người ta tìm thấy hơn một trăm loại hợp chất hữu cơ halogen [34]

Muối clo và muối brom thường xuất hiện trong thực vật, đất, và các mỏ địa chất; cháy rừng và núi lửa cũng sinh ra hợp chất halogen Lượng chloromethane toàn cầu tạo ra từ sinh khối là 5 triệu tấn mỗi năm, trong khi đó lượng tổng hợp chỉ

có 26.000 tấn mỗi năm Núi lửa tạo ra khí hydro clorua (3 triệu tấn / năm) và hydro florua (11 triệu tấn / năm), cả hai chất này đều có thể phản ứng với các hợp chất hữu

cơ để hình thành các hợp chất nhóm halogen [34]

1.1.2 Ứng dụng của hợp chất clo hữu cơ

Hợp chất hữu cơ halogen nói chung và hợp chất clo hữu cơ nói riêng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của đời sống

Trong công nghiệp chúng có nhiều ứng dụng quan trọng sau đây

- Chất dẻo

Polyvinyl clorua (PVC) được trùng hợp từ vinyl clorua (CH2=CHCl), là loại nhựa

nhiệt dẻo được sản xuất và tiêu thụ nhiều thứ 3 trên thế giới (Theo CMAI) PVC là

một thành phần không thể thiếu của vật liệu xây dựng, hàng tiêu dùng, thiết bị y tế,

và nhiều sản phẩm dân dụng khác thường ngày Hơn 2,2 tỷ kg (tương đương trị giá

5 tỷ bảng Anh) của PVC được sử dụng hàng năm cho dây điện, dây cáp, và các ứng dụng điện khác Clo trong PVC làm cho loại nhựa này chống cháy do đó nó là nguyên liệu lý tưởng cho các ứng dụng trong xây dựng và trang trí nội thất [62]

- Dung môi

Dung môi clo là dung môi phổ biến nhất trong số các dẫn xuất halogen Trichloroethylene (CHCl=CCl2) và tetrachloroethylene (CCl2=CCl2) được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp sản xuất dung môi làm sạch khô bề mặt [48]

Bảng 1 Ứng dụng của một số hợp chất clo hữu cơ [23]

1,2,4- Triclobenzen 14.300 - Sản xuất thuốc diệt cỏ, thuốc nhuộm và

Trong sản xuất dược phẩm, 80% các dược phẩm và vitamin là liên quan đến clo, nhiều loại thuốc cần có clo để gây tác dụng Ceclor và Lorabid được sử dụng để điều trị nhiễm trùng tai, Toremifene là một loại thuốc chống ung thư vú, và vancomycin kháng sinh tự nhiên được sử dụng để chống lại nhiễm trùng kháng penicillin Clorua benzyl được sử dụng để tổng hợp các loại thuốc phenobarbital, benzedrine, và demerol Thuốc mê hô hấp bao gồm các organofluorines desflurane, sevoflurane và enflurane (CHClFCF2OCHF2 ) Các hợp chất Perfluorocacbon, chẳng hạn như perfluorotributylamine ([CF3 CFz CF2CF2]3N), được sử dụng để thay thế máu hoặc chế tạo "máu nhân tạo" và được sử dụng cho tạo hình động mạch vành [52]

Hình 1 Công thức một số thuốc là hợp chất halogen hữu cơ: (a) Lorabid- thuốc

kháng sinh; (b) Toremifene- thuốc ung thư vú; (c) Mitotane- thuốc chống ung thư Hợp chất hữu cơ halgen được sử dụng trong sản xuất nông nghiệp và bảo vệ cây trồng vì nó là thành phần của thuốc bảo vệ thực vật Việt Nam là nước nông nghiệp, khí hậu nhiệt đới nóng và ẩm thuận lợi cho sự phát triển của cây trồng song cũng thuận lợi cho sự phát sinh, phát triển của sâu bệnh, cỏ dại gây hại mùa màng

Do vậy việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (TBVTV) mà phần lớn có nguồn gốc từ các hợp chất clo để phòng trừ sâu hại, dịch bệnh bảo vệ mùa màng là phổ biến Một

số hóa chất như 2,2-Dichloropropionic acid, Trichloroacetic acid, Dichlorobenzen là thành phần chính của thuốc diệt cỏ và thuốc trừ sâu [8,55]

1,4-Bảng 2 Một số loại thuốc BVTV có nguồn gốc Clo đang được sử dụng [29]

Tên thường gọi và thành phần chính Công thức hóa học

1.1.3 Sự ô nhiễm môi trường do các hợp chất clo hữu cơ

Các dung môi clo là những chất dễ bay hơi thoát vào khí quyển trong quá trình sản xuất, vận chuyển và sử dụng gây ra ô nhiễm không khí Nhiều hóa chất clo nông nghiệp bốc hơi một phần khuếch tán đi xa tới cả các vùng cực mà ở đây không

có sản xuất nông nghiệp Các quá trình công nghiệp như luyện kim, pha sơn, giặt khô, sản xuất giấy,… cũng là một nguồn gây ô nhiễm môi trường [16]

Các hóa chất nông nghiệp có chứa clo khi sử dụng gây ô nhiễm cho đất, nước và nông sản Do độ bền hóa học lớn nên các thuốc bảo vệ thực vật dễ tồn lưu trong đất đai, cây trồng, nông sản, thực phẩm Chúng làm cho môi trường bị ô nhiễm trong một thời gian lâu dài Thời gian phân hủy 95% hoạt chất trong điều kiện tự nhiên của DDT là 10 năm; BHC là 6,5 năm; Dieldrin là 8 năm; Chlordane là 3,5 năm Lượng thuốc lưu tồn không những làm cho phẩm chất, hình thức của nông sản bị xấu đi mà còn gây độc cho người hay gia súc sử dụng nông sản đó, như BHC thường để lại mùi khó chịu trên nông sản như khoai tây, rau, đậu [65]

1.1.4 Tác động của hợp chất clo hữu cơ đối với môi trường và con người

Nhược điểm lớn nhất của các hợp chất clo hữu cơ là có tính hoá học bền, nên tồn lâu trong môi trường, gây ô nhiễm môi trường Một số thuốc trong nhóm có khả năng tích luỹ trong cơ thể, gây trúng độc mãn tính cho người và động vật máu nóng, gây hiện tượng chống thuốc của sâu hại, ảnh hưởng xấu đến cân bằng sinh học, gây hại cho côn trùng có ích [8]

Hình 2 Tác động của thuốc BVTV đến môi trường và con đường chuyển hóa [8]

Trên thế giới ước tính có khoảng 39 triệu người có thể bị ngộ độc cấp tính hàng năm do ảnh hưởng của hóa chất bảo vệ thực vật Trong đó có khoảng 3 triệu người bị ngộ độc cấp tính nghiêm trọng và 220 nghìn người tử vong mỗi năm Đi đôi với số lượng hóa chất bảo vệ thực vật sử dụng tăng là số người ngộ độc hóa chất BVTV cũng tăng, đặc biệt là tại các nước đang phát triển, 99% trường hợp ngộ độc xảy ra ở các nước này, cho dù lượng tiêu thụ hóa chất bảo vệ thực vật chỉ chiếm 20% Tuy nhiên, phần lớn người nông dân tại cá nước này chưa nhận biết đầy đủ về tác hại cũng như nguy cơ do hóa chất BVTV gây ra [38]

Những nghiên cứu trong vài năm gần đây tại Việt Nam cũng đưa ra các số liệu đáng quan ngại Theo báo cáo của tổ chức WHO (World Heath rganization), vào năm 2002, từng có 7.170 trường hợp nhiễm độc thuốc trừ sâu được ghi nhận tại Việt Nam Kết quả xét nghiệm máu ngẫu nhiên của 190 nông dân ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long cho thấy hơn 35% mẫu bị nhiễm thuốc trừ sâu cao và 21% bị nhiễm ở nồng độ thấp [69]

Trong năm 2007 theo thống kê sơ bộ tại 38 tỉnh, thành phố đã xảy ra gần 4.700 vụ, với 5.207 trường hợp bị nhiễm độc hóa chất bảo vệ thực vật và 106 người

đã tử vong Năm 2009 có 4.372 vụ nhiễm độc với 4.515 trường hợp, trong đó 138 trường hợp tử vong, chiếm tỷ lệ 305% (Theo Cục Y tế dự phòng và môi trường năm

là có giảm, nhưng không đáng kể Điều tra nguyên nhân gây ngộ độc chủ yếu do tình trạng lạm dụng và sử dụng bừa bãi hóa chất BVTV trong đó 98% trường hợp lạm dụng hoặc pha đặc hơn so với hướng dẫn trên bao bì 2-3 lần; có từ 84,17% đến 93,23% không sử dụng đầy đủ phương tiện bảo vệ cá nhân khi phun hóa chất bảo vệ thực vật [7,12]

Mỗi năm trên thế giới sản xuất và tiêu thụ khoảng 24 triệu tấn hợp chất clo hữu cơ Trong hệ nước ngầm và nước thải công nghiệp thường tìm thấy một số hợp chất như 1,2-Dichloroethane (1,2-DCE), Tetrachloroethylene (TTCE), 1,1,2-Trichloroethene (1,1,2-TCE) với nồng độ cao gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người cũng như hệ sinh thái [61] Một số chất độc đã bị cấm sử dụng như hexaclorocyclohexan (HCH) nhưng nhiều nước vẫn còn sản xuất hoặc sử dụng như các nước ở Châu Phi, Ấn Độ và các nước khác do chưa tìm được chất thay thế Chất DDT cũng là một chất khuyến cáo không nên sử dụng nhưng hằng năm hiện nay vẫn còn được sản xuất ở một số nước để dùng vào mục đích y tế [10,23]

Dung môi clo có thể ảnh hưởng đến hệ thống thần kinh trung ương, thận và gan, gây viêm da và kích ứng da, mắt, đường hô hấp trên và màng nhầy Qua tiếp xúc lâu ngày với dung môi có thể dẫn đến trầm cảm, nhức dầu, buồn ngủ, bất tỉnh

và thậm chí tử vong Một số dung môi clo có thể gây ung thư ở chuột, khi cho chuột tiếp xúc với các dung môi này ở nồng độ cao Việc sử dụng quá nhiều các dung môi clo đã gây ảnh hưởng đến môi trường như biến đổi khí hậu, gây mưa axit hay sự hình thành sương khói [73]

1.1.5 Cách thức gây độc của các hợp chất clo hữu cơ đối với cơ thể

Thuốc BVTV xâm nhập vào cơ thể con người bằng các con đường như qua

da, qua miệng, qua hô hấp và gây ngộ độc đến tính mạng con người

- Con đường qua da: Thuốc thâm nhập qua da diễn ra khá phổ biến nhất

- Con đường qua miệng và hô hấp: Thuốc xâm nhập qua đường miệng thường gây ngộ độc rất nặng

Khi thuốc bảo vệ thực vật tồn dư trong thực phẩm vào cơ thể qua con đường

ăn uống, chúng có thể bị loại bớt theo khí thở, theo phân hoặc nước tiểu, tuy nhiên không thể tránh khỏi sự chuyển hóa các chất độc hại này ở trong gan Một số thuốc

bảo vệ thực vật chuyển hóa thành những sản phẩm ít độc hơn, dễ hòa tan trong nước hơn thì sẽ dễ dàng bị loại bỏ, nhưng cũng có những loại hóa chất lại tạo thành những chất trao đổi trung gian độc hơn (như paration chuyển thành paraoxon), tích lũy trong một số cơ quan hoặc mô mỡ gây tổn thương và kèm theo các triệu chứng ngộ độc nguy hiểm Thuốc bảo vệ thực vật có trong thức ăn, đồ uống với lượng lớn

có thể gây ngộ độc cấp tính gây rối loạn tiêu hóa (nôn mửa, tiêu chảy), rối loạn thần kinh (nhức đầu, hôn mê, co giật hoặc co cứng cơ ), trụy tim mạch, suy hô hấp rất

dễ dẫn dến tử vong [10]

Nhóm Clo hữu cơ bao gồm những hợp chất hữu cơ rất bền vững trong môi trường tự nhiên và thời gian bán phân huỷ dài (ví dụ như DDT có thời gian bán phân huỷ là 20 năm, chúng ít bị đào thải và tích luỹ vào cơ thể sinh vật qua chuỗi thức ăn) Đại diện của nhóm này là Aldrin, Dieldrin, DDT, Heptachlo Chúng là những chất độc với tế bào thần kinh Các hợp chất Clo hữu cơ còn ức chế hoạt tính của men ATPaze và một số men khác, làm các tế bào thần kinh bị nhiễm độc Các hợp chất clo hữu cơ ức chế hoạt tính của các enzyme hô hấp oxidase, hydrogenase, xitocrom làm tích luỹ axit xetonic, ngăn cản chu trình Kreb trong quá trình hô hấp hậu quả là gây ức chế sự chuyển hoá năng lượng trong quá trình trao đổi chất [71]

1.2 Tình hình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc halogen ở Việt Nam

Thuốc bảo vệ thực vật là các chất hay hỗn hợp chất tự nhiên hoặc tổng hợp

có tác dụng kiểm soát, đẩy lùi các loại sâu và côn trùng gây tác hại đến thực phẩm, phát tán bệnh tật Các loại hóa chất bảo vệ thực vật gồm nhiều loại, chủ yếu gồm 4 nhóm chính đó là họ clo hữu cơ (organochloride), họ lân hữu cơ (organophosphate),

họ carbamate, họ cúc (pyrethoid) Ngoài ra, còn có một số nhóm khác như nhóm triazole, nhóm benzimidazole, các chất trừ sâu vô cơ (nhóm asen), nhóm thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn, nấm, virus (thuốc trừ nấm, trừ vi khuẩn) [8]

Thuốc BVTV đã góp phần hạn chế sự phát sinh, phát triển của sâu bệnh, ngăn chặn và dập tắt các đợt dịch bệnh trên phạm vi lớn, bảo đảm được năng suất cây trồng, giảm thiểu thiệt hại cho nông dân Tuy nhiên, những năm gần đây việc sử dụng thuốc BVTV trong thâm canh sản xuất, đặc biệt trong thâm canh hoa, cây

cảnh có xu hướng gia tăng cả về chất lượng lẫn chủng loại Một thực tế hiện nay là việc sử dụng thuốc BVTV tràn lan, không thể kiểm soát đã và đang gây ảnh hưởng xấu đến môi trường đất, nước, không khí, sức khoẻ con người và môi trường sinh

thái [76]

Trong sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam các loại thuốc BVTV đã được sử dụng từ nhiều năm trước đây Tuy nhiên thời kỳ đó, do tình hình phát sinh, phát triển của sâu hại, dịch bệnh diễn biến chưa phức tạp nên số lượng và chủng loại thuốc BVTV chưa nhiều Do thiếu thông tin về các chủng loại thuốc BVTV nên người nông dân đã sử dụng nhiều loại thuốc BVTV có độc tính cao, tồn lưu lâu trong môi trường

Những năm gần đây, do thâm canh tăng vụ, tăng diện tích, do thay đổi cơ cấu giống cây trồng nên tình hình sâu bệnh diễn biến phức tạp hơn Vì vậy số lượng

và chủng loại thuốc BVTV sử dụng cũng tăng lên Nếu như trước năm 1985 khối lượng thuốc BVTV dùng hàng năm khoảng 6.500 đến 9.000 tấn thành phẩm quy đổi

và lượng thuốc sử dụng bình quân khoảng 0,3 kg hoạt chất /ha thì thời gian từ năm

1991 đến nay lượng thuốc sử dụng biến động từ 25- 38 ngàn tấn [71]

Việc sử dụng thuốc BVTV không rõ nguồn gốc xuất xứ và cùng với đó các loại bao bì, chai lọ đựng thuốc BVTV không được xử lý đúng cách cũng đang là mối nguy cơ đe dọa nghiêm trọng tới sức khỏe cộng đồng và gây ô nhiễm môi trường Các thành phần độc hại trong thuốc BVTV sẽ thâm nhập vào các nguồn nước mưa, nước thải, nước sinh hoạt trực tiếp hoặc gián tiếp tác động lên con người [74]

Bảng 3 Giới hạn tối đa cho phép của dư lượng hoá chất bảo vệ thực vật nguồn gốc

clo hữu cơ trong đất [11]

STT Tên thuốc trừ sâu, diệt cỏ

Biện pháp oxy hóa ở nhiệt độ cao

Biện pháp oxy hóa ở nhiệt độ cáo gồm 2 giai đoạn chính:

Giai đoạn 1: Tách chất ô nhiễm ra hỗn hợp đất bằng phương pháp hóa hơi

Giai đoạn 2: Chất ô nhiễm được phá hủy ở nhiệt độ cao Liên kết C-Cl trong phân

tử bị phá vỡ bằng cách thiêu đốt trong bằng O2 không khí ở nhiệt độ cao, trong các

lò đốt được thiết kế đặc biệt [73]

Đây là biện pháp tổng hợp vừa tách chất ô nhiễm ra khỏi đất, vừa làm sạch triệt để chất ô nhiễm, hiệu suất xử lý cao (trên 95%), cặn bã tro sau xử lý chiếm tỷ

lệ nhỏ (0,01%) Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là không được sử dụng phổ biến do chi phí tốn kém đặc biệt là bước để nâng nhiệt độ lên tới hơn 900°C, không áp dụng cho xử lý đất bị ô nhiễm kim loại nặng, cấu trúc sau xử lý bị phá hủy Mặt khác phương pháp này không an toàn về phương diện môi trường do khí thải còn lẫn nhiều chất độc, cần phải lọc trước khi thải ra môi trường, quá trình đốt hình thành các sản phẩm phụ như dioxin, dibenzofuran là những hợp chất còn độc hại gấp nhiều lần [13]

Phân hủy bằng tia cực tím (UV) hoặc bằng ánh sáng mặt trời

Các phản ứng phân hủy bằng tia UV hay bằng ánh sáng mặt trời thường có tác dụng Làm đứt gẫy mạch vòng hoặc mối liên kết giữa cacbon với clo sau đó thay thế nhóm clo bằng nhóm phenyl hoặc nhóm hydoxyl và giảm độ độc của hoạt chất Phương pháp này có hiệu suất cao, chi phí xử lý thấp, rác thải an toàn với môi trường Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là không thể áp dụng để xử lý chất ô nhiễm hay chất thải có nồng độ đậm đặc [73] Nếu áp dụng để xử lý ô nhiễm

đất thì lớp đất trực tiếp được tia UV chiếu không dày hơn 5mm Do đó, khi cần xử

lý nhanh lớp đất bị ô nhiễm tới các tầng sâu hơn 5mm thì biện pháp này ít được sử dụng và đặc biệt trong công nghiệ xử lý hiện trường [38]

Phá hủy bằng vi sóng Plasma

Biện pháp này được tiến hành trong thiết bị cấu tạo đặc biệt Hợp chất clo hữu cơ được dẫn qua ống phản ứng sinh ra sóng phát xạ electron cực ngắn Sóng phát xạ electron tác dụng vào các phân tử hữu cơ tạo ra nhóm gốc tự do và sau đó

dẫn tới các phản ứng tạo clorua, sản phẩm tạo ra phụ thuộc vào bản chất hợp chaatss BVTV Ưu điểm của biện pháp này là hiệu suất xử lý cao, thiết bị gọn nhẹ,

khí thải an toàn cho môi trường, song biện pháp này chỉ sử dụng hiệu quả trong pha lỏng và pha khí, chi phí cao, phải đầu tư lớn [38]

Biện pháp ozon hóa kết hợp UV

Ozon hóa kết hợp với chiếu tia UV là biện pháp phân hủy các chất thải clo hữu cơ trong dung dịch hoặc trong dung môi Phản ứng hóa học để phân hủy hợp chất là:

Thuốc trừ sâu, diệt cỏ + O3 CO2 + H2O + các nguyên tố khác

Kỹ thuật này sử dụng thiết bị gọn nhẹ, chi phí vận hành thấp, chất thải ra môi trường sau xử lý ít độc, thời gian phân hủy ngắn Nhược điểm của biện pháp này chỉ

sử dụng có hiệu quả cao trong các pha lỏng, pha khí Chi phí ban đầu cho xử lý là rất lớn [78]

1.3.2 Phương pháp hóa học

Phương pháp khử

Phương pháp khử sử dụng dòng khí H2 để cắt bỏ liên kết C-Cl trong hợp chất hữu cơ chứa clo và thay thế nguyên tử clo bị loại bỏ bằng nguyên tử H2 Đây là phương pháp quan trọng để xử lý ô nhiễm các chất clo hữu cơ thành các chất không độc hại và được sử dụng cho các quá trình khác của công nghệ tổng hợp hữu cơ Phương pháp này cho hiệu suất cao, không sinh ra các sản phẩm thứ cấp độc hại và thời gian phản ứng cũng nhanh hơn đa số các phương pháp khác Sản phẩm chính của phương pháp này chủ yếu là HCl, hợp chất có thể dễ dàng loại bỏ qua việc trung hòa với kiềm trong khi các sản phẩm còn lại là các hydrocacbon có thể được

đốt cháy một cách an toàn, không độc hại Nhược điểm của phương pháp là chi phí cao do thiết bị đắt tiền [53]

Phương pháp oxy hóa sử dụng xúc tác

Bản chất của phương pháp này là đốt các hợp chất chứa clo ở nhiệt độ cao sử dụng các chất xúc tác Mức độ chuyển hóa của quá trình này cao và hơn 90% các hợp chất clo hữu cơ được biến đổi thành các hợp chất an toàn hơn như CO2, H2O và HCl ở nhiệt độ tương đối thấp Chất xúc tác sử dụng trong quá trình này là Pd hoặc

Pt tuy nhiên đây là những kim loại quý nên giá thành xử lý cao mặt khác quá trình xúc tác có thể gây độc cho người thực hiện nếu không có các biện pháp an toàn đầy

đủ [30]

Phương pháp hấp thụ bằng than hoạt tính

Có nhiều dạng than hoạt tính được sử dụng để khử Clo, trong đó dạng than hạt (GAC) thường được sử dụng trong các bộ lọc nước lớn Than hoạt tính loại bỏ Clo

và các hợp chất Clo bằng cơ chế hấp thụ bề mặt, ngoài ra, Carbon của than hoạt tính còn phản ứng trực tiếp với Clo, theo một nhiên cứu cho thấy 1 kg Carbon có thể phản ứng với 6 kg Clo [78]

Sử dụng hóa chất

Clo có thể được loại bỏ bởi các phản ứng giảm sử dụng sulfite, bisulfites hoặc các metabisulfites Tuy nhiên phương pháp sử dụng hóa chất sẽ làm tăng các ion (ví dụ: Na, Clo, sulfate) từ đó làm tăng tải trọng cho các thiết bị xứ lý phía sau như thiết bị khử ion [78]

1.3.3 Phương pháp sinh học

Trong những năm gần đây xu hướng sử dụng vi sinh vật để phân hủy lượng tồn dư thuốc bảo vệ thực vật một cách an toàn được chú trọng nghiên cứu Phân hủy sinh học tồn dư thuốc bảo vệ thực vật trong đất, nước, rau quả là một trong những phương pháp loại bỏ nguồn ô nhiễm môi trường, bảo vệ sức khỏe cộng đồng và nền kinh tế Biện pháp phân hủy hợp chất BVTV bằng tác nhân sinh học dựa trên cơ sở

sử dụng nhóm vi sinh vật có sẵn trong môi trường Chúng có khả năng phá hủy sự phức tạp trong cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của hợp chất BVTV

Tập đoàn vi sinh vật rất phong phú và phức tạp Chúng có thể phân hủy hợp chất BVTV và dùng thuốc như nguồn cung cấp chất dinh dưỡng, đó là cacbon, nitơ

và năng lượng để chúng phát triển và phân chia Quá trình phân hủy của vi sinh vật

có thể gồm một hay nhiều giai đoạn, để lại các sản phẩm trung gian và cuối cùng dẫn tới sự khoáng hóa hoàn toàn sản phẩm thành CO2, H2O và một số chất khác Một số loài thuốc thường chỉ bị một số loài vi sinh vật phân hủy Nhưng có một số loài vi sinh vật có thể phân hủy được nhiều hợp chất BVTV trong cùng một nhóm hoặc ở các nhóm thuốc khá xa nhau

Quá trình phân hủy hợp chất BVTV của sinh vật đất đã xảy ra trong môi trường có hiệu xuất chuyển hóa thấp Để tăng tốc độ phân hủy và phù hợp với yêu cầu xử lý, người ta đã tối ưu các điều kiện sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật như pH môi trường, độ ẩm, nhiệt độ, dinh dưỡng, độ thoáng khí, bổ sung vào môi trường đất chế phẩm sinh vật có khả năng phân hủy hợp chất BVTV [42]

Khả năng sử dụng vi sinh vật để xử lý ô nhiễm môi trường là một hướng nghiên cứu mới cũng như việc ứng dụng các chủng vi sinh vật kháng các dung môi hữu cơ ở nồng độ rất cao Ngoài ra, với những kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại có thể tạo ra những chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy đồng thời nhiều hóa chất khác nhau mà không yêu cầu điều kiện nuôi cấy phức tạp cũng như không gây hại cho động vật, thực vật cũng như con người và môi trường xung quanh Phương pháp này sẽ được ứng dụng rộng rãi trong tương lai vì ý nghĩa thực tế của nó khi xử

lý các chất thải độc hại ngày càng được mọi người chấp nhận [73]

Công nghệ sinh học áp dụng cho xử lý các chất thải nguy hiểm trong đó có các hợp chất hữu cơ dẫn xuất halogen bao gồm sự phát triển của hệ xử lý có sử dụng các enzym xúc tác tác sinh học phân hủy sinh học, làm suy thoái hoặc tích lũy chất gây ô nhiễm môi trường thuận tiện cho việc xử lý Việc xử lý sinh học cho các hợp chất hữu cơ dẫn xuất halogen trong môi trường áp dụng công nghệ sinh học được áp dụng theo (i) sử dụng các chủng vi sinh vật mang gen biến đổi di truyền; (ii) sử dụng thích nghi hoặc biến đổi gen vi sinh vật được thiết kế để xử lý đất bị ô nhiễm, nước ngầm, (iii) xử lý ô nhiễm với sự tham gia của các vi sinh vật tạo màng sinh học hoặc có hoạt tính cố định các chất độc từ môi trường, (iv) phát triển các

cảm biến sinh học để phát hiện các dấu vết của chất độc hữu cơ, (v) thu hồi các sản phẩm từ chất thải bằng cách sử dụng vi khuẩn tích lũy [26]

1.4 Vi sinh vật phân hủy hợp chất clo hữu cơ

Sự phân giải các hợp chất thường không chỉ bởi một chủng vi sinh vật duy nhất mà thường bởi một nhóm các vi sinh vật khác nhau Các nhóm sinh vật khá đa dạng và tồn tại trong các điều kiện sinh thái môi trường khác nhau [50] Chiba và cộng sự đã phân lập được các chủng vi sinh vật từ bùn ngoài biển [20], trong khi Hamid và cộng sự phân lập các chủng có sử dụng cơ chất 2,2- Dichloropropionate

từ đất vùng núi lửa [36] Habe và cộng sự đã phân lập hai chủng Pseudomonas sp

CA10 và Terrabacter sp DBF63 có khả năng sử dụng 2,7- DCDD [35] Yadav J.S

và cộng sự đã phát hiện nấm Phanerochaete chrysosporium có khả năng phân huỷ

2,4-D và rất nhiều hợp chất clo hữu cơ khác như Clorinated phenol, Polychlorinate biphenyls (PCBs), Dioxin [67]

Các nghiên cứu phân hủy sử dụng hợp chất halogen từ vi sinh vật tập trung nhiều vào nhóm halogen có vòng thơm Việc phân hủy nhóm hợp chất này cần có

sự tham gia tập đoàn gồm nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau Không có nhiều các công trình công bố cơ chế tác dụng từ của các chủng đơn lẻ Một số kết quả công bố

mới về phân lập đánh giá khả năng phân hủy như chủng Desulfomonile tiedjei

DCB-1 có khả năng sử dụng dechlorinates 3-chlorobenzoate, chlorophenols và

tetrachlorethylene; chủng Desulfomonile tiedjei DCB-2 thuộc chi Clostridium ưu

tiên dechlorinates nhóm thế ortho để phenolic nhóm hydroxyl và tri

dichlorophenols, chủng Clostridium sphenoides và một số vi khuẩn thuộc chi

Bacillus và họ Enterobacteriaceae tham gia vào khử clo lindane, chủng Aerobacter aerogenes chuyển hoá thuốc trừ sâu DDT và chủng Alcaligenes denitrificans NTB-

1 phát triển trên môi trường 2,4- dichlorobenzoate trong điều kiện hiếu khí [4]

Ngoài các vi khuẩn hiếu khí nhóm vi khuẩn kỵ khí thuộc chi Dehalococcoides có

khả năng khử clo của nhiều hợp chất chứa clo như Trichloethylene,

Vinylchloride…[6] Govender và tập thể đã phát hiện chủng Ancylobacter hay

chủng Xanthobacter autotrophicus trong nghiên cứu của Janssen có khả năng phân

hủy 1,2-Dichloroethane [31, 46]

Trong nghiên cứu của Jacobus và cộng sự chủng Pseudomonas sp có thể phát

triển trên DCE như là nguồn cacbon và năng lượng duy nhất [45] Trong nghiên cứu

sự phân hủy Sodium-2,2- Dichloropropionate (2,2-DCPS) các chủng vi khuẩn

Agrobacterium và Alcaligenes, hay một số loài trong chi Pseudomonas, Norcadia

và một số loài khác như Rhizobium sp, Comomonas acidvarans, Alcaligenes

xylosoxidans cũng được phát hiện có khả năng phân hủy hợp chất 2,2-DCP [15]

Hirsch và Alexander cũng nhận thấy 89% tới 100% hàm lượng 2,2 DCPS bị phân

giải sau 3 tuần trong môi trường đất chứa các chủng thuộc chi Nocardia và

Pseudomonas [39]. Sự phân hủy này không phụ thuộc vào loại đất, kết cấu của đất

mà liên quan trực tiếp đến số lượng, thành phần các chủng vi sinh vật trong mẫu Sự phân hủy sinh học của các hợp chất 3,4-Dichloroaniline bởi nấm và vi khuẩn cũng được đề cập trong nhiều nghiên cứu [59] Theo nhiều nghiên cứu, một số loài trong

chi Pseudomonas, Bacillus, Achromobacter… được xác định là có khả năng phân

hủy hợp chất 3,4-DCA [66, 68] Kết quả công bố gần đây trong nghiên cứu của

Tian Li và cộng sự, chủng Myroides odoratimimus có khả năng phân hủy 64% cơ

chất 3,4-DCA trong 24 giờ [58]

Vi sinh vật có khả năng phân giải nhờ việc sản xuất ra enzyme Dehalogenase

Chủng Alcaligenes eutrophus JMP134 và Pseudomonas cepacia có khả năng tổng

hợp muconate cycloisomerases phân hủy 4-fluoromuconolactone Các chủng

Arthrobacter trên môi trường bổ sung 2,4 D và Pseudomonas sp NCIB 9340 đều có

chứa các enzym chuyển đổi chloromaleylacetate thành succinate Trichloro ethylen (TCE) được sử dụng nhiều trong công nghiệp hóa chất được nhiều nhóm vi sinh vật oxy hóa với sự tham gia xúc tác bởi nhiều loại enzym khác nhau như toluene 2,3-dioxygenase, toluene 2-monooxygenase, metan monooxygenase… Chủng vi khuẩn

Methylosinus trichosporium OB3b có enzym chuyển hóa halogen thuộc nhóm

oxygenase là monooxygenase có hoạt tính mạnh nhất Một số vi sinh vật thuộc

nhóm xạ khuẩn Actinomyces và Streptomyces có thể tổng hợp các enzym ngoại bào

có hoạt tính phân hủy hợp chất halogen như laccases, tyrosinases và peroxidases

[26,50] Nhiều chủng vi sinh vật mang có enzym dehalogenase mới được phân lập, tinh sạch trong thời gian gần đây [40]

Các enzyme thuộc nhóm này từ vi sinh vật đã thu hút rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học vì chúng có thể ứng dụng cho ngành công nghiệp hóa chất và công nghệ môi trường Hiện nay các nghiên cứu phân lập các chủng vi sinh vật phân hủy nhóm halogen này còn gặp nhiều khó khăn, việc tinh sạch và nghiên cứu các đặc điểm từ các enzym của các chủng vi sinh vật này còn khó khăn hơn nhiều

do sự đa dạng của các hợp chất, dẫn xuất halogen cũng như sự đa dạng của các enzym tham gia xúc tác cho sự phân cắt của nhóm thế halogen từ các hợp cất có vòng thơm, haloalkanes, haloalcohols và haloacids Việc phân lập các chủng vi sinh vật có enzym dehalogenase cũng như tinh sạch, nghiên cứu đặc tính các enzym này không những làm sáng tỏ các quá trình chuyển hóa mà còn góp phần tạo ra các sản phẩm nhằm mục đích phát hiện sự tồn tại của các chất độc hại này trong môi trường

Nguyễn Thị Kim Cúc và Phạm Việt Cường đã tiến hành phân lập và tuyển

chọn một số chủng thuộc chi Pseudomonas có khả năng phân hủy được methyl

parathion [2] Đã có một số nghiên cứu tập trung vào các hợp chất trong thuốc trừ sâu như DDT, hay Dioxin [3,6,9]

Gần đây mới có công bố của một số tác giả Viện Công nghệ sinh học trong việc nghiên cứu tính đa dạng của nhóm vi khuẩn kị khí khử clo hay phân lập các chủng vi sinh vật tổng hợp lacase ngoại bào, tuy nhiên với sự đa dạng của nhóm halogen, mức độ nguy hại của các nhóm hợp chất nay đối với môi trường thì các kết quả công bố hiện nay vẫn còn khiêm tốn cả về số lượng và chất lượng Do đó việc phát hiện tìm kiếm các chủng vi sinh vật có hoạt tính mạnh phân huỷ các hợp chất này là cần thiết và sẽ góp phần tìm hiểu tính đa dạng của nhóm vi sinh vật có hoạt tính này

Như vậy nghiên cứu này của chúng tôi có thể coi là những nghiên cứu mang tính định hướng đầu tiên góp phần vào việc giải quyết ô nhiễm hay tồn dư hợp chất clo hữu cơ trong môi trường đất, nước, không khí ở Việt Nam

1.6 Một số hợp chất clo hữu cơ

Nhóm hợp chất clo hữu cơ rất đa dạng về thành phần và cấu tạo hợp chất Trong khuôn khổ của đề tài nghiên cứu, chúng tôi xin đi sâu tìm hiểu đối với 3 hợp chất sau đây

1.6.1 Hợp chất 1,2 - Dichloroethane (1,2 - DCE)

Hợp chất hóa học 1,2-dichloroethan (hoặc 1,2 - DCE ) được tạo ra lần đầu tiên năm 1974 từ khí olefin và khí clo, là một hydrocacbon clo, có công thức hóa học là C2H4Cl2 được sử dụng chủ yếu để sản xuất vinyl clorua monomer (VCM, chloroethene) là các tiền thân sản xuất nhựa PVC 1,2 - DCE là chất lỏng không màu, có mùi giống chloroform Ngoài ra, nó được sử dụng như một trung gian cho các hợp chất hóa học hữu cơ khác và như một dung môi [21]

Hình 3 Công thức hóa học của 1,2-DCE

1,2 - DCE là chất độc (đặc biệt khi hít phải do độ bay hơi cao), rất dễ cháy và

là hợp chất gây ung thư [14,41] Trong các sản phẩm bằng nhựa như đồ chơi cho trẻ

em đã phát hiện ra việc giải phóng DCE trong nhà với liều lượng đủ cao để gây ung

thư Hơn nữa, DCE có tính tan rất thấp trong nước và hầu như không thể phân hủy

tự nhiên trong môi trường, chu kì bán phân rã của hợp chất này đến 50 năm trong các tầng ngậm nước khiến chúng trở thành chất gây ô nhiễm lâu dài đồng thời gây nguy hiểm đến sức khỏe con người và sinh vật [61]

1, 2 - dichloroethan được sản xuất chủ yếu thông qua xúc tác phản ứng

của ethene (etylen) và clo được xúc tác bởi sắt (III) clorua:

H 2C = CH2 + Cl2 → ClCH2 - CH2 Cl (1,2-dichloroethan) 1,2-dichloroethan cũng được tạo ra bởi phản ứng oxy clo hóa etylen được xúc tác bởi đồng (II) clorua:

2 H2C = CH2 + 4HCl + O2 → 2ClCH 2 - CH2Cl2 + H 2O Với khoảng 80% lượng tiêu thụ 1,2-dichloroethan trên thế giới, thì 1,2-dichloroethan được sử dụng chính trong sản xuất vinyl cloruamonomer (VCM, chloroethene) đồng thời tạo ra HCl sau phản ứng như một sản phẩm phụ VCM là đơn phân của polyvinyl clorua (PVC) Hydro clorua có thể được tái sử dụng trong việc sản xuất 1,2-dichloroethan qua con đường oxy clo hóa [21]

Cl-CH2 -CH 2 -Cl → H2C = CH-Cl + HCl

Vì là dung môi aprotic phân cực tốt, 1,2-dichloroethan có thể được sử dụng như chất tẩy nhờn và tẩy sơn Nó được sử dụng như một trung gian trong việc sản xuất các hợp chất hữu cơ khác nhau như ethylenediamine Trong phòng thí nghiệm được sử dụng như một nguồn clo khi loại bỏ ethene và clorua Thông qua một số phản ứng 1,2-dichloroethan tạo ra 1,1,1-trichloroethane, đây là chất được sử dụng trong giặt khô Trong lịch sử, 1,2-dichloroethan đã được sử dụng như một chất phụ gia chống kích nổ trong nhiên liệu pha chì [25]

1.6.2 Hợp chất 2,2-Dichloropropionate Sodium (2,2-DCPS)

Còn có tên là Dalapon, có công thức hóa học là C3H3Cl2NaO2 Dalopon là dạng muối hóa học của 2,2-Dichloropropionic (2,2-DCP) có 3 cacbon với 2 nguyên

tử Clo gắn ở vị trí α-C Đây là loại thuốc trừ cỏ được sử dụng sau khi hạt nảy mầm

và có độ độc trung bình đối với người Dalapon có dạng bột, rất dễ hòa tan trong

nước và dung môi hữu cơ, do đó việc sử dụng rộng rãi Dalapon gây ra sự xâm nhập lớn loại thuốc trừ cỏ này vào nguồn nước, dẫn đến ô nhiễm môi trường

Hình 4 Công thức hóa học của 2,2-DCPS

Hợp chất 2,2-DCPS thủy phân chậm trong nước tạo ra pyruvic acid và Cl- Khả năng phân hủy càng tăng khi tăng nhiệt độ và nhanh hơn trong môi trường kiềm Dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời, sự phân hủy 2,2-DCP cũng xảy ra chậm tạo thành pyruvate sau đó chuyển hóa thành cacbondioxide và acetandehyde [28]

Ở Việt Nam, 2,2 DCPS thường được dùng để trừ cỏ một lá mầm và hai lá mầm kể cả lau sậy, cỏ tranh hay các loại cỏ có bộ rễ ăn sâu dưới đất Thuốc có tác dụng nội hấp nên hấp thu vào lá cỏ rất nhanh, cũng có thể xâm nhập qua rễ cỏ, làm rối loạn sinh lý nên lá biến dạng, thân cong queo, giòn, dễ gẫy và cuối cùng bị chết [54] Hàm lượng 2,2-DCP với mức vượt quá 2660 ppm trong môi trường đất sẽ gây

ức chế, kìm hãm các vi sinh vật đồng hóa ni tơ trong đất Với nồng độ lớn gây ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng hoa màu, lương thực [32]

2,2-Dichloropropionate Sodium còn ảnh hưởng tới sức khỏe con người Khi tiếp xúc với nồng độ cao và trong thời gian dài có các triệu chứng như dị ứng da, bỏng da, có hại cho mắt, hệ hô hấp, mệt mỏi, chán ăn, tiêu chảy, nôn mửa, làm chậm xung thần kinh trung ương, có thể gây trầm cảm [72]

1.6.3 Hợp chất 3,4-Dichloroaniline (3,4-DCA)

Hợp chất 3,4-Dichloroaniline có công thức hóa học là C6H5Cl2N Dạng chất rắn màu nâu, không tan trong nước, không tương thích với các tác nhân oxy hóa, các axit, axit clorua và anhydit axit, rất dễ cháy [77]

Hình 5 Công thức hóa học của 3,4-DCA

3,4-DCA được sử dụng như một trung gian trong công nghiệp hóa chất để tổng hợp 3,4-dichlorophenylisocyanate, các thuốc diệt cỏ propanil và thuốc nhuộm azo cho vải polyester Thực tế không sử dụng được trực tiếp 3,4-DCA mà không biến đổi hóa học 3,4-dichlorophenylisocyanate được đưa ra thị trường và tiếp tục

sử dụng để sản xuất thuốc diệt cỏ phenylurea (diuron, linuron) và chất diệt khuẩn trichlorocarbanilide 3,4-DCA giải phóng vào thủy quyển thông qua nước thải trong quá trình sản xuất Nó cũng được thải vào môi trường trong suốt quá trình sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ 3,4-DCA như linuron, diuron, propanil Thêm nữa, 3,4-DCA được giải phóng như một tạp chất của các thuốc BVTV này nên phần lớn chúng tồn dư trong đất nông nghiệp [43] Khi tiếp xúc với 3,4- DCA nồng độ cao, người bị ngộ độc cấp tính do hình thành methaemoglobin gây tím tái, mệt mỏi, khó thở đồng thời làm rối loạn hệ thần kinh và gây tê liệt [24]

Trước đây 3,4-DCA được coi là không có khả năng phân hủy trên bề mặt nước thải Tuy nhiên, thí nghiệm phân hủy với mẫu trầm tích thích hợp, 3,4-DCA

đã bị phân hủy 82% sau 28 ngày [17] Thí nghiệm phân hủy ở tầng giữa cho thấy 3,4-DCA phân hủy 45% sau 30 ngày Nghiên cứu sự phân hủy 3,4-DCA trong đất chỉ ra tỷ lệ khoáng giảm theo nồng độ ngày càng tăng của 3,4-DCA… [49] Trong không khí, chu kỳ bán rã của 3,4-DCA là 9 giờ xảy ra nhờ quá trình quang hóa với các gốc OH Sự phân hủy sinh học hợp chất 3,4-DCA xảy ra nhờ một số vi sinh vật

như Bacillus, Pseudomonas, Achromobacter hay Myroides odoratimimus…[58,66,

68]

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu được tuyển chọn từ các chủng

vi khuẩn phân lập từ các mẫu đất, mẫu nước thu thập tại xã Sơn Đồng, huyện Hoài Đức, Hà Nội Đây là nơi có sử dụng thường xuyên thuốc bảo vệ thực vật trong việc trồng hoa

Các mẫu sau khi thu thập được bảo quản lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm phân tích trong thời gian 24 giờ

2.2 Hóa chất – Dụng cụ

2.2.1 Môi trường nuôi cấy

 Môi trường chọn lọc MGB (1 lít) [37]

100 ml BS 10x (BS là dung dịch muối khoáng cơ bản)

100 ml TMSS 10x (TMSS là dung dịch muối của các kim loại)

- 3,4-Dichloroaniline (3,4-DCA) của Sigma (Mỹ)

Môi trường BS, LB được khử trùng ở 121C trong thời gian 120 phút Môi trường TMSS và các hóa chất 2,2-DCP, 3,4-DCA sau khi hòa tan được lọc bằng màng lọc vô khuẩn với kích thước lỗ 0,2m

Các hóa chất khác trong sử dụng đều có độ tinh sạch cao đảm bảo cho các nghiên cứu phân tích

2.3 Máy móc, thiết bị

Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu gồm: Nồi khử trùng (ALP - Nhật); Máy lắc (Satorius - Đức), Wibecuse (Hàn Quốc); Tủ cấy vi sinh vật (Aura vertical - Ý); Máy đo mật độ quang học (Bionate - Anh); Cân Kern (Satorius - Đức); Cân Pressica XT 220A (Ý); Tủ ấm (Memmert - Đức); Máy li tâm sigma 3K30 (Sartorius - Đức); Vortex (Ika - Đức); Tủ sấy (Memmert - Đức); Máy khuấy

từ (Ika - Đức); Kính hiển vi điện tử quét JSM-5421LV (Nhật Bản) tại Bộ môn Vật

lý, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu mẫu

Mẫu đất và mẫu nước tại khu vực vườn hoa xã Sơn Đồng, huyện Hoài Đức, Hà Nội được thu vào các Falcon bằng các dụng cụ đã khử trùng và đạt quy chuẩn về độ sạch

Mẫu đất được lấy bề mặt đất và ở độ sâu 5 cm so với bề mặt Mẫu nước thu ở khu vực nước đọng; cống thoát nước và mương nước

2.4.2 Phân lập vi sinh vật

Phương pháp nuôi cấy làm giàu

Các mẫu nuôi cấy được làm làm giàu 2 lần, 5 ngày/lần trong môi trường chọn lọc (môi trường MGB) bao gồm các thành phần môi trường khoáng cơ bản

BS, môi trường các nguyên tố vi lượng TMSS và cơ chất 1,2-DCE, 2,2-DCP, DCA với nồng độ lần lượt là 5mM, 20mM, 50mg/l tương ứng [37] Môi trường được khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút trước khi bổ sung cơ chất mỗi bình 1g mẫu đất, 3ml mẫu nước Các bình có chứa mẫu được nuôi cấy lắc trong 5 ngày ở 30C, 160rpm Sau 5 ngày mẫu được chuyển sang nuôi trên môi trường MGB sạch

3,4-để làm giàu lần thứ 2 Trong quá trình nuôi cấy, phân lập luôn đậy chặt nắp bình 3,4-để tránh sự bay hơi của cơ chất [36, 61]

ở độ pha loãng 10-1 cho vào ống eppendorf chứa 900 µl nước cất vô trùng để được

độ pha loãng 10-2 Tiếp tục như vậy đến nồng độ 10-6

- Lấy 100µl dung dịch pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp, dùng que gạt trải đều lên đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy cho đến khi bề mặt thạch khô

2.4.3 Phương pháp bảo quản giống

Tinh sạch, ria cấy 3 pha các chủng để thu nhận chủng thuần khiết, sau đó giữ giống trong ống nghiệm môi trường thạch nghiêng

Vi khuẩn được nuôi trong ống thạch nghiêng thạch LB, nuôi ở nhiệt độ phòng Sau khoảng 2-3 ngày khi vi khuẩn đã mọc tốt cất vào tủ mát ở nhiệt độ 4-6oC Sau 1-2 tháng cấy truyền lại một lần

Nhằm bảo quản được giống lâu hơn, để giống trong paraffin lỏng vô trùng giữ lạnh sâu trong glycerin hoặc đông khô, bảo quản được từ 6 tháng đến 2 năm

2.4.4 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng hợp chất clo

Môi trường chọn lọc có bổ sung thạch và bromothymol blue (75mg/l) [27] Khả năng phát triển và tạo màu trên môi trường có bromothymol blue nhằm chọn lọc các chủng có khả năng phân giải tốt cơ chất do Bromothymol blue là chất chỉ thị màu cho khả năng phân giải hợp chất clo

Có thể dễ dàng nhận ra sự phân giải cơ chất của các chủng vi sinh vật khi enzyme dehalogenase của vi sinh vật xúc tác phản ứng cắt đứt liên kết C-Cl, giải phóng HCl làm thay đổi pH môi trường, điều đó khiến cho bromothymol blue trong môi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang màu vàng [64] Các chủng có sự chuyển màu rõ rệt nhất và có khả năng sinh trưởng mạnh nhất sau 3 ngày sẽ được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo

2.4.5 Phương pháp phân loại các chủng nghiên cứu

Phương pháp nhuộm Gram

Nguyên tắc

Dựa vào sự khác biê ̣t giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) Vi khuẩn Gram (+) có peptidoglican hoạt động như một hàng rào thẩm thấu ngăn cản sự thất thoát của tinh thể tím [1]

Phương pháp tiến hành

- Làm vết bôi: Nhỏ 1 giọt nước cất lên lam kính Dùng que cấy vô trùng lấy một ít sinh khối vi khuẩn (sau khi cấy 24h) hòa đều vào giọt nước và giàn thành lớp mỏng Sau đó, cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn

- Nhuộm tiêu bản bằng tím kết tinh trong vòng 1 phút

- Nhuộm bổ sung lugol trong 30 giây

- Tẩy cồn

- Rửa nước, hong khô

- Nhuộn tiếp bằng Safranin trong 20s, rửa nước, làm khô

- Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi với vật kính dầu 100X

Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu xanh tím, vi khuẩn Gram (-) bắt màu đỏ hồng

Chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét

- Chuẩn bị mẫu vi khuẩn: Các mẫu vi khuẩn được nuôi cấy trên đĩa thạch LB không quá 24 giờ ở 37C

- Gắn mẫu vi khuẩn lên lamen, hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để cố định mẫu

- Gắn mẫu lên đế mạ phủ mẫu vàng trên máy JFC-1200 trong 5 phút ở 30mA

- Soi và chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét JSM-5421LV (Nhật Bản) tại phòng Chụp hiển vi điện tử quét - Trung Tâm Khoa Học Vật Liệu - Khoa Vật lý - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Giải trình tự gen 16S ARNr

- Mẫu vi sinh vật được gửi đến công ty Macrogen - Hàn Quốc để tiến hành giải trình tự gen 16S ARNr

- Kết quả phân tích trình tự được so sánh với các loài trong ngân hàng gen quốc tế bằng phương pháp Clustal X

- Sau đó xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm Tree phylogenetic

2.4.6 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hóa của các chủng nghiên cứu

Để kiểm tra khả năng đồng hóa các hợp chất hữu cơ điển hình của các chủng

vi khuẩn, chúng tôi tiến hành thử với Kit thử API 20NE cho vi khuẩn Gram (-) và Kit thử API 50CHB cho vi khuẩn (+) của hãng BioMérieus Hóa chất và thuốc thử được cung cấp cùng với bộ kit tương ứng

Các bước tiến hành được tóm tắt như sau:

 Tiến hành với Kit API 20NE

- Chuẩn bị mẫu vi khuẩn mới nuôi, không quá 24 giờ

- Sau khi nuôi cấy tiến hành bổ sung vi khuẩn vào nước cất khử trùng sao cho OD600nm đạt giá trị 0,132

- Bổ sung 0,2ml dịch vi khuẩn đã pha loãng vào các giếng từ NO3 đến PNPG,

bổ sung thêm dầu khoáng vào các ống kí hiệu GLU, ADH, URE

- Thêm 0,2ml dịch vào các ống API AUX, trộn nhẹ cho đều, rồi bổ sung 0,2ml dịch này vào các ống còn lại từ GLU đến PAC

- Đóng hộp, ủ trong 24 giờ

- Sau 24h kiểm tra NO3- bằng thuốc thử NIT 1 và NIT 2, nếu phản ứng dương tính, sau 5 phút dịch trong ống sẽ chuyển thành màu hồng đỏ, nếu âm tính sẽ không có màu Nếu phản ứng âm tính thì cần kiểm tra việc sản xuất nito bằng cách bổ sung thêm 2-3mg Zn2+ Sau 5 phút nếu dịch trong ống không màu thì là phản ứng dương tính, nếu chuyển sang màu hồng là âm tính

- Kiểm tra TRP bằng cách thêm 1 giọt thuốc thử JAMES, phản ứng dương tính

sẽ cho màu hồng ngay tức khắc; ESC kết quả dương tính cho màu đen, âm tính cho màu vàng; GEL dương tính cho màu đen bị khuếch tán

- Kiểm tra khả năng đồng hóa các hợp chất còn lại bằng cách dựa vào độ đục, phản ứng dương tính cho độ đục cao

- Kết quả ghi lại và được phân tích với phần mềm của hãng BioMérieus

 Tiến hành với Kit API 50CH

- Lấy một vài khuẩn lạc nhất định cho vào ống API 50CHB/E sao cho OD600nm của dung dịch trong ống đạt 0,451

- Thêm 0,2ml dung dịch trên vào các giếng

- Đóng hộp, ủ ở 290C ± 20C sau 24 giờ và 48 giờ đọc kết quả Phản ứng dương tính làm chất chỉ thị màu đỏ trong giếng chuyển thành màu vàng Riêng phản ứng Esculin cho kết quả dương tính nếu màu đỏ chuyển thành màu đen Nguyên tắc của sự đổi màu chất chỉ thị đó là trong suốt quá trình ủ, các cacbonhydrate được chuyển hóa thành acid dẫn đến làm giảm pH từ đó đổi màu chất chỉ thị

2.4.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường và khả năng sử dụng

một số hợp chất clo lên các chủng nghiên cứu

Mỗi chủng vi sinh vật đều phát triển tốt nhất ở những điều kiện thích hợp Khi nhiệt độ, nồng độ cơ chất không thích hợp sẽ tác động đến vi sinh vật và có thể ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển cũng như khả năng phân hủy cơ chất của vi sinh vật

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong những yếu tố của môi trường tác động trực tiếp đến sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật nói chung và của vi khuẩn nói riêng, cũng có