PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HỢP CHẤT CHỨA CLO TẠI VIỆT NAM

PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HỢP CHẤT CHỨA CLO TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Hợp chất Halogen là những hợp chất quan trọng được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp, nông nghiệp, y học…Bên cạnh những lợi ích mang lại thì việc sử dụng tràn lan và thải ra môi trường mà không có phương pháp xử lý triệt để đã và đang gây ra những hậu quả nghiêm trọng đến môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe con người.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Nguyễn Thị Nhật Ánh

PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HỢP CHẤT CHỨA

CLO TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội - 2013

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc nhất

đến PGS TS Nguyễn Quang Huy, người Thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho

em những kĩ năng nghiên cứu cũng như những kiến thức cần thiết trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài Bên cạnh đó Thầy đã tạo điều kiện học tập và nghiên cứu tốt nhất cho em để em có thể hoàn thành tốt luận văn này.

Tiếp đến em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn và cung cấp cho em những kiến thức bổ ích trong suốt khóa học.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, các anh chị, các bạn, các em sinh viên trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa Sinh, phòng Enzyme và Phân tích hoạt tính sinh học, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Protein và Enzyme đã hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian em nghiên cứu tại phòng thí nghiệm.

Đề tài được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài mã số KLEPT 01-12

do PGS.TS Nguyễn Quang Huy chủ trì được ĐHQG Hà Nội tài trợ, em xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên và ủng hộ em trong suốt thời gian học tập cũng như quá trình hoàn thành khóa luận này.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Học viên

Nguyễn Thị Nhật Ánh

MỞ ĐẦU

Hợp chất Halogen là những hợp chất quan trọng được sử dụng rộng rãi trongcông nghiệp, nông nghiệp, y học…Bên cạnh những lợi ích mang lại thì việc sử dụngtràn lan và thải ra môi trường mà không có phương pháp xử lý triệt để đã và đanggây ra những hậu quả nghiêm trọng đến môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe conngười Việc áp dụng các phương pháp vật lý, hóa học để giải quyết tình trạng ônhiễm gây ra bởi các hợp chất halogen cho hiệu quả cao song chi phí đắt cũng nhưđòi hỏi công nghệ hiện đại Phương pháp sinh học sử dụng khả năng phân giải của

vi sinh vật tự nhiên được đánh giá là tiềm năng cao không chỉ cho hiệu quả nhanhchóng mà còn mang tính bền vững, ít tốn kém, thân thiện với môi trường Trong tựnhiên tồn tại các nhóm vi sinh vật có khả năng sử dụng hợp chất halogen như lànguồn cacbon để thực hiện các quá trình trao đổi chất, duy trì các hoạt động sốngcủa cơ thể, từ đó các hợp chất halogen được phân giải trở nên ít độc hơn hoặc khôngcòn độc với môi trường và con người

Việt Nam vốn là nước sản xuất nông nghiệp với khí hậu nhiệt đới nóng và

ẩm thuận lợi cho sự phát triển của cây trồng song cũng thuận lợi cho sự phát sinh,phát triển của sâu bệnh, cỏ dại gây hại mùa màng, do vậy hàng năm chúng ta sửdụng một lượng lớn hóa chất bảo vệ thực vật có bản chất là hợp chất halogen màchủ yếu là các hợp chất clo hữu cơ Việc sử dụng tràn lan dẫn đến tồn dư các loạihợp chất này lớn đã gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng ỞViệt Nam hiện chưa có nhiều nghiên cứu cơ bản về việc ứng dụng vi sinh vật cóhoạt tính phân giải hợp chất halogen để giải quyết ô nhiễm môi trường, đồng thờinhận thấy tiềm năng của phương pháp sinh học do đó chúng tôi đã tiến hành thực

hiện đề tài: “PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HỢP CHẤT CHỨA CLO TẠI VIỆT NAM”

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hợp chất halogen và hợp chất clo hữu cơ

Các hợp chất halogen hữu cơ là một lớp lớn các chất hóa học tự nhiên vàtổng hợp, có chứa một hoặc nhiều gốc halogen gồm Flo, Clo, Brom, Iot kết hợp vớicacbon và các yếu tố khác

Hợp chất hữu cơ halogen được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực quantrọng của đời sống như công nghiệp, nông nghiệp, y học,… Ngày nay cùng với sựphát triển của nền nông nghiệp hiện đại là thực trạng sử dụng nhiều các hóa chấtbảo vệ thực vật có thành phần chính là hợp chất Halogen mà chủ yếu là hợp chất cóchứa clo Bên cạnh lợi ích to lớn như diệt trừ sâu bệnh, tăng năng suất… thì việc sửdụng các thuốc bảo vệ thực vật lại ảnh hưởng xấu đến môi trường, phá hủy sự bềnvững của hệ sinh thái do tính độc hại, khó bị phân hủy, tích tụ trong đất, nước, độngvật, thực vật, nghiêm trọng hơn còn gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người

1.1.1 Sự phổ biến của hợp chất halogen trong tự nhiên

Số lượng các hợp chất halogen tự nhiên đã được biết đến từ 30 loại năm 1968 lêngần 3.900 loại trong đầu những năm 2000 Nhiều loại có cấu tạo giống với chất hóahọc tổng hợp Chúng được tổng hợp từ các sinh vật biển, vi khuẩn, nấm, thực vật,côn trùng và một số động vật có vú Tảo, nấm, một số cây, thực vật phù du sản xuất

ra chloromethane Mối sản xuất ra chloroform Một số loại rau sản xuấtbromomethane Một trăm loại hợp chất hữu cơ halogen đã được tìm thấy trong rongbiển ăn được

Muối clo và muối brom thường xuất hiện trong thực vật, đất, và các mỏ địachất; cháy rừng và núi lửa cũng sinh ra hợp chất halogen Lượng chloromethanetoàn cậu tạo ra từ sinh khối là 5 triệu tấn mỗi năm, trong khi đó lượng tổng hợp chỉ

có 26.000 tấn mỗi năm Núi lửa tạo ra khí hydro clorua (3 triệu tấn / năm) và hydroflorua (11 triệu tấn / năm), cả hai chất này đều có thể phản ứng với các hợp chấthữu cơ để sản xuất ra hợp chất halogen

[Gribble, Gordon W (1994) "Natural Organohalogens—Many More Than You

Think!" Journal of Chemical Education 71(11):907–911.]

1.1.2 Ứng dụng của hợp chất clo hữu cơ

Hợp chất hữu cơ halogen nói chung và hợp chất clo hữu cơ nói riêng được sửdụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của đời sống

Trong công nghiệp chúng có nhiều ứng dụng quan trọng sau đây:

Polyvinyl clorua (PVC) được trùng hợp từ vinyl clorua (CH 2 = CHCl), là loại nhựa

nhiệt dẻo được sản xuất và tiêu thụ nhiều thứ 3 trên thế giới (Theo:CMAI) PVC là

một thành phần không thể thiếu của vật liệu xây dựng, hàng tiêu dùng, thiết bị y tế,

và nhiều sản phẩm dân dụng khác thường ngày Hơn 2,2 tỷ kg (5 tỷ bảng Anh) củaPVC được sử dụng hàng năm cho dây điện, dây cáp, và các ứng dụng điệnkhác Clo trong PVC làm cho loại nhựa này chống cháy do đó nó là nguyên liệu lýtưởng cho các ứng dụng xây dựng và trang trí nội thất

[Vinyl Environmental Council(2007), PVC Leads Climate Change Mitigation and Risk Reduction for Sustainable Development, Japan.]

Dung môi clo là dung môi phổ biến nhất trong số các dẫn xuất halogen.Trichloroethylene (CHCl = CCl2) và tetrachloroethylene (CCl 2 = CCl 2 ) được sửdụng rộng rãi trong ngành công nghiệp sản xuất dung môi làm sạch khô

Sau đây là bảng tóm tắt các ứng dụng của một số hợp chất clo hữu cơ:

Bảng 1: Ứng dụng của một số hợp chất clo hữu cơ [http://ec.europa.eu-Chlorine

[

http://www.chemistryexplained.com/Ny-Pi/Organic-Halogen-Compounds.html#ixzz2jjHntve1]

Hình 1 Công thức một số thuốc là hợp chất halogen hữu cơ: (a) Lorabid, kháng

sinh; (b) Toremifene, thuốc ung thư vú; (c) Mitotane, thuốc ung thư

Hợp chất hữu cơ halgen rất cần thiết cho sản xuất nông nghiệp và bảo vệ câytrồng vì nó là thành phần của thuốc diệt cỏ và thuốc trừ sâu Việt Nam là nước sảnxuất nông nghiệp, khí hậu nhiệt đới nóng và ẩm thuận lợi cho sự phát triển của cây

trồng song cũng thuận lợi cho sự phát sinh, phát triển của sâu bệnh, cỏ dại gây hạimùa màng Do vậy việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (TBVTV) mà phần lớn cónguồn gốc từ các hợp chất clo để phòng trừ sâu hại, dịch bệnh bảo vệ mùa màng làmột biện pháp quan trọng Một số hóa chất như 2,2-Dichloropropionic acid,Trichloroacetic acid, 1,4-Dichlorobenzen là thành phần chính của thuốc diệt cỏ vàthuốc trừ sâu Bảng dưới đây thống kê một số loại thuốc BVTV có nguồn gốc clo.

[Nguyễn Trần Oánh, Nguyễn Văn Viên, Bùi Trọng Thủy (2007), Giáo trình Sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, Đại học Nông Nghiệp Hà Nội , Rodriguez L N H.

Khan F., Robins K T., Meyer H P (2011), “Perspectives on biotechnological

halogenation”, Scientific article, 1, pp 31.].

Bảng 2 Một số loại thuốc BVTV có nguồn gốc Clo

Tên thường gọi và thành phần chính Công thức hóa học

1.1.3 Sự ô nhiễm môi trường các hợp chất clo hữu cơ

Các dung môi clo là những chất dễ bay hơi thoát vào khí quyển trong quátrình sản xuất, vận chuyển và sử dụng gây ra ô nhiễm không khí Nhiều hóa chất clonông nghiệp bốc hơi một phần khuếch tán đi xa tới cả các vùng cực mà ở đây không

có sản xuất nông nghiệp Các quá trình công nghiệp (luyện kim, pha sơn, giặt khô,sản xuất giấy,…mcũng là một nguồn gây ô nhiễm môi trường

[http://www2.hcmuaf.edu.vn/]

Các hóa chất nông nghiệp có chứa clo khi sử dụng gây ô nhiễm cho đất,nước và nông sản Do độ bền hóa học lớn nên các thuốc bảo vệ thực vật dễ tồn lưutrong đất đai, cây trồng, nông sản, thực phẩm Chúng làm cho môi trường bị ônhiễm trong một thời gian lâu dài Thời gian phân hủy 95 % hoạt chất trong điềukiện tự nhiên của DDT là 10 năm; BHC là 6,5 năm; Dieldrin là 8 năm; Chlordane là3,5 năm Lượng thuốc lưu tồn không những làm cho phẩm chất, hình thức của nông

sản bị xấu đi mà còn gây độc cho người hay gia súc sử dụng nông sản đó, như BHCthường để lại mùi khó chịu trên nông sản như khoai tây, rau, đậu [http://www.trangvangnongnghiep.com/bao-ve-thuc-vat/11009-thuoc-nhom-clo-huu-co.html]

1.1.4 Tác động của hợp chất clo hữu cơ đối với môi trường và con người

Nhược điểm lớn nhất của các hợp chất clo hữu cơ là có tính hoá học bền, nêntồn lâu trong môi trường, gây ô nhiễm môi trường Một số thuốc trong nhóm có khảnăng tích luỹ trong cơ thể, gây trúng độc mãn tính cho người và động vật máu nóng,gây hiện tượng chống thuốc của sâu hại, ảnh hưởng xấu đến cân bằng sinh học, gây hạicho côn trùng có ích [Giáo trình sử dụng thuốc và bảo vệ thực vật, PGS.TS NguyễnTrần Oánh (Chủ biên) TS Nguyễn Văn Viên , KS.Bùi Trọng Thủy, trang 100]

Hình 2: Tác động của thuốc BVTV đến môi trường và con đường mất đi của thuốc

(Theo Richardson,1979; Dẫn theo Phạm Văn Biên và cộng sự, 2000)

Trên thế giới ước tính có khoảng 39 triệu người có thể bị ngộ độc cấp tínhhàng năm do ảnh hưởng của hóa chất bảo vệ thực vật Trong đó có khoảng 3 triệungười bị ngộ độc cấp tính nghiêm trọng và 220 nghìn người tử vong mỗi năm Điđôi với số lượng hóa chất bảo vệ thực vật sử dụng tăng là số người ngộ độc hóa chấtBVTV cũng tăng, đặc biệt là tại các nước đang phát triển, 99% trường hợp ngộ độcxảy ra ở các nước này, cho dù lượng tiêu thụ hóa chất bảo vệ thực vật chỉ chiếm20% Tuy nhiên, phần lớn người nông dân tại cá nước này chưa nhận biết đầy đủ vềtác hại cũng như nguy cơ do hóa chất BVTV gây ra [http://vietbao.vn/Khoa-hoc/]

Những nghiên cứu trong vài năm gần đây tại Việt Nam cũng đưa ra các sốliệu đáng quan ngại Theo báo cáo của tổ chức WHO (World Heath rganization),vào năm 2002, từng có 7.170 trường hợp nhiễm độc thuốc trừ sâu được ghi nhận tạiViệt Nam Kết quả xét nghiệm máu ngẫu nhiên của 190 nông dân ở khu vực đồngbằng sông Cửu Long cho thấy hơn 35% mẫu bị nhiễm thuốc trừ sâu cao và 21% bịnhiễm ở nồng độ thấp

hoa-chat-loi-it-hai-nhieu.htm]

[http://suckhoedoisong.vn/2010060404122443p0c14/thuoc-bao-ve-thuc-vat-dang-Trong năm 2007 theo thống kê sơ bộ tại 38 tỉnh, thành phố đã xảy ra gần4.700 vụ, với 5.207 trường hợp bị nhiễm độc hóa chất bảo vệ thực vật và 106 người

đã tử vong Năm 2009 có 4.372 vụ nhiễm độc với 4.515 trường hợp, trong đó 138trường hợp tử vong, chiếm tỷ lệ 305% (Theo: Cục Y tế dự phòng và môi trườngnăm 2010) Số liệu qua các năm cho thấy, số ca bị nhiễm độc với thuốc bảo vệ thựcvật là có giảm, nhưng không đáng kể Điều tra nguyên nhân gây ngộ độc chủ yếu dotình trạng lạm dụng và sử dụng bừa bãi hóa chất BVTV trong đó 98% trường hợplạm dụng hoặc pha đặc hơn so với hướng dẫn trên bao bì 2-3 lần; có từ 84,17% đến93,23% không sử dụng đầy đủ phương tiện bảo vệ cá nhân khi phun hóa chất bảo vệthực vật

[Lô Thị Hồng Lê (2003), Nghiên cứu thực trạng sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật, tình hình sức khỏe của người chuyên canh chè tại nông trường Sông Cầu và xã

Minh Lập - Đồng Hỷ - Thái Nguyên, luận văn thạc sĩ Y học, Trường Đại học Y –

Dược Thái Nguyên, Nguyễn Văn Tư (2003), Nghiên cứu một số chỉ số hóa sinh,kiến thức hiểu biết, sức khỏe ở người sử dụng thuốc trừ sâu trong chuyên canh chè,

Đề tài nghiên cứu khoa học cấp bộ, mã số B2001 – 04 – 08, Trường Đại học YKhoa Thái Nguyên.]

Mỗi năm trên thế giới sản xuất và tiêu thụ khoảng 24 triệu tấn hợp chất clo hữu cơ.Trong hệ nước ngầm và nước thải công nghiệp thường tìm thấy một số hợp chấtnhư 1,2-Dichloroethane (1,2-DCE), Tetrachloroethylene (TTCE), 1,1,2-Trichloroethene (1,1,2-TCE) với nồng độ cao gây ảnh hưởng đến sức khỏe conngười cũng như hệ sinh thái [http://www.eurochlor.org/] Một số chất độc đã bị cấm

sử dụng như hexaclorocyclohexan (HCH) nhưng nhiều nước vẫn còn sản xuất hoặc

sử dụng như các nước ở Châu Phi, Ấn Độ và các nước khác do chưa tìm được chấtthay thế Chất DDT cũng là một chất khuyến cáo không nên sử dụng nhưng hằngnăm hiện nay vẫn còn được sản xuất ở một số nước để dùng vào mục đích y tế

[Thông tấn xã Việt Nam (2005), Loại bỏ dần 12 chất thải nguy hại ra khỏi cuộc sống].

Dung môi clo có thể ảnh hưởng đến hệ thống thần kinh trung ương, thận vàgan, gây viêm da và kích ứng da, mắt, đường hô hấp trên và màng nhầy Qua tiếpxúc lâu ngày với dung môi có thể dẫn đến trầm cảm, nhức dầu, buồn ngủ, bất tỉnh

và thậm chí tử vong Một số dung môi clo có thể gây ung thư ở chuột, khi cho chuộttiếp xúc với các dung môi này ở nồng độ cao Việc sử dụng quá nhiều các dung môiclo đã gây ảnh hưởng đến môi trường như biến đổi khí hậu, gây mưa axit hay sựhình thành sương khói [http://www.substech.com/dokuwiki/]

1.1.5 Cách thức gây độc của các hợp chất clo hữu cơ đối với cơ thể

Thuốc BVTV xâm nhập vào cơ thể con người bằng các con đường như qua da, quamiệng, qua hô hấp và gây ngộ độc đến tính mạng con người:

 Con đường qua da: Thuốc thâm nhập qua da, đây là con đường xâm nhậpphổ biến nhất

 Con đường qua miệng và hô hấp: Thuốc xâm nhập qua đường miệng thườnggây ngộ độc rất nặng.

Khi thuốc bảo vệ thực vật tồn dư trong thực phẩm vào cơ thể qua con đường ănuống, chúng có thể bị loại bớt theo khí thở, theo phân hoặc nước tiểu, tuy nhiênkhông thể tránh khỏi sự chuyển hóa các chất độc hại này ở trong gan Một số thuốcbảo vệ thực vật chuyển hóa thành những sản phẩm ít độc hơn, dễ hòa tan trong nướchơn thì sẽ dễ dàng bị loại bỏ, nhưng cũng có những loại hóa chất lại tạo thànhnhững chất trao đổi trung gian độc hơn (như paration chuyển thành paraoxon), tíchlũy trong một số cơ quan hoặc mô mỡ gây tổn thương và kèm theo các triệu chứngngộ độc nguy hiểm Thuốc bảo vệ thực vật có trong thức ăn, đồ uống với lượng lớn

có thể gây ngộ độc cấp tính gây rối loạn tiêu hóa (nôn mửa, tiêu chảy), rối loạn thầnkinh (nhức đầu, hôn mê, co giật hoặc co cứng cơ ), trụy tim mạch, suy hô hấp rất

dễ dẫn dến tử vong Những trường hợp ngộ độc mãn tính do tiếp xúc với thuốc bảo

vệ thực vật hoặc tồn dư trong thực phẩm sử dụng với lượng nhỏ nhưng tích lũy lâungày cũng có thể gây các tổn thương ở đường tiêu hóa, hô hấp, tim mạch, thần kinh,rối loạn hệ thống tạo máu, ảnh hưởng tới chức năng gan, thận

[http://ytehagiang.org.vn/old/index.php?

con-ngi&catid=94:y-t-d-phong&Itemid=185]

option=com_content&view=article&id=423:tac-hi-ca-thuc-bo-v-thc-vt-i-vi-sc-khe-Nhóm Clo hữu cơ bao gồm những hợp chất hữu cơ rất bền vững trong môitrường tự nhiên và thời gian bán phân huỷ dài (ví dụ như DDT có thời gian bánphân huỷ là 20 năm, chúng ít bị đào thải và tích luỹ vào cơ thể sinh vật qua chuỗithức ăn) Đại diện của nhóm này là Aldrin, Dieldrin, DDT, Heptachlo Chúng lànhững chất độc với tế bào thần kinh Các chất này liên kết với các chất thành phầncủa màng sợi trục thần kinh (là Protein và Lipid), cản trở sự vận chuyển của Ion(chủ yếu là Na+ và K+) qua màng, làm mất điện thế tạo nên sự dẫn truyền xungđộng thần kinh, dẫn đến thần kinh bị tê liệt, sâu chết Các hợp chất Clo hữu cơ còn

ức chế hoạt tính của men ATPaze và một số men khác, làm các tế bào thần kinh bịnhiễm độc Thuốc còn ức chế phân chia tế bào ở trung kỳ, dẫn đến hiện tượng đa

bội thể, làm xuất hiện những tế bào nhiều nhân không đồng nhất Côn trùng bịnhiễm độc thần kinh, lúc đầu có biểu hiện kích động, sau đó co giật do kích độngmạnh lên và cuối cùng là tê liệt rồi chết.

Sự chuyển hoá năng lượng là cơ sở tạo nên quá trình trao đổi chất trong cơ thể sống.Năng lượng bị tiêu hao trong các hoạt động sẽ được lấy lại từ các chất hữu cơ trongthức ăn thông qua sự hô hấp với sự tham gia của các enzyme Các hợp chất clo hữu

cơ ức chế hoạt tính của các enzyme hô hấp oxydaza, hydrogenaza, xitocrom làmtích luỹ acid xetonic, ngăn cản chu trình Kreb trong quá trình hô hấp hậu quả là gây

ức chế sự chuyển hoá năng lượng trong quá trình trao đổi chất[http://nicotex.vn/index.php?option=com_content&view=article&id=154:co-che-tac-dong-cua-thuoc-bao-ve-thuc-vat&catid=44:tai-lieu-tham- thao&Itemid=66]

1.2 Tình hình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc halogen ở Việt Nam

Thuốc bảo vệ thực vật là các chất hay hỗn hợp chất tự nhiên hoặc tổng hợp có tácdụng kiểm soát, đẩy lùi các loại sâu và côn trùng gây tác hại đến thực phẩm, pháttán bệnh tật Các loại hóa chất bảo vệ thực vật gồm nhiều loại, chủ yếu gồm 4 nhómchính: họ clo hữu cơ (organochloride), họ lân hữu cơ (organophosphate), họcarbamate, họ cúc (pyrethoid) Ngoài ra, còn có một số nhóm khác như: nhómtriazole, nhóm benzimidazole, các chất trừ sâu vô cơ (nhóm asen), nhóm thuốctrừsâu sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn, nấm, virus (thuốc trừ nấm, trừ vi khuẩn)[Nguyễn Trần Oánh]

Thuốc BVTV đã góp phần hạn chế sự phát sinh, phát triển của sâu bệnh,ngăn chặn và dập tắt các đợt dịch bệnh trên phạm vi lớn, bảo đảm được năng suấtcây trồng, giảm thiểu thiệt hại cho nông dân Tuy nhiên, những năm gần đây việc sửdụng thuốc BVTV trong thâm canh sản xuất, đặc biệt trong thâm canh hoa, câycảnh có xu hướng gia tăng cả về chất lượng lẫn chủng loại Một thực tế hiện nay làviệc sử dụng thuốc BVTV tràn lan, không thể kiểm soát đã và đang gây ảnh hưởngxấu đến môi trường đất, nước, không khí, sức khoẻ con người và môi trường sinh

thái [thuc-vat-45645/]

http://luanvan.net.vn/luan-van/tong-quan-cong-nghe-san-xuat-thuoc-bao-ve-Trong sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam các loại thuốc BVTV đã được sửdụng từ nhiều năm trước đây Tuy nhiên thời kỳ đó, do tình hình phát sinh, pháttriển của sâu hại, dịch bệnh diễn biến chưa phức tạp nên số lượng và chủng loạithuốc BVTV chưa nhiều Ngày đó do thiếu thông tin và do chủng loại thuốc BVTVcòn nghèo nàn nên người nông dân đã sử dụng nhiều loại thuốc BVTV có độc tínhcao, tồn lưu lâu trong môi trường.

Những năm gần đây, do thâm canh tăng vụ, tăng diện tích, do thay đổi cơcấu giống cây trồng nên tình hình sâu bệnh diễn biến phức tạp hơn Vì vậy số lượng

và chủng loại thuốc BVTV sử dụng cũng tăng lên Nếu như trước năm 1985 khốilượng thuốc BVTV dùng hàng năm khoảng 6.500 đến 9.000 tấn thành phẩm quy đổi

và lượng thuốc sử dụng bình quân khoảng 0,3 kg hoạt chất /ha thì thời gian từ năm

1991 đến nay lượng thuốc sử dụng biến động từ 25- 38 ngàn tấn Đặc biệt năm 2006lượng thuốc BVTV nhập khẩu là 71.345 tấn Cơ cấu thuốc BVTV sử dụng cũng cóbiến động: thuốc trừ sâu giảm trong khi thuốc trừ cỏ, trừ bệnh gia tăng cả về sốlượng lẫn chủng loại.Do tập quán canh tác và diện tích trồng lúa lớn nên các cáctỉnh vùng đồng bằng nông dân sử dụng nhiều thuốc BVTV hơn (1,15- 2,66 kg thànhphẩm/ha/năm) so với các tỉnh miền núi (0,23 kg thành phẩm/ha/năm)

nhiem-moi-truong_120-55-vi-VN.aspx]

[http://www.office33.gov.vn/su-dung-thuoc-bao-ve-thuc-vat-va-van-de-o-Việc sử dụng thuốc BVTV không rõ nguồn gốc xuất xứ và cùng với đó các loại bao

bì, chai lọ đựng thuốc BVTV không được xử lý đúng cách cũng đang là mối nguy

cơ đe dọa nghiêm trọng tới sức khỏe cộng đồng và gây ô nhiễm môi trường Cácthành phần độc hại trong thuốc BVTV sẽ thâm nhập vào các nguồn nước mưa, nướcthải, nước sinh hoạt trực tiếp hoặc gián tiếp tác động lên con người [Dwivedi, A H.and Pandehotochemical degradation of halogenated compounds: A review,Scientific reviews and Chemical Communications: 2(1), 41-65]

Bảng 3: Giới hạn tối đa cho phép của dư lượng hoá chất bảo vệ thực vật nguồn gốc

clo hữu cơ trong đất [Tổng cục Môi trường và Vụ Pháp chế (2008), Quy chuẩn kỹ

thuật quốc gia về dư lượng hoá chất bảo vệ thực vật trong đất.]

STT Tên thuốc trừ sâu, diệt cỏ

Biện pháo oxy hóa ở nhiệt độ cao

Biện pháp oxy hóa ở nhiệt độ cáo gồm 2 giai đoạn chính:

Giai đoạn 1: Tách chất ô nhiễm ra hỗn hợp đất bằng phương pháp hóa hơi

Giai đoạn 2: Chất ô nhiễm được phá hủy ở nhiệt độ cao Liên kết C-Cl trong phân

tử bị phá vỡ bằng cách thiêu đốt trong bằng O2 không khí ở nhiệt độ cao, trong các

lò đốt được thiết kế đặc biệt [http://www.climategis.com/2011/03/]

Đây là biện pháp tổng hợp vừa tách chất ô nhiễm ra khỏi đất, vừa làm sạchtriệt để chất ô nhiễm, hiệu suất xử lý cao (trên 95%), cặn bã tro sau xử lý chiếm tỷ

lệ nhỏ (0,01%) Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là không được sửdụng phổ biến do chi phí tốn kém đặc biệt là bước để nâng nhiệt độ lên tới hơn900°C, không áp dụng cho xử lý đất bị ô nhiễm kim loại nặng, cấu trúc sau xử lý bịphá hủy Mặt khác phương pháp này không an toàn về phương diện môi trường dokhí thải còn lẫn nhiều chất độc, cần phải lọc trước khi thải ra môi trường, quá trìnhđốt hình thành các sản phẩm phụ như dioxin, dibenzofuran là những hợp chất cònđộc hại gấp nhiều lần [Nguyễn Thành Yên (2010), Đánh giá hiện trạng công nghệ

xử lý chất thải nguy hại tại Việt Nam hiện nay, Hội nghị Môi trường toàn quốc lần

thứ Ba, Hà Nội., Ordóñez S., Sastre H., Dı́ez F V (2001), “Catalytic

hydrodechlorination of tetrachloroethylene over red mud”, Journal of Hazardous Materials, 81(1-2), pp 103-114].

Phân hủy bằng tia cực tím (UV) hoặc bằng ánh sáng mặt trời

Các phản ứng phân hủy bằng tia UV hay bằng ánh sáng mặt trời thường cótác dụng Làm đứt gẫy mạch vòng hoặc mối liên kết giữa cacbon với clo sau đó thaythế nhóm clo bằng nhóm phenyl hoặc nhóm hydoxyl và giảm độ độc của hoạt chất.Phương pháp này có hiệu suất cao, chi phí xử lý thấp, rác thải an toàn với môitrường Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là không thể áp dụng để xử lýchất ô nhiễm hay chất thải có nồng độ đậm đặc [http://phantichmoitruong.com].Nếu áp dụng để xử lý ô nhiễm đất thì lớp đất trực tiếp được tia UV chiếu không dàyhơn 5mm Do đó, khi cần xử lý nhanh lớp đất bị ô nhiễm tới các tầng sâu hơn 5mmthì biện pháp này ít được sử dụng và đặc biệt trong công nghiệ xử lý hiện trường.[http://www.climategis.com/2011/03/]

Phá hủy bằng vi sóng Plasma

Biện pháp này được tiến hành trong thiết bị cấu tạo đặc biệt Hợp chất clohữu cơ được dẫn qua ống phản ứng sinh ra sóng phát xạ electron cực ngắn Sóngphát xạ electron tác dụng vào các phân tử hữu cơ tạo ra nhóm gốc tự do và sau đó

dẫn tới các phản ứng tạo clorua, sản phẩm tạo ra phụ thuộc vào bản chất hợp chaatss BVTV Ưu điểm của biện pháp này là hiệu suất xử lý cao, thiết bị gọn nhẹ,

khí thải an toàn cho môi trường, song biện pháp này chỉ sử dụng hiệu quả trong phalỏng và pha khí, chi phí cao, phải đầu tư lớn [http://www.climategis.com/2011/03/]

Biện pháp ozon hóa kết hợp UV

Ozon hóa kết hợp với chiếu tia UV là biện pháp phân hủy các chất thải clohữu cơ trong dung dịch hoặc trong dung môi Phản ứng hóa học để phân hủy hợpchất là:

Thuốc trừ sâu, diệt cỏ + O3 CO2 + H2O + các nguyên tố khác

Kỹ thuật này sử dụng thiết bị gọn nhẹ, chi phí vận hành thấp, chất thải ra môitrường sau xử lý ít độc, thời gian phân hủy ngắn Nhược điểm của biện pháp này chỉ

sử dụng có hiệu quả cao trong các pha lỏng, pha khí Chi phí ban đầu cho xử lý làrất lớn [http://phantichmoitruong.com]

1.3.2 Phương pháp hóa học

Phương pháp khử

Phương pháp khử sử dụng dòng khí H2 để cắt bỏ liên kết C-Cl trong hợp chấthữu cơ chứa clo và thay thế nguyên tử clo bị loại bỏ bằng nguyên tử H2 Đây làphương pháp quan trọng để xử lý ô nhiễm các chất clo hữu cơ thành các chất khôngđộc hại và được sử dụng cho các quá trình khác của công nghệ tổng hợp hữu cơ.Phương pháp này cho hiệu suất cao, không sinh ra các sản phẩm thứ cấp độc hại vàthời gian phản ứng cũng nhanh hơn đa số các phương pháp khác Sản phẩm chínhcủa phương pháp này chủ yếu là HCl, hợp chất có thể dễ dàng loại bỏ qua việctrung hòa với kiềm trong khi các sản phẩm còn lại là các Hydrocacbon có thể đượcđốt cháy một cách an toàn, không độc hại Nhược điểm của phương pháp là chi phícao do thiết bị đắt tiền [Ordóñez S., Sastre H., Dı́ez F V (2001), “Catalytic

hydrodechlorination of tetrachloroethylene over red mud”, Journal of Hazardous Materials, 81(1-2), pp 103-114]

Phương pháp oxy hóa sử dụng xúc tác

Bản chất của phương pháp này là đốt các hợp chất chứa clo ở nhiệt độ cao sửdụng các chất xúc tác Mức độ chuyển hóa của quá trình này cao và hơn 90% cáchợp chất clo hữu cơ được biến đổi thành các hợp chất an toàn hơn như CO2, H2O vàHCl ở nhiệt độ tương đối thấp Chất xúc tác sử dụng trong quá trình này là Pd hoặc

Pt tuy nhiên đây là những kim loại quý nên giá thành xử lý cao mặt khác quá trìnhxúc tác có thể gây độc cho người thực hiện nếu không có các biện pháp an toàn đầy

đủ [González Valasco J R., Aranzabal A., Lospez Fonseca R., Feret R., Marcos J A (2000), “Enhancement of the catalytic oxidation of hydrogen-lean

González-chlorinated VOCs in the presence of hydrogen-supplying compounds”, Applied Catalysis B: Environmental, 24(1), pp 33-43.]

Phương pháp hấp thụ bằng than hoạt tính

Có nhiều dạng than hoạt tính được sử dụng để khử Clo, trong đó dạng than hạt(GAC) thường được sử dụng trong các bộ lọc nước lớn Than hoạt tính loại bỏ Clo

và các hợp chất Clo bằng cơ chế hấp thụ bề mặt, ngoài ra, Carbon của than hoạt tínhcòn phản ứng trực tiếp với Clo, theo một nhiên cứu cho thấy 1 kg Carbon có thểphản ứng với 6 kg Clo

sử dụng nhóm vi sinh vật có sẵn trong môi trường Chúng có khả năng phá hủy sựphức tạp trong cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của hợp chất BVTV

Tập đoàn vi sinh vật rất phong phú và phức tạp Chúng có thể phân hủy hợpchất BVTV và dùng thuốc như nguồn cung cấp chất dinh dưỡng, đó là cacbon, nitơ

và năng lượng để chúng phát triển và phân chia Quá trình phân hủy của vi sinh vật

có thể gồm một hay nhiều giai đoạn, để lại các sản phẩm trung gian và cuối cùngdẫn tới sự khoáng hóa hoàn toàn sản phẩm thành CO2, H2O và một số chất khác.Một số loài thuốc thường chỉ bị một số loài vi sinh vật phân hủy Nhưng có một số

loài vi sinh vật có thể phân hủy được nhiều hợp chất BVTV trong cùng một nhómhoặc ở các nhóm thuốc khá xa nhau.

Quá trình phân hủy hợp chất BVTV của sinh vật đất đã xảy ra trong môi trường cóhiệu xuất chuyển hóa thấp Để tăng tốc độ phân hủy và phù hợp với yêu cầu xử lý,người ta đã tối ưu các điều kiện sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật như: pHmôi trường, độ ẩm, nhiệt độ, dinh dưỡng, độ thoáng khí, bổ sung vào môi trườngđất chể phẩm sinh vật có khả năng phân hủy hợp chất BVTV [I C MacRae , Martin Alexander (1965), "Herbicide Degradation, Microbial

Degradation of Selected Herbicides in Soil”, J Agric Food Chem., 13 (1), pp 72–

[http://www.climategis.com/2011/03/]

Công nghệ sinh học áp dụng cho xử lý các chất thải nguy hiểm trong đó có các hợpchất hữu cơ dẫn xuất halogen bao gồm sự phát triển của hệ xử lý có sử dụng cácenzym xúc tác tác sinh học phân hủy sinh học, làm suy thoái hoặc tích lũy chất gây

ô nhiễm môi trường thuận tiện cho việc xử lý Việc xử lý sinh học cho các hợp chấthữu cơ dẫn xuất halogen trong môi trường áp dụng công nghệ sinh học được ápdụng theo: (i) sử dụng các chủng vi sinh vật mang gen biến đổi di truyền; (ii) sửdụng thích nghi hoặc biến đổi gen vi sinh vật được thiết kế để xử lý đất bị ô nhiễm,nước ngầm, (iii) xử lý ô nhiễm với sự tham gia của các vi sinh vật tạo màng sinhhọc hoặc có hoạt tính cố định các chất độc từ môi trường, (iv) phát triển các cảmbiến sinh học để phát hiện các dấu vết của chất độc hữu cơ, (v) thu hồi các sảnphẩm từ chất thải bằng cách sử dụng vi khuẩn tích lũy [Fetzner S and Ligens F, 1994.Bacterial dehalogenases: Biochemistry, genetics, and biotechnological application.Microbiol Rev 58 (4):641-685.]

1.4 Vi sinh vật phân hủy hợp chất clo hữu cơ

Sự phân giải các hợp chất thường không chỉ bởi một chủng vi sinh vật duynhất mà thường bởi một nhóm các vi sinh vật khác nhau Các nhóm sinh vật khá đadạng và tồn tại trong các điều kiện sinh thái môi trường khác nhau [Marzorati M,Balloi A, Ferra F, Corallo L, Carpani G, Lieven W, Verstraete W Daffonchio D(2010), “Bacterial diversity and reductive dehalogenase redundancy in a 1,2-dichloroethane degrading bacterial consortium enriched from a contaminated

aquifer, Microbial Cell Factories, 9, pp 12.] Chiba và cộng sự đã phân lập được

các chủng vi sinh vật từ bùn ngoài biển [Chiba K., Yoshida T., Norihiro I.,Nishimura H., Imada C., Yashuda H., Sako Y., (2009), “Isolation of bacterium

possessing a haloacid dehalogenase from marine sediment core”, Microbes and Environments, 24(3), pp.276-279.], trong khi Hamid và cộng sự phân lập các chủng

có sử dụng cơ chất 2,2- Dichloropropionate từ đất vùng núi lửa [Hamid AAA,Hamdan S, Ariffin AHZ, Huyop F (2010), “Molecular prediction of dehalogenaseproducing microorganism using 16S DNA analysis of 2,2 dichloropropionate

degrading bacterium isolated from volcanic soil”, Journal of Biology Science,

10(3), pp 190-199.] Habe và cộng sự đã phân lập hai chủng Pseudomonas sp

CA10 và Terrabacter sp DBF63 có khả năng sử dụng 2,7- DCDD

[Habe H, Ide K, Yotsumoto M, Tsuji H, Hirano H, Widada J, Yoshida T, Nojiri

H, Omori T (2001), “Preliminary examinations for applying a carbazole-degrader,

Pseudomonas sp strain CA10, to dioxin-contaminated soil remediation”, Journal of Bacteriology, 181(10), pp 105-113] Yadav J.S và cộng sự đã phát hiện nấm

Phanerochaete chrysosporium có khả năng phân huỷ 2,4-D và rất nhiều hợp chất

clo hữu cơ khác như Clorinated phenol, Polychlorinate biphenyls (PCBs), Dioxin[Yadav J S and Reddy C.A (1993), “Mineralization of 2,4-dichlorophenoxyaceticacid (2,4-D) and mixtures of 2,4-D and 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid by

Phanerochaete chrysosporium”, Applied and Environmental Microbiology, 59:

2904-2908.]

Các nghiên cứu phân hủy sử dụng hợp chất halogen từ vi sinh vật tập trungnhiều vào nhóm halogen có vòng thơm Việc phân hủy nhóm hợp chất này cần có

sự tham gia tập đoàn gồm nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau Không có nhiều cáccông trình công bố cơ chế tác dụng từ của các chủng đơn lẻ Một số kết quả công bố

mới về phân lập đánh giá khả năng phân hủy như: Chủng Desulfomonile tiedjei

DCB-1 có khả năng sử dụng dechlorinates 3-chlorobenzoate, chlorophenols và

tetrachlorethylene; chủng Desulfomonile tiedjei DCB-2, thuộc chi Clostridium, ưu

tiên dechlorinates nhóm thế ortho để phenolic nhóm hydroxyl và tri

dichlorophenols, chủng Clostridium sphenoides và một số vi khuẩn thuộc chi Bacillus và họ Enterobacteriaceae tham gia vào khử clo lindane, chủng Aerobacter aerogenes chuyển hoá thuốc trừ sâu DDT và chủng Alcaligenes denitrificans NTB-

1 phát triển trên môi trường 2,4- dichlorobenzoate trong điều kiện hiếu khí [ĐặngThị Cẩm Hà, Nguyễn Bá Hữu, Mai Anh Tuấn, Nguyễn Đương Nhã, Nguyễn QuốcViệt, Nguyễn Nguyên Quang (2008), “Khảo sát vi sinh vật trong vùng nhiễm chấtdiệt cỏ chứa dioxin ở khu vực sân bay Đà Nẵng và khử độc đất nhiễm ở điều kiện

phòng thí nghiệm”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6(4A), trang 138-143.]

Ngoài các vi khuẩn hiếu khí nhóm vi khuẩn kỵ khí thuộc chi Dehalococcoides có

khả năng khử clo của nhiều hợp chất chứa clo như Trichloethylene,Vinylchloride… [Nguyễn Bá Hữu, Đàm Thúy Hằng, Nghiêm Ngọc Minh,Đặng Thị Cẩm Hà (2007), “Xác định cấu trúc tập đoàn vi khuẩn khử loại cloDehalococcoides trong mẫu bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân

bay Đà Nẵng bằng kỹ thuật PCR-DGGE”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 16, tr 41-45.]. Govender và tập thể đã phát hiện chủng

Ancylobacter hay chủng Xanthobacter autotrophicus trong nghiên cứu của

Janssen có khả năng phân hủy 1,2-Dichloroethane [Govender A., Pillay B.(2011), “Characterization of 1, 2-dichloroethane (DCA) degrading bacteria

isolated from South African waste water”, African Journal of Biotechnology,

10(55), pp 11567-11573., Janssen D B., Pries F., van der Ploeg J., KazemierB., Terpstra P., Witholt B (1989), “Cloning of 1, 2-dichloroethane

degradation genes of Xanthobacter autotrophicus GJ10 and expression and sequencing of the dhlA gene”, Journal of Bacteriology, 171, pp.91-99.]

Trong nghiên cứu của Jacobus và cộng sự chủng Pseudomonas sp có thể phát triển

trên DCE như là nguồn cacbon và năng lượng duy nhất [Jacobus, C H andSybe, H., (1999), “Monooxygenase-mediated 1,2-Dichloro ethane degradation

by Pseudomonas sp strain DCA1”, Apply Environ Microbiol, 65(6), pp

2466-2470.]

Trong nghiên cứu sự phân hủy Sodium-2,2- Dichloropropionate (2,2-DCPS) các

chủng vi khuẩn Agrobacterium và Alcaligenes, hay một số loài trong chi Pseudomonas, Norcadia và một số loài khác như Rhizobium sp, Comomonas acidvarans, Alcaligenes xylosoxidans cũng được phát hiện có khả năng phân

hủy hợp chất 2,2-DCP [Allison N., Skinner A J., Cooper R A (1983), “The

dehalogenases of a 2,2-dichloropropionate degrading bacterium”, Journal General Microbiology, 129, pp 1283-1293.] Hirsch và Alexander cũng nhậnthấy 89% tới 100% hàm lượng 2,2 DCPS bị phân giải sau 3 tuần trong môi

trường đất chứa các chủng thuộc chi Nocardia và Pseudomonas [Hirsch P.,

Alexander M.icrobial decomposition of halogenated propionic and aceticacids Can j microbiol.6:241249.] Sự phân hủy này không phụ thuộc vào loạiđất, kết cấu của đất mà liên quan trực tiếp đến số lượng, thành phần các chủng

vi sinh vật trong mẫu Sự phân hủy sinh học của các hợp chất Dichloroaniline bởi nấm và vi khuẩn cũng được đề cập trong nhiều nghiên cứu[Tixier C., Sancelme M., Ait-Aissa S., Widehem P., Bonnemoy F., Cuer A.,Truffaut N., Veschambre H (2002), “ Biotransformation of phenylurea

3,4-herbicides by a soil bacterial strain, Arthrobacter sp N2: structure, ecotoxicity and fate of diuron metabolite with soil fungi” Chemosphere, 46(4), pp 519-

526.] Theo nhiều nghiên cứu, một số loài trong chi Pseudomonas, Bacillus,

Achromobacter… được xác định là có khả năng phân hủy hợp chất 3,4-DCA

[Xie-Feng Yao, Fazlurrahman K., Rinku P., Janmejay P., Roslyn G M.,

Rakesh K J., Jian-Hua Guo, Robyn J R., John G O., Gunjan P (2011),

“Degradation of dichloroaniline isomers by a newly isolated strain, Bacillus megaterium IMT21”, Microbiology, 157, pp 721-726., Young M K.,

Kunbawui P., Won C K., Jae H S, Jang E K., Heui D P., Koo R (2007),

“Cloning and characterization of a catechol degrading gene cluster from

3,4-dichloroaniline degrading bacterium Pseudomonas sp KB35B”, Journal of Agricultural and Food chemistry, 55, pp 4722-4727.]. Kết quả công bố gần

đây trong nghiên cứu của Tian Li và cộng sự, chủng Myroides odoratimimus

có khả năng phân hủy 64% cơ chất 3,4-DCA trong 24 giờ [Tian Li, Xin- PingDeng, Jin- Jun Wang, Hui Zhao Lei Wang, Kun Qian (2012),

“Biodegradation of 3,4-Dichloroaniline by a Novel Myroides odoratimimus strain LWD09 with moderate salinity tolerance”, Water Air Soil Polluttion,

223, pp 3271-3279.]

Vi sinh vật có khả năng phân giải nhờ việc sản xuất ra enzyme Dehalogenase

Chủng Alcaligenes eutrophus JMP134 và Pseudomonas cepacia có khả năng

tổng hợp muconate cycloisomerases phân hủy 4-fluoromuconolactone Các

chủng Arthrobacter trên môi trường bổ sung 2,4 D và Pseudomonas sp NCIB

9340 đều có chứa các enzym chuyển đổi chloromaleylacetate thành succinate.Trichloro ethylen (TCE) được sử dụng nhiều trong công nghiệp hóa chất đượcnhiều nhóm vi sinh vật oxy hóa với sự tham gia xúc tác bởi nhiều loại enzymkhác nhau như toluene 2,3-dioxygenase, toluene 2-monooxygenase, toluene 4-monooxygenase, phenol hydroxylase, 2,4-dichlorophenol hydroxylase, propanemonooxygenase, ammonia monooxygenase và metan monooxygenase Chủng vi

khuẩn Methylosinus trichosporium OB3b có enzym chuyển hóa halogen thuộc

nhóm oxygenase là monooxygenase có hoạt tính mạnh nhất Một số vi sinh vật

thuộc nhóm xạ khuẩn Actinomyces và Streptomyces có thể tổng hợp các enzym

ngoại bào có hoạt tính phân hủy hợp chất halogen như laccases, tyrosinases vàperoxidases [Fetzner S and Ligens F (1994), Bacterial dehalogenases:Biochemistry, genetics, and biotechnological application Microbiol Rev 58

(4):641-685., Marzorati M, Balloi A, Ferra F, Corallo L, Carpani G, Lieven W,Verstraete W Daffonchio D, 2010, Bacterial diversity and reductivedehalogenase redundancy in a 1,2 ichloroethane degrading bacterial consortiumenriched from a contaminated aquifer Microbial Cell Factories 9:12.] Nhiềuchủng vi sinh vật mang có enzym dehalogenase mới được phân lập, tinh sạchtrong thời gian gần đây [Horisaki T, Yoshida E, Kaori S, Takemura T, Yamane

T and Nojiri H, 2011 Isolation and characterization of monochloroacetic acid –degradation bacteria J Gen Appl Microbiol 57: 277-284., Kurihara T, 2011 AMechanistic analysis of enzymatic degradation of Organohalogen Compounds.Biosci Bitechnol Biochem 75 (2):189-198.]

Các enzyme thuộc nhóm này từ vi sinh vật đã thu hút rất nhiều sự quan tâmcủa các nhà khoa học vì chúng có thể ứng dụng cho ngành công nghiệp hóa chất vàcông nghệ môi trường Hiện nay các nghiên cứu phân lập các chủng vi sinh vậtphân hủy nhóm halogen này còn gặp nhiều khó khăn, việc tinh sạch và nghiên cứucác đặc điểm từ các enzym của các chủng vi sinh vật này còn khó khăn hơn nhiều

do sự đa dạng của các hợp chất, dẫn xuất halogen cũng như sự đa dạng của cácenzym tham gia xúc tác cho sự phân cắt của nhóm thế halogen từ các hợp cất cóvòng thơm, haloalkanes, haloalcohols và haloacids Việc phân lập các chủng vi sinhvật có enzym dehalogenase cũng như tinh sạch, nghiên cứu đặc tính các enzym nàykhông những làm sáng tỏ các quá trình chuyển hóa mà còn góp phần tạo ra các sảnphẩm nhằm mục đích phát hiện sự tồn tại của các chất độc hại này trong môi trường

và loại bỏ nó.[Mowafy AM,]

1.5 Tình hình nghiên cứu sự phân hủy hợp chất halogen bằng vi sinh vật tại Việt Nam

Tại Việt Nam vốn là một nước nông nghiệp và hàng năm chúng ta sử dụngmột lượng lớn các hóa chất bảo vệ thực vật, bảo quản sản phẩm nông nghiệp trongnuôi trồng thủy sản hay sản xuất công nghiệp…Trong số các hợp chất này nhómchất chứa halogen chiếm một tỷ lệ lớn Các chất độc này đang phá hủy hệ sinh tháimôi trường, gây ô nhiễm các nguồn nước ảnh hưởng đến sức khỏe của cộng đồng

Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu cơ bản nhằm đánh giá tác động môitrường và đặc biệt chưa quan tâm đầu tư đến việc nghiên cứu sử dụng các chế phẩmsinh học nói chung trong đó có các vi sinh vật có mang enzym dehalogenase giúpphân hủy hợp chất halogen Số lượng các công trình công bố trong nước về cácenzym phân hủy hợp chất halogen chưa nhiều

Nguyễn Thị Kim Cúc và Phạm Việt Cường đã tiến hành phân lập và tuyểnchọn một số chủng thuộc chi Pseudomonas có khả năng phân hủy được methylparathion [Nguyễn Thị Kim Cúc; Phạm Việt Cường; Nguyễn Thị Tuyết Mai(2000), “Một số tính chất của vi khuẩn phân hủy methyl parathion phân lập từ các

mẫu đất tại Hà Nội”, Hội nghị sinh học Quốc gia: Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong sinh học, Hà Nội, tr 29-34.]

Đã có một số nghiên cứu tập trung vào các hợp chất trong thuốc trừ sâu nhưDDT, hay Dioxin [Đào Hùng Cường, Nguyễn Minh Thiên, Nguyễn Trần Nguyên(2008), “Nghiên cứu xác định một số hợp chất clo trong nước mặt, trong đất thuộc

địa bàn thành phố Đà Nẵng”, Tạp chị Khoa học và Công nghệ, Đại học Đà Nẵng,

6(29), 57-58., Nguyễn Bá Hữu, Đàm Thúy Hằng, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng ThịCẩm Hà (2007), “Xác định cấu trúc tập đoàn vi khuẩn khử loại clo Dehalococcoidestrong mẫu bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng bằng kỹ

thuật PCR-DGGE”, Tạp trí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 16: 41-45, Trần

Thị Vân Thi (2007), “Đánh giá sự tồn dư và tích lũy của các hợp chất ô nhiễm chứaclo khó phân hủy tại các vùng cửa sông và đầm phá Thừa Thiên Huế, miền Trung

Việt Nam”, Báo cáo Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Châu Á, ĐHQGHN.]

Gần đây mới có công bố của một số tác giả Viện Công nghệ sinh học trongviệc nghiên cứu tính đa dạng của nhóm vi khuẩn kị khí khử clo hay phân lập cácchủng vi sinh vật tổng hợp lacase ngoại bào, tuy nhiên với sự đa dạng của nhómhalogen, mức độ nguy hại của các nhóm hợp chất nay đối với môi trường thì các kếtquả công bố hiện nay vẫn còn khiêm tốn cả về số lượng và chất lượng Do đó việcphát hiện tìm kiếm các chủng vi sinh vật có hoạt tính mạnh phân huỷ các hợp chấtnày là cần thiết và sẽ góp phần tìm hiểu tính đa dạng của nhóm vi sinh vật có hoạt

tính này.

Như vậy nghiên cứu này của chúng tôi có thể coi là những nghiên cứu mangtính định hướng đầu tiên góp phần vào việc giải quyết ô nhiễm hay tồn dư hợp chấtclo hữu cơ trong môi trường đất, nước, không khí ở Việt Nam

1.6 Một số hợp chất clo hữu cơ

Nhóm hợp chất clo hữu cơ rất đa dạng về thành phần và cấu tạo hợp chất.Trong khuôn khổ của đề tài nghiên cứu, chúng tôi xin đi sâu tìm hiểu đối với 3 hợpchất sau đây

1.6.1 Hợp chất 1,2 - Dichloroethane (1,2 - DCE)

Hợp chất hóa học 1,2-dichloroethan (hoặc 1,2 - DCE ) được tạo ra lần đầutiên năm 1974 từ khí olefin và khí clo, là một hydrocacbon clo, có công thức hóahọc là C2H4Cl2 được sử dụng chủ yếu để sản xuất vinyl clorua monomer (VCM,chloroethene) là các tiền thân sản xuất nhựa PVC 1,2-DCE là chất lỏng khôngmàu, có mùi giống chloroform Ngoài ra, nó được sử dụng như một trung gian chocác hợp chất hóa học hữu cơ khác và như một dung môi [A Field & R Sierra-Alvarez (2004) “Biodegradability of chlorinated solvents and related chlorinatedaliphatic compounds” Rev Environ Sci Biotechnol, 3 (3), pp 185–254]

Hình 3: Công thức hóa học của 1,2-DCE

1,2 - DCE là chất độc (đặc biệt khi hít phải do độ bay hơi cao), rất dễ cháy và

là hợp chất gây ung thư [Hunkeler D., Aravena R., Berry-Spark K., and Cox E.(2005), “Assessment of degradation pathways in an aquifer with mixed chlorinated

hydrocarbon contamination using stable isotope analysis”, Environmental science

& technology, Vol 39 (16) pp 7975-8111, Doucette W.J., Hall A J and Gorder K

A (2010), "Emissions of 1, 2-Dichloroethane from Holiday Decorations as a Source

of Indoor Air Contamination", Ground Water Monitoring & Remediation, Vol 30

(1), pp 67–73] Trong các sản phẩm bằng nhựa như đồ chơi cho trẻ em đã phát hiện

ra việc giải phóng DCE trong nhà với liều lượng đủ cao để gây ung thư Hơn nữa,DCE có tính tan rất thấp trong nước và hầu như không thể phân hủy tự nhiên trongmôi trường, chu kì bán phân giã của hợp chất này đến 50 năm trong các tầng ngậmnước khiến chúng trở thành chất gây ô nhiễm lâu dài đồng thời gây nguy hiểm đếnsức khỏe con người và sinh vật [Wildeman S D and Verstraete W (2003) "Thequest for microbial reductive dechlorination of C2 to C4 chloroalkanes iswarranted" Applied Microbiology and Biotechnology, Vol 61 (2), pp 94–102]

1, 2 - dichloroethan được sản xuất chủ yếu thông qua xúc tác phản ứng

của ethene (etylen) và clo được xúc tác bởi sắt (III) clorua:

H 2C = CH2 + Cl2 → ClCH2 -CH2 Cl (1,2-dichloroethan)1,2-dichloroethan cũng được tạo ra bởi phản ứng oxy clo hóa etylen đượcxúc tác bởi đồng (II) clorua:

2 H2C = CH2 + 4HCl + O2 → 2ClCH 2 -CH2Cl2 + H 2OVới khoảng 80% lượng tiêu thụ 1,2-dichloroethan trên thế giới, thì 1,2-dichloroethan được sử dụng chính trong sản xuất vinyl cloruamonomer (VCM,chloroethene) đồng thời tạo ra HCl sau phản ứng như một sản phẩm phụ VCM làđơn phân của polyvinyl clorua (PVC)

Cl-CH2 -CH 2 -Cl → H2C = CH-Cl + HClHydro clorua có thể được tái sử dụng trong việc sản xuất 1,2-dichloroethan qua conđường oxy clo hóa như mô tả ở trên [http://en.wikipedia.org/wiki/1,2-Dichloroethane]

Vì là dung môi aprotic phân cực tốt, 1,2-dichloroethan có thể được sử dụng nhưchất tẩy nhờn và tẩy sơn Nó được sử dụng như một trung gian trong việc sản xuấtcác hợp chất hữu cơ khác nhau như ethylenediamine Trong phòng thí nghiệm được

sử dụng như một nguồn clo khi loại bỏ ethene và clorua.Thông qua một số phảnứng, 1,2-dichloroethan tạo ra 1,1,1-trichloroethane, đây là chất được sử dụng

trong giặt khô Trong lịch sử, 1,2-dichloroethan đã được sử dụng như một chất phụgia chống kích nổ trong nhiên liệu pha chì.[eyferth, D (2003) "The Rise and Fall ofTetraethyllead 2". Organometallics 22 (25): 5154–5178]

1.6.2 Hợp chất 2,2-Dichloropropionate Sodium (2,2-DCPS)

Còn có tên là Dalapon, có công thức hóa học là C3H3Cl2NaO2 Dalopon làdạng muối hóa học của 2,2-DCP có 3 cacbon với 2 nguyên tử Clo gắn ở vị trí α-C.Đây là loại thuốc trừ cỏ được sử dụng sau khi hạt nảy mầm và có độ độc trung bìnhđối với người Dalapon có dạng bột, rất dễ hòa tan trong nước và dung môi hữu cơ,

do đó việc sử dụng rộng rãi Dalapon gây ra sự xâm nhập lớn loại thuốc trừ cỏ nàyvào nguồn nước, dẫn đến ô nhiễm môi trường

Hình 4: Công thức hóa học của 2,2-DCPS

Hợp chất 2,2-DCPS thủy phân chậm trong nước tạo ra pyruvic acid và Cl-.Khả năng phân hủy càng tăng khi tăng nhiệt độ và nhanh hơn trong môi trườngkiềm Dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời, sự phân hủy 2,2-DCP cũng xảy ra chậmtạo thành pyruvate sau đó chuyển hóa thành cacbondioxide và acetandehyde [Fred

S Tanaka, Ronald G W (1973), “Hydrolysis of aqueous solutions of sodium

2,2-dichloropropionate under self- induced alkaline conditions”, Journal of Agriculture and Food chemistry, 21(2), pp 285-288.]

Ở Việt Nam, 2,2 DCPS thường được dùng để trừ cỏ một lá mầm và hai lámầm kể cả lau sậy, cỏ tranh hay các loại cỏ có bộ rễ ăn sâu dưới đất Thuốc có tácdụng nội hấp nên hấp thu vào lá cỏ rất nhanh, cũng có thể xâm nhập qua rễ cỏ, làmrối loạn sinh lý nên lá biến dạng, thân cong queo, giòn, dễ gẫy và cuối cùng bị chết.[http://thoisu.com/index.php]

Hàm lượng 2,2-DCP với mức vượt quá 2660 ppm trong môi trường đất sẽgây ức chế, kìm hãm các vi sinh vật đồng hóa ni tơ trong đất Với nồng độ lớn gâyảnh hưởng đến năng suất, chất lượng hoa màu, lương thực [Greaves, M P.,

Davies, H A and Marsh, J A (1981), “Effects of pesticides on soil microflora

using dalapon as an example”, Arch Environ Contam Toxicol,10 (4), pp 437-49.]

2,2-Dichloropropionate Sodium còn ảnh hưởng tới sức khỏe con người Khitiếp xúc với nồng độ cao và trong thời gian dài có các triệu chứng như dị ứng da,bỏng da, có hại cho mắt, hệ hô hấp, mệt mỏi, chán ăn, tiêu chảy, nôn mửa, làmchậm xung thần kinh trung ương, có thể gây trầm cảm

[http://nepis.epa.gov/Exe/ZyNET.exe]

1.63 Hợp chất 3,4-Dichloroaniline (3,4-DCA)

Hợp chất 3,4-Dichloroaniline có công thức hóa học là C6H5Cl2N Dạng chấtrắn màu nâu, không tan trong nước, không tương thích với các tác nhân oxy hóa,các axit, axit clorua và anhydit axit, rất dễ cháy

[http://www.chemicalbook.com/

ChemicalProductProperty_EN_CB5696598.htm]

Hình 5: Công thức hóa học của 3,4-DCA

3,4-DCA được sử dụng như một trung gian trong công nghiệp hóa chất đểtổng hợp 3,4-dichlorophenylisocyanate, các thuốc diệt cỏ propanil và thuốc nhuộmazo cho vải polyester Thực tế không sử dụng được trực tiếp 3,4-DCA mà khôngbiến đổi hóa học.3,4-dichlorophenylisocyanate được đưa ra thị trường và tiếp tục sửdụng để sản xuất thuốc diệt cỏ phenylurea (diuron, linuron) và chất diệt khuẩntrichlorocarbanilide 3,4-DCA giải phóng vào thủy quyển thông qua nước thải trongquá trình sản xuất Nó cũng được thải vào môi trường trong suốt quá trình sử dụngcác thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ 3,4-DCA như linuron, diuron, propanil.Thêm nữa, 3,4-DCA được giải phóng như một tạp chất của các thuốc BVTV nàynên phần lớn chúng tồn dư trong đất nông nghiệp [Institute for Health and

Consumer Protection (2006), Summary Risk Assessment Report of DICHLOROANILINE (3,4-DCA) , European Chemicals Bureau, Italy.]

3,4-Khi tiếp xúc với 3,4- DCA nồng độ cao, người bị ngộ độc cấp tính do hìnhthành methaemoglobin gây tím tái, mệt mỏi, khó thở đồng thời làm rối loạn hệ thầnkinh và gây tê liệt [European Union Risk Assessment Report (2006), 3,4-

Dichloroaniline, 4, pp 202-448].

Sự phân hủy sinh học hợp chất 3,4-DCA trong nước gần như không xảy ra Một sốnghiên cứu xác định sau 14 thậm chí 28 ngày hợp chất này không bị phân hủyTrước đây 3,4-DCA được coi là không có khả năng phân hủy trên bề mặt nước thải.Tuy nhiên, thí nghiệm phân hủy với mẫu trầm tích thích hợp, 3,4-DCA đã bị phânhủy 82% sau 28 ngày [Bayer A G (1987), “Unpublished test on biodegradation of3,4-DCA”] Thí nghiệm phân hủy ở tầng giữa cho thấy 3,4-DCA phân hủy 45% sau

30 ngày Nghiên cứu sự phân hủy 3,4-DCA trong đất chỉ ra tỷ lệ khoáng giảm theonồng độ ngày càng tăng của 3,4-DCA… [Lee, Fournier (1978), “A study on theevolution of 3,4D-DCA and TCAB in some selected soils, 2: degradation of 14C-3,

4-DCA and 14C-TCAB”, Journal Korean Agricutural Chemical Society, 2, pp

71-80.] Trong không khí, chu kỳ bán rã của 3,4-DCA là 9 giờ xảy ra nhờ quá trìnhquang hóa với các gốc OH Sự phân hủy sinh học hợp chất 3,4-DCA xảy ra nhờ một

số vi sinh vật như Bacillus, Pseudomonas, Achromobacter hay Myroides odoratimimus… [Tian Li, Xin- Ping Deng, Jin- Jun Wang, Hui Zhao Lei Wang,

Kun Qian (2012), “Biodegradation of 3,4-Dichloroaniline by a Novel Myroides odoratimimus strain LWD09 with moderate salinity tolerance”, Water Air Soil Polluttion, 223, pp 3271-3279.,// Xie-Feng Yao, Fazlurrahman K., Rinku P.,

Janmejay P., Roslyn G M., Rakesh K J., Jian-Hua Guo, Robyn J R., John G O.,

Gunjan P (2011), “Degradation of dichloroaniline isomers by a newly isolated strain, Bacillus megaterium IMT21”, Microbiology, 157, pp 721-726.,// Young M.

K., Kunbawui P., Won C K., Jae H S, Jang E K., Heui D P., Koo R (2007), “Cloning and characterization of a catechol degrading gene cluster from 3,4-

dichloroaniline degrading bacterium Pseudomonas sp KB35B”, Journal of Agricultural and Food chemistry, 55, pp 4722-4727].

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu

Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu được tuyển chọn từ các chủng

vi khuẩn phân lập từ các mẫu đất, nước thu thập tại vườn hoa xã Sơn Đồng, huyệnHoài Đức, Hà Nội Đây là nơi thường xuyên sử dụng thuốc bảo vệ thực vật

Các mẫu sau khi thu thập được bảo quản lạnh và chuyển về phòng thínghiệm phân tích trong thời gian 24 giờ

2.2. Hóa chất – Dụng cụ

2.2.1 Môi trường nuôi cấy

 Môi trường chọn lọc MGB (1 lít) [Hareland, W A., Crawford, R L.,Chapman, P J and Dagley, S (1975), Metalolic function and properties

of a 4-hydroxyphenyl acetic acid 1-hydroxylase from Pseudomonas acidovorans”, Journal of Bacteriology, 121, pp 272-285.]

100 ml BS 10x (BS là dung dịch muối khoáng cơ bản)

100 ml TMSS 10x (TMSS là dung dịch muối của các kim loại)

- 3,4-Dichloroaniline (3,4-DCA) của Sigma (Mỹ)

Môi trường BS, LB được khử trùng ở 121C trong thời gian 120 phút Môitrường TMSS và các hóa chất 2,2-DCP, 3,4-DCA sau khi hòa tan được lọc bằngmàng lọc vô khuẩn với kích thước lỗ 0,2m

Các hóa chất khác có độ tinh sạch cao đảm bảo cho các nghiên cứu phântích

2.3. Máy móc, thiết bị

Nồi khử trùng (ALP - Nhật)

Máy lắc (Satorius - Đức), Wibecuse (Hàn Quốc)

Tủ cấy vi sinh vật (Aura vertical - Ý)

Máy đo mật độ quang học ( Bionate - Anh)

Cân Kern (Satorius - Đức)

Cân Pressica XT 220A (Ý)

Tủ ấm (Memmert - Đức)

Máy li tâm sigma 3K30 (Sartorius - Đức)

Vortex (Ika - Đức)

Tủ sấy (Memmert - Đức)

Máy khuấy từ (Ika - Đức)

Kính hiển vi điện tử quét JSM-5421LV (Nhật Bản) tại Bộ môn Vật lý,Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu mẫu.

Mẫu đất và mẫu nước tại khu vực vườn hoa xã Sơn Đồng, huyện Hoài Đức, Hà Nộiđược thu vào các Falcon bằng các dụng cụ đã khử trùng và đạt quy chuẩn về độsạch

Mẫu đất được lấy bề mặt các luống hoa và ở độ sâu 5 cm so với bề mắt Mẫu nướcthu ở khu vực nước đọng giữa các luống hoa; cống thoát nước và mương nước ngaysát khu vực trồng hoa

2.4.2 Phân lập vi sinh vật

Phương pháp nuôi cấy làm giàu

Các mẫu nuôi cấy được làm làm giàu 2 lần, 5 ngày/lần trong môi trường chọn lọc(môi trường MGB) bao gồm các thành phần môi trường khoáng cơ bản BS,môi trường các nguyên tố vi lượng TMSS và cơ chất 1,2-DCE, 2,2-DCP, 3,4-DCA với nồng độ lần lượt là 5mM, 20mM, 50mg/l tương ứng [Hareland W.A., Crawford R L., Chapman P J., Dagley S (1975) “Metabolic function and

properties of 4-hydroxyphenylacetic acid 1-hydroxylase from Pseudomonas acidovorans”, Journal of Bacteriology, 183(1), pp 5058- 5066.]. Môi trườngđược khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút trước khi bổ sung cơ chất mỗibình 1g mẫu đất, 3ml mẫu nước Các bình có chứa mẫu được nuôi cấy lắctrong 5 ngày ở 30C, 160rpm Sau 5 ngày mẫu được chuyển sang nuôi trênmôi trường MGB sạch để làm giàu lần thứ 2 Trong quá trình nuôi cấy, phânlập luôn đậy chặt nắp bình để tránh sự bay hơi của cơ chất [Hamid AAA,Hamdan S, Ariffin AHZ, Huyop F (2010), “Molecular prediction ofdehalogenase producing microorganism using 16S DNA analysis of 2,2

dichloropropionate degrading bacterium isolated from volcanic soil”, Journal

of Biology Science, 10(3), pp 190-199., Van den Wijngaard A.J., van der

KampK W H J., van der Ploeg J., Pries F., Kazemier B., Janssen D B

(1992), “Degradation of 1, 2-Dichloroethane by Ancylobacter aquaticus and other facultative methylotrophs”, Applied and Environmental Microbiology,

58(3), pp 976-983., Govender A., Pillay B (2011), “Characterization of 1,