Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh phú yên

Vì vậy đề tài “Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên” được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nộ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

VĂN THỊ PHƯƠNG NHƯ

Mã số 62 42 01 07

Cần Thơ, 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

VĂN THỊ PHƯƠNG NHƯ

Mã số 62 42 01 07

Người hướng dẫn khoa hoc

Gs Ts CAO NGỌC ĐIỆP

Cần Thơ, 2015

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn thầy GS TS Cao Ngọc Điệp, người đã tận tình hướng dẫn khoa học, hướng dẫn cách tiếp cận với các kiến thức khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu để tôi hoàn thành luận án tiến sĩ

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh học, Phòng Đào Tạo, Phòng Quản Lý Khoa học, Khoa Sau Đại học và các phòng ban khác của Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án tiến sĩ

Cảm ơn gia đình và những người thân đã động viên và chia sẻ để tôi hoàn thành luận án tiến sĩ

Xin chân thành cảm ơn

TÓM TẮT

Phú Yên là tỉnh ven biển Nam Trung bộ, với nền sản xuất chủ yếu là nông nghiệp trong đó lúa là cây lương thực chính Nhu cầu phân bón đối với cây lúa là rất lớn, nhưng trong đất trồng lúa ở tỉnh Phú Yên chất dinh dưỡng không cao, song do ý thức và trình độ canh tác của người dân còn thấp Do vậy để cải thiện năng suất lúa người dân đã lạm dụng phân bón hóa học đã hưởng đến hiệu quả kinh tế và tác động bất lợi đối với môi trường Vì vậy đề

tài “Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên” được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn

được các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên

có đặc tính cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA cao và đặc biệt là những dòng vi khuẩn này có thể thích nghi tốt với điều kiều thổ nhưỡng và thời tiết ở khu vực tỉnh Phú Yên Các dòng vi khuẩn tuyển chọn có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất phân bón sinh học cho cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên Trong 3 loại môi trường phân lập chuyên biệt đã chọn được 593 dòng vi khuẩn được phân lập từ cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên, có màu sắc khác nhau: vàng nhạt, vàng đậm, trắng đục và trắng trong Hình dạng khuẩn lạc chủ yếu là tròn, bìa nguyên và nhô, hầu hết các dòng vi khuẩn có tế bào dạng hình que, Gram âm Bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi p515FPL và p13B đã xác định được 556 dòng vi khuẩn là vi khuẩn nội sinh cây lúa Các dòng vi khuẩn này được nuôi trong môi trường Burk không đạm, môi trường NBRIP hoặc trên môi trường phân lập và xác định khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan bằng phương pháp so màu Kết quả cho thấy có 533 dòng có khả năng cố định đạm, trong số đó 457 dòng có khả năng hòa tan lân khó tan

và tổng hợp IAA Trong số đó 90 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm khá cao được phân tích vùng tự gen 16S rDNA Kết quả cho thấy các dòng vi khuẩn được định danh có mức tương đồng 97% trở lên so với các dòng vi khuẩn nội sinh trên ngân hàng gen 90 dòng vi khuẩn thuộc trong 5 nhóm: Alphaproteobacteria (chiếm tỉ lệ 1,11%), Betaproteobacteria (chiếm tỉ lệ 11,11%), Gammaproteobacteria (chiếm tỉ lệ 53,33%), Bacteroidetes (chiếm tỉ

lệ 6,67%) và Bacilli (chiếm 27,78%) Trong số 90 dòng vi khuẩn có hoạt tính sinh học cao đã chọn được 22 dòng vi khuẩn có khả năng cung cấp đạm và hòa tan lân khó tan cung cấp cho cây lúa được trồng trong ống nghiệm Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm và hòa tan lân cung cấp cho cây lúa được trồng trong điều kiện nhà lưới thì có 8/22 dòng vi khuẩn có khả năng giúp giảm lượng phân đạm vô cơ cung cấp từ 25% - 75% N (tương đương với 30

kg N - 90 kg N/ha) và 4/8 dòng vi khuẩn có khả năng làm giảm lượng lân vô

cơ cung cấp là 50% P (tương đương với 40 kg P2O5/ha) cho cây lúa Trong thí

nghiệm ngoài đồng tại 2 địa điểm khác nhau trên nền đất thịt pha cát tại tỉnh Phú Yên đã tuyển chọn được 2 dòng vi khuẩn SHL70 (tương đồng 98% với

loài Azospirillum amazonense) và dòng PHL87 (tương đồng 99% Burkholderia kururiensis) có khả năng cung cấp 50% lượng đạm sinh học

(tương đương 60 kg N/ha) cho cây lúa và 2 dòng vi khuẩn TAL1 (tương đồng

99% loài Pseudomonas putida) và TAL4 (tương đồng 99% với loài Bacillus

subtilis) có khả năng hòa tan lân khó tan thành dễ tan để đáp ứng nhu cầu sinh

trưởng và phát triển cho cây lúa và đã tiết kiệm được 50% lượng phân lân vô

cơ (tương đương 40 kg P2O5/ha) nhưng vẫn đảm bảo về năng suất, cải thiện chất lượng gạo Kết quả bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 lên cây lúa trồng ở 2 địa điểm khác nhau tại Phú Yên đều cho hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan cao hơn khi bổ sung riêng rẽ từng dòng cho cây lúa Sự kết hợp 2 dòng SHL70 và TAL4 giúp giảm 50% N (tương đương 60

kg N/ha) và 50% P (tương đương 40 kg P2O5/ha) trong sản xuất lúa mà vẫn đảm bảo được năng suất lúa tốt

Từ khóa: Cố định đạm, hòa tan lân, lúa cao sản, Phú Yên, tổng hợp IAA, vi

khuẩn nội sinh

be responsible for the supply of biologically fixed nitrogen to their host plant and plant promoting growth such as phosphate solubilization and IAA

biosynthesis Title “Isolation and characterization of rice endophytic bacteria cultivated on soils of Phu Yen province” was conducted to isolate and select

rice endophytes with good characteristics such as high nitrogen fixation, phosphate solubilization and IAA production to produce biofertilizer for rice cultivation in soils of Phu Yen province in the future Five hundreds and ninety-three of bacterial isolates were isolated from stems and roots of rice samples which were collected from seven districts and Tuy Hoa city in three kinds of medium (LGI, NFb, RMR) Their colonies had round-shape, climy, smooth, colourless or milk-color, yellow and some colonies appeared in much larger size Using 16S rRNA gene fragments amplified with DNA using eubacterial universal primers (p515FPL and p13B), 556 isolates were identified as endophytic bacteria A total of 533 endophytic isolates had the ability of nitrogen fixation, in which 457/533 isolates have ability of phosphate solubilization together with IAA biosynthesis The sequences of selected endophytic bacteria (90 isolates) showed high degrees of similarity to those of the GenBank references strains (between 97% and 99%) From 90 isolates, 27,78% isolates belonged to Bacilli, 1,11% isolates was Alphaproteobacteria, 11,11% isolates were identified as Betaproteobacteria and 53,33% isolates were Gammaproteobacteria, while 6,67% isolates were Bacteroides Total 22/90 endophytes having high ability of nitrogen fixation

and phosphate solubilization were selected from the in-vitro experiments and

8/22 endophytes which could provides from 25% to 75% N and 4/8 endophytes solubilized 50% P2O5 for rice plants in pot experiments From

field experiments, two strains (Azospirillum amazonense SHL70 and Burkholderia vietnamiensis PHL87) fixed and provided 50% of biological nitrogen for rice plants and two strains (Pseudomonas putida TAL1 and Bacillus subtilis TAL4) solubilized and provided 50% P2O5 requirement of

rice cultivation The effect of Azospirillum amazonense SHL70 and Bacillus subtilis TAL4 in rice cultivated on soils of two sites (Dong Hoa and Tuy An

districts, Phu Yen province) showed that either SHL70, TAL4 or mixture of SHL70 and TAL4 saved 50% N and 50% P2O5 in rice cultivation but grain yield of inoculated rice seeds as same as control treatment 100% N and 100%

P2O5 without inoculation

Keywords: endophytic bacteria, high-yielding rice, IAA biosynthesis, nitrogen

fixation, phosphate solubilization, Phu Yen

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu “Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên” là

của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được người khác công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Văn Thị Phương Như

MỤC LỤC

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iv

MỤC LỤC vii

DANH SÁCH BẢNG xi

DANH SÁCH HÌNH xiv

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xvi

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

1.5 Những đóng góp mới của luận án 3

1.6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án 3

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Điều kiện tự nhiên và tình hình sản xuất lúa của tỉnh Phú Yên 5

2.1.1 Điều kiện tự nhiên của tỉnh Phú Yên 5

2.1.2 Tình hình sản xuất lúa ở tỉnh Phú Yên 6

2.2 Hiện trạng sử dụng phân bón ở Việt Nam và Phú Yên 7

2.2.1 Hiện trạng sử dụng phân bón hóa học ở Việt Nam, Phú Yên và hiệu suất sử dụng phân bón hóa học 7

2.2.1.1 Ở Việt Nam 7

2.2.1.2 Ở Phú Yên 8

2.2.1.3 Hiệu suất sử dụng phân bón hóa học hiện nay và các nguyên nhân làm tổn thất lượng phân bón 9

2.2.2 Phân bón hữu cơ 11

2.2.3 Phân hữu cơ - vi sinh 12

2.2.4 Phân vi sinh 12

2.2.4.1 Khái niệm phân vi sinh 12

2.2.4.2 Tình hình nghiên cứu phân bón vi sinh ở Việt Nam 12

2.3 Vai trò của phân bón đối với cây lúa 15

2.3.1 Vai trò của phân đạm đối với cây lúa 15

2.3.2 Vai trò của phân lân đối với cây lúa 15

2.3.3 Vai trò của phân kali đối với cây lúa 16

2.4 Tổng quan về vi khuẩn nội sinh 16

2.4.1 Các nhóm vi khuẩn nội sinh thực vật 17

2.4.2 Các nhóm vi khuẩn nội sinh cây lúa 20

2.4.4 Vai trò của vi khuẩn nội sinh 24

2.4.4.1 Khả năng cố định đạm 24

2.4.4.2 Khả năng hòa tan lân khó tan 26

2.4.4.3 Khả năng tổng hợp IAA 28

2.4.4.4 Đối kháng sinh học 29

2.4.5 Những nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn nội sinh thực vật trong sản xuất phân vi sinh 31

2.4.5.1 Phân vi sinh cố định đạm 31

2.4.5.2 Phân vi sinh hòa tan lân khó tan 33

2.4.5.3 Phân vi sinh kích thích, điều hoà sinh trưởng thực vật 35

2.4.5.4 Phân vi sinh đa chức năng 35

CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

3.1 Phương tiện nghiên cứu 37

3.1.1 Vật liệu 37

3.1.2 Dụng cụ 37

3.1.3 Thiết bị 37

3.1.4 Hóa chất và môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn 38

3.2 Phương pháp nghiên cứu 41

3.2.1 Thu mẫu lúa 42

3.2.2 Phân lập vi khuẩn nội sinh cây lúa 43

3.2.3 Khảo sát hình thái khuẩn lạc và đặc điểm tế bào vi khuẩn 44

3.2.4 Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR 45

3.2.5 Khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh cây lúa 46

3.2.6 Tuyển chọn vi khuẩn nội sinh 50

3.2.6.1 Nhận diện và xây dựng mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh 50

3.2.6.2 Đo lượng Acethylen bị khử 51

3.2.6.3 Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh lên cây lúa trồng trong ống nghiệm 53

3.2.6.4 Khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa của các dòng vi khuẩn 55

3.2.6.5 Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng trong nhà lưới 55

3.2.6.6 Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng 59

3.2.6.7 Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi kết hợp 2 dòng vi khuẩn nội sinh lên cây lúa 61

3.3 Xử lý số liệu 63

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64

4.1 Phân lập và đặc điểm sinh học của vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên 64

4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn 64

4.1.2 Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập 66

4.2 Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR 69

4.3 Kết quả khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh cây lúa 69

4.3.1 Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn 70

4.3.2 Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn 72

4.3.3 Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn 74

4.4 Nhận diện và xây dựng mối quan hệ di truyền của 90 dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng tổng hợp NH4+ cao, hòa tan lân và tổng hợp IAA 76

4.5 Kết quả đo hàm lượng Acethylen bị khử và nhận diện gen nifH của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn 90

4.5.1 Kết quả đo hàm lượng Acethylen bị khử của các dòng vi khuẩn 90

4.5.2 Nhận diện gen nifH của 22 dòng vi khuẩn được tuyển chọn 92

4.6 Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng trong ống nghiệm 93

4.6.1 Hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn 93

4.6.2 Hiệu quả hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn 95

4.7 Khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn 98

4.8 Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng trong điều kiện nhà lưới 102

4.8.1 Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng trong điều kiện nhà lưới 102

4.8.2 Ảnh hưởng của 4 dòng vi khuẩn và phân lân hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng trong điều kiện nhà lưới 114

4.9 Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng tại phường Phú Thạnh, Tuy Hòa 121 4.9.1 Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và phân đạm hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng 121

4.9.2 Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng tại phường Phú Thạnh, Tuy Hòa 128 4.10 Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 trên cây lúa trồng ở điều kiện nhà lưới và

4.10.1 Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2

dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 trên cây lúa trồng ở điều kiện nhà lưới 135

4.10.2 Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn trên cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng 139

4.10.2.1 Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn trên cây lúa trồng ở ngoài đồng tại huyện Đông Hòa 139 4.10.2.2 Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 trên cây lúa trồng ở ngoài đồng tại huyện Tuy An……….145

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 153

5.1 Kết luận 153

5.2 Đề xuất 153

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 155

TÀI LIỆU THAM KHẢO 156

PHỤ LỤC 173

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Diện tích, năng suất và sản lượng lúa các huyện, thị xã và thành

phố năm 2014 7

Bảng 2.2 Nhu cầu và khả năng cung ứng phân bón năm 2011 8

Bảng 2.3 Tổng lượng phân bón hóa học trong sản xuất nông nghiệp ở Phú Yên 8

Bảng 2.4 Một số giống vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân vi sinh ở Việt Nam 14

Bảng 2.5 Vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây lúa 20

Bảng 3.1 Công thức môi trường LGI 38

Bảng 3.2 Công thức môi trường Nfb 38

Bảng 3.3 Công thức môi trường Burk không đạm 40

Bảng 3.4 Công thức môi trường NBRIP lỏng 40

Bảng 3.5 Công thức của môi trường dinh dưỡng Yoshida 41

Bảng 3.6 Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR 45

Bảng 3.7 Các giai đoạn của phản ứng PCR 46

Bảng 3.8 Thành phần của dãy đường chuẩn NH4+ 47

Bảng 3.9 Thành phần của dãy đường chuẩn P2O5 48

Bảng 3.10 Thành phần của dãy đường chuẩn IAA 50

Bảng 3.11 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát hiệu quả cố định đạm 54

Bảng 3.12 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát hiệu quả hòa tan lân khó tan 54

Bảng 3.13 Đặc tính đất thí nghiệm trong chậu của tỉnh Phú Yên 56

Bảng 3.14 Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát đạm 56

Bảng 3.15 Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát lân 58

Bảng 3.16 Đặc tính đất thí nghiệm khảo sát đạm trồng lúa ngoài đồng tại phường Phú Thạnh 59

Bảng 3.17 Đặc tính đất thí nghiệm khảo sát lân trồng lúa ngoài đồng tại phường Phú Thạnh 61

Bảng 3.18 Các nghiệm thức trong thí nghiệm tổ hợp 2 dòng vi khuẩn 62

Bảng 3.19 Đặc tính đất thí nghiệm ngoài đồng ở huyện Đông Hòa 62

Bảng 3.20 Đặc tính đất thí nghiệm ngoài đồng ở huyện Tuy An 62

Bảng 4.1 Các dòng vi khuẩn đã được phân lập từ trong cây lúa 65

Bảng 4.2 Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn 66

Bảng 4.3 Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn 68

Bảng 4.4 Hàm lượng NH4+, P2O5 và IAA của 90 dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường LGI, Nfb và RMR 77

Bảng 4.5 Mối tương quan di truyền giữa các dòng vi khuẩn phân lập với các dòng vi khuẩn có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S

rDNA 79

Bảng 4.6 Sự đa dạng của trình tự Nucleotide được phân tích trong phần mềm DNASP 5.10 89

Bảng 4.7 Hàm lượng nitrogenase được tổng hợp của 40 dòng vi khuẩn 90

Bảng 4.8 Hàm lượng nitrogenase được tổng hợp của 22 dòng vi khuẩn bổ sung lên cây lúa 92

Bảng 4.9 Chiều cao cây và trọng lượng khô cây lúa 28 NSKG trong ống nghiệm ở thí nghiệm khảo sát đạm 94

Bảng 4.10 Chiều cao cây và trọng lượng khô cây lúa 28 NSKG trong ống nghiệm ở thí nghiệm khảo sát lân 96

Bảng 4.11 Đặc tính sinh lý sinh hóa của 8 dòng vi khuẩn tiềm năng nội sinh cây lúa 99

Bảng 4.12 Đặc tính của các loài vi khuẩn trong chi Bacillus 100

Bảng 4.13 Đặc tính của các loài vi khuẩn trong chi Azospirillum 101

Bảng 4.14 Đặc điểm của 8 dòng vi khuẩn tiềm năng được tuyển chọn 102

Bảng 4.15 Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa ở giai đoạn 48 NSKG trồng trong chậu 104

Bảng 4.16 Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa lúc thu hoạch (110 NSKG) trồng trong chậu 108

Bảng 4.17 Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên thành phần năng suất của cây lúa lúc thu hoạch (110 NSKG) trồng trong chậu 110

Bảng 4.18 Ảnh hưởng của 4 dòng vi khuẩn và phân lân học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng trong chậu ở giai đoạn 48 NSKG 116

Bảng 4.19 Ảnh hưởng của 4 dòng vi khuẩn và phân lân hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng trong chậu lúc thu hoạch 117

Bảng 4.20 Ảnh hưởng của 4 dòng vi khuẩn và phân lân hóa học lên thành phần năng suất của cây lúa trồng trong chậu lúc thu hoạch (110 NSKG) 119

Bảng 4.21 Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và phân đạm hóa học lên đặc tính sinh trưởng của cây lúa trồng ngoài đồng ở phường Phú Thạnh, Tuy Hòa 122

Bảng 4.22 Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và phân đạm hóa học lên các thành phần năng suất của cây lúa trồng ngoài đồng ở phường Phú Thạnh, Tuy Hòa 124

Bảng 4.23 Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và phân đạm hóa học lên hàm lượng N trong gạo, trong rơm và protein trong gạo………126 Bảng 4.24 Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân hóa học lên đặc tính sinh trưởng của cây lúa trồng ở phường Phú Thạnh, Tuy

Hòa 129

Bảng 4.25 Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân hóa học lên các thành phần năng suất của cây lúa trồng ở phường Phú Thạnh, Tuy Hòa 130 Bảng 4.26 Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân hóa học lên hàm lượng N trong gạo và protein trong gạo 132 Bảng 4.27 Ảnh hưởng của vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân lên hàm lượng P trong rơm và trong gạo 133 Bảng 4.28 Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, lân hóa học lên các chỉ tiêu sinh trưởng của cây lúa trồng ở nhà lưới 136 Bảng 4.29 Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, lân hóa học lên thành phần năng suất của cây lúa trồng ở nhà lưới 137 Bảng 4.30 Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, lân hóa học lên các chỉ tiêu sinh trưởng của cây lúa trồng ngoài đồng tại

huyện Đông Hòa ……… 140 Bảng 4.31 Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, lân hóa học lên các thành phần năng suất của cây lúa trồng ở huyện Đông Hòa 141 Bảng 4.32 Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, phân lân hóa học lên hàm lượng N trong gạo, trong rơm và protein trong gạo 143 Bảng 4.33 Hiệu quả của 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm,

phân lân hóa học lên hàm lượng P trong gạo, trong rơm ……… 144 Bảng 4.34 Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, lân hóa học lên các chỉ tiêu sinh trưởng của lúa trồng ở huyện Tuy An……… 146 Bảng 4.35 Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, lân hóa học lên các thành phần năng suất của cây lúa trồng ở huyện

Tuy An………147 Bảng 4.36 Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân

đạm, phân lân hóa học lên hàm lượng N trong gạo, trong rơm và protein trong gạo………149 Bảng 4.37 Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, phân lân hóa học lên hàm lượng P trong gạo, trong rơm……… 150

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Các huyện ở tỉnh Phú Yên 5

Hình 2.2 Cơ chế xâm nhiễm vi khuẩn nội sinh thực vật 17

Hình 2.3 Vi khuẩn Herbaspirillum xâm nhập vào cây lúa 23

Hình 2.4 Cấu trúc enzyme Nitrogenase 25

Hình 2.5 Sơ đồ biểu diễn cơ chế cố định N2 25

Hình 2.6 Sơ đồ biểu diễn cơ chế cố định đạm sinh học 26

Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt các nội dung thí nghiệm 42

Hình 3.2 Sơ đồ các bước khử mẫu 43

Hình 3.3 Phản ứng màu của các ống nghiệm xây đường chuẩn và mẫu đo NH4+ với thuốc thử 47

Hình 3.4 Phản ứng màu của các ống nghiệm xây đường chuẩn và mẫu đo P2O5 49

Hình 3.5 Phản ứng màu của các ống nghiệm xây đường chuẩn và mẫu đo IAA 50

Hình 4.1 Vòng pellicle xuất hiện trên các môi trường nuôi cấy 66

Hình 4.2 Hình dạng khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập môi trường LGI, Nfb và RMR 67

Hình 4.3 Hình tế bào vi khuẩn chụp dưới kính hiển vi điện tử (SEM) độ phóng đại 14.000 lần 68

Hình 4.4 Nhuộm gram tế bào vi khuẩn độ phóng đại 400 lần 68

Hình 4.5 Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng vi khuẩn phân lập với 2 mồi p515FPL và p13B 69

Hình 4.6 Khuẩn lạc dòng vi khuẩn TAL4 sau 2 ngày cấy trên môi trường Burk không đạm 70

Hình 4.7 Sự biến thiên hàm lượng NH4+ của 533 dòng vi khuẩn theo thời gian 71

Hình 4.8 Sự biến thiên hàm lượng P2O5 của 457 dòng vi khuẩn theo thời gian 74

Hình 4.9 Sự biến thiên hàm lượng IAA của 457 dòng vi khuẩn theo thời gian 75

Hình 4.10 Đa dạng về loài của 90 dòng vi khuẩn nội sinh 81

Hình 4.11.A Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn thuộc nhóm Bacilli có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA……….83

Hình 4.11.B Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn thuộc nhóm Betaproteobacteria có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA……….84 Hình 4.11.C Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với

các dòng vi khuẩn thuộc chi Enterobacter có trong ngân hàng gen (NCBI)

dựa vào trình tự 16S rDNA……… 85 Hình 4.11.D Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh

với các dòng vi khuẩn thuộc chi Pantoea và Pseudomonas có trong ngân

hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA 86 Hình 4.11.E Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh

với các dòng vi khuẩn thuộc chi Acinetobacter, Stenotrophomonas, Aeromonas, Erwinia và Klebsiella có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa

vào trình tự 16S rDNA 87 Hình 4.11.F Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn thuộc nhóm Bacteroides có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA 88 Hình 4.12 Mối tương quan giữa hàm lượng NH4+ (mg/l) và hoạt tính

Nitrogenase trong dung dịch Burk (µmol)……… 91 Hình 4.13 Kết quả điện di sản phẩm PCR của 22 dòng vi khuẩn nội sinh trên gel agarose……… 93 Hình 4.14 Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn ảnh hưởng lên sự sinh

trưởng của cây lúa 28 NSKG……… 95 Hình 4.15 Hiệu quả hòa tan lân khó tan của vi khuẩn lên sự cây lúa 28

Hình 4.16 Hình vi khuẩn TAL1 dưới kính hiển vi điện tử (SEM)………… 99

Hình 4.17 Hình vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử (SEM) 100 Hình 4.18 Hình vi khuẩn dòng SHL70 dưới kính hiển vi điện tử (SEM) 101 Hình 4.19 Hình vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử (SEM) 102 Hình 4.20 Chiều cao của cây lúa ở các nghiệm thức 0N trong giai đoạn 48 NSKG 106 Hình 4.21 Bông lúa khi thu hoạch 113 Hình 4.22 Kết quả kiểm tra tính đối kháng của 2 dòng vi khuẩn 135

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

16S-rDNA 16S-ribosomal DNA coding gene

ARA Acetylene Reduction Assay

ATP Adenosine triphosphate

Blast N Basic local alignment search tool Nucleotid

FAME Fatty acid methyl ester

FAO Food and Agriculture of Organisation

Gen Nif Nitrogen fixing gene

IAA Indole acetic acid

IFA International Fertilizer industry Association

NCBI National centre for biotechnology information

NSKC Ngày sau khi cấy

NSKG Ngày sau khi gieo

PGPR Plant growth promoting Rhizobacteria

PCR Polymerase chain reaction

PSB Phosphate solubilizing bacteria

RFLP Restriction fragment length polymorphism

SEM Scanning electron microscope

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Nhu cầu lương thực ngày càng tăng là do áp lực của sự gia tăng dân số

và lúa gạo là nguồn lương thực chủ yếu trong khẩu phần dinh dưỡng cho hơn 40% dân số thế giới Trong năm 2014, sản lượng lúa trên thế giới đạt 741 triệu tấn (FAO, 2015) Năng suất cũng như sản lượng lúa tùy thuộc vào khí hậu, loại đất, độ ẩm và nguồn dinh dưỡng Cây lúa cần nhiều chất dinh dưỡng khác nhau, chủ yếu là đạm, lân và kali để tăng trưởng, phát triển tốt và cho năng suất cao Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho cây lúa, nông dân phải

sử dụng một lượng lớn phân bón hóa học, chủ yếu là phân đạm, lân và kali Ở Việt Nam, tổng diện tích đất trồng lúa của cả nước trong năm 2014 khoảng 7,8 triệu ha trong đó diện tích trồng lúa tỉnh Phú Yên đạt được 57.021 ha và cần khoảng 10 triệu tấn phân bón các loại (Cục Trồng trọt, 2014), tuy nhiên hiệu suất sử dụng phân bón chỉ khoảng 35 - 40%, còn lại 60 - 65% lượng phân bón

bị mất đi Trong số lượng phân bón cây trồng không sử dụng được, một phần

bị rửa trôi theo nước mặt rồi chảy vào các ao, hồ, sông suối gây ô nhiễm nguồn nước mặt và gây ảnh hưởng xấu như gây phì hóa nước và tăng nồng độ nitrate trong nước, một phần phân bón trực di xuống sâu, gây ô nhiễm nguồn nước ngầm, một phần bị bay hơi do tác động của nhiệt độ hay quá trình phản nitrate hóa gây ô nhiễm không khí (Nguyễn Đức Khiển, 2002) Nếu lạm dụng việc sử dụng phân hóa học như hiện nay thì không những gây ra lãng phí mà còn tác động và ảnh hưởng xấu đến môi trường sinh thái

Trước sức ép của vấn đề an ninh lương thực, người dân luôn đặt ra mục đích phải thu nhiều sản phẩm Song do ý thức và trình độ canh tác chưa cao nên tình trạng lạm dụng phân bón hóa học đã xảy ra khá phổ biến Kết quả điều tra của Sở Nông Nghiệp và PTNT Phú Yên trong năm 2012 cho thấy, chi phí mà nông dân mua phân bón để sản xuất lúa lên đến 6.000.000 đồng/ha/vụ, chi phí này > 50% tổng chi phí trong sản xuất lúa Điều này đã tác động bất lợi đến chi phí sản xuất, đến môi trường dẫn đến kết quả sản xuất không mang lại hiệu quả kinh tế cao và chưa có nền sản xuất bền vững Để khắc phục những tác động bất lợi này thì việc sử dụng phân bón sinh học trong quá trình sản xuất nói chung và sản xuất lúa nói riêng thật sự rất có ý nghĩa

Ngày nay, các nhà nghiên cứu đã quan tâm nhiều đến những loài vi khuẩn nội sinh và ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong sản xuất phân bón Vi khuẩn nội sinh có vai trò quan trọng đối với cây trồng và được ứng dụng trong

đạm cho cây trồng, hòa tan lân khó tan giúp cho cây trồng hấp thụ tốt chất dinh dưỡng, tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng IAA, tăng hàm lượng các chất khoáng, tăng khả năng kháng bệnh và giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm môi

trường (Siciliano et al., 2001) trong đó các vi khuẩn nội sinh tiêu biểu như Azosprillum, Herbaspirillum, Burkholderia, Pseudomonas, Gluconacetobacter,

Vì vậy, việc nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn nội sinh có ích trong sản xuất phân bón vi sinh phục vụ cho sản xuất nông nghiệp nhằm hạn chế phân bón hóa học, góp phần bảo vệ môi trường và xây dựng một nền nông nghiệp phát triển bền vững Điều này rất có ý nghĩa, rất cần thiết trong sản xuất nông nghiệp và trong việc bảo vệ môi trường Đặc biệt cây lúa cao sản là đối tượng cần được nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh vì đây là loại cây lương thực chính được trồng phổ biến ở tỉnh Phú Yên Hơn nữa, hiện tại ở tỉnh Phú Yên chưa có một công trình nghiên cứu nào về vi khuẩn nội sinh trong cây lúa

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, đề tài: “Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên” đã được thưc hiện

1.2 Mục tiêu

Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng ở tỉnh Phú Yên có đặc tính cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA cao để ứng dụng sản xuất phân bón vi sinh cho cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng ở 7 huyện và thành phố Tuy

Hòa thuộc tỉnh Phú Yên

- Nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được bằng phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử

- Khảo sát các đặc tính cố định đạm, hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được và tuyển chọn những dòng có hoạt tính cao

- Định danh các dòng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính sinh học cao và xây dựng mối tương quan di truyền bằng phương pháp sinh hóa, sinh lý, hình thái

và di truyền

- Tuyển chọn các dòng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính sinh học cao để ứng

dụng vào sản xuất phân bón vi sinh bằng các thí nghiệm in vitro, trong điều

kiện nhà lưới và ngoài đồng

1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

* Đối tượng nghiên cứu: các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa

* Phạm vi nghiên cứu: các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa được phân

lập từ 119 mẫu lúa thu ở 7 huyện và thành phố bao gồm: Huyện Tuy An, Sơn Hòa, Đồng Xuân, Phú Hòa, Tây Hòa, Sông Hinh, Đông Hòa và thành phố Tuy Hòa, tỉnh Phú Yên

1.5 Những đóng góp mới của luận án

- Phân lập được 593 dòng vi khuẩn trong cây lúa trên 3 loại môi trường LGI, Nfb và RMR và xác định được 556 dòng vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR Dùng phương pháp so màu xác định được 533 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, trong số đó có 457 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA

- Định danh 90 dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm cao và xây dựng mối quan hệ di truyền

- Có 22 dòng vi khuẩn được khảo sát vừa có khả năng cung cấp đạm và đồng thời cung cấp lân cho cây lúa cao sản trong giai đoạn mạ Trong số đó,

có 8 dòng vi khuẩn có khả năng cung cấp đạm và 4 dòng vi khuẩn cung cấp lân được khảo sát trong điều kiện nhà lưới và 2 dòng vi khuẩn có khả năng cung cấp đạm, 2 dòng vi khuẩn cung cấp lân hữu hiệu nhất được khảo sát ở điều kiện ngoài đồng

- Kết quả nghiên cứu có 8 dòng vi khuẩn được tuyển chọn và ứng dụng trồng lúa trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng được định danh và mô tả đặc

điểm sinh lý, sinh hóa Dòng TAL1 tương đồng với chủng Pseudomonas

putida (99%), TALa14 tương đồng với chủng Bacillus megaterium (99%),

TAL4 tương đồng với chủng Bacillus subtilis (99%), TANa5 tương đồng với

chủng Bacillus megaterium (99%), SHL70 tương đồng với chủng Azospirillum amazonense (98%), PHL87 tương đồng với chủng Burkholderia kururiensis (99%), PHL103 tương đồng với chủng Burkholderia vietnamiensis (99%) và PHL105 tương đồng với chủng Bacillus megaterium (99%)

1.6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án

* Ý nghĩa khoa học

- Phân lập và nhận diện được các dòng vi khuẩn nội sinh bằng phương pháp sinh học phân tử

- Tuyển chọn được các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao, hòa tan lân khó tan, tổng hợp IAA và định danh, xây dựng mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh

- Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể là tài liệu tham khảo và là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo, cũng như bổ sung giáo trình giảng dạy

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Điều kiện tự nhiên và tình hình sản xuất lúa của tỉnh Phú Yên

2.1.1 Điều kiện tự nhiên của tỉnh Phú Yên

* Vị trí địa lý

Phú Yên là tỉnh ven biển Nam Trung bộ, nằm ở vĩ độ 12°42'36" đến 13°41'28" bắc và kinh độ 108°40'40" đến 109°27'47" đông Phía bắc giáp tỉnh Bình Định, phía nam giáp tỉnh Khánh Hòa, phía tây giáp tỉnh Đăk Lăk, phía đông giáp biển Đông Phú Yên có 9 đơn vị hành chính gồm 7 huyện: Đồng Xuân, Đông Hòa, Sông Hinh, Sơn Hòa, Phú Hòa, Tây hòa, Tuy An, 1 thị xã: Sông Cầu và 1 thành phố: Tuy Hòa

- Mùa mưa: kéo dài từ tháng 9 đến tháng 12 dương lịch, chịu ảnh hưởng của gió Đông Bắc và mưa nhiều

Nhiệt độ trung bình hàng năm là 26,3oC, độ ẩm tương đối trung bình 80 - 85%, được phân bố theo độ cao của địa hình: vùng đồng bằng ven biển có độ

ẩm tương đối là 79 - 80%, vùng núi thấp là 81 - 83% (Trung tâm khí tượng thủy văn tỉnh Phú Yên, 2013)

* Tài nguyên đất

Đất của Phú Yên được hình thành và phát triển trong sự tác động qua lại của sinh quyển nhiệt đới và sự phong phú, phức tạp của cấu trúc địa chất Tổng diện tích đất tự nhiên của Phú Yên 504.531 ha, đất dành cho sản xuất nông nghiệp 124.815 ha Diện tích gieo trồng cây hàng năm 94.132 ha, trong

đó diện tích trồng lúa 57.021 ha Đất Phú Yên chia làm 8 nhóm (Sở Khoa Học Công Nghệ và Môi Trường Phú Yên, 2010):

- Đất phù sa: chiếm 9,8%, phân bố chủ yếu vùng hạ lưu sông, tập trung chủ yếu hạ lưu sông Ba Đất thích hợp để trồng cây lương thực, nhất là lúa

- Đất cát ven biển: chiếm 2,6% diện tích, phân bố dọc theo bờ biển Đất này có thể khai thác để trồng dừa, điều, …

- Đất phèn mặn: chiếm 1,4% diện tích, phân bố ở khu vực đồng bằng thấp ven biển

- Đất xám (6,9%), đất đen ( 3,5%), đất nâu vàng, nâu đỏ trên đá Bazan (65%) Ba loại đất này thích hợp cho việc trồng cây ăn quả, cây công nghiệp,

+ Lịch thời vụ

Lúa được trồng 2 vụ chính: đông xuân và hè thu

- Vụ đông xuân: gieo tháng 12 và thu hoạch khoảng cuối tháng 3

- Vụ hè thu: gieo tháng 6 và thu hoạch vào khoảng tháng 9

Ngoài 2 vụ chính, một số vùng trong tỉnh còn trồng lúa nương (lúa mùa)

Vụ lúa mùa vào tháng 10 hàng năm

+ Cơ cấu giống:

Sử dụng phổ biến các giống lúa: ML213, ML68, ML216, ML4-2, ML48, PY2…

+ Năng suất lúa

Năng suất bình quân đạt khoảng 6,5 tấn/ha, sản lượng đạt 365.325 tấn/năm, trong đó vụ đông xuân năng suất đạt được 7,0 tấn/ha, sản lượng đạt 188.641 tấn, vụ hè thu năng suất 6,5 tấn/ha, sản lượng đạt 157.748 tấn và vụ mùa (trồng lúa nương) năng suất ước tính 3,3 tấn/ha, sản lượng đạt 18.936 tấn/ha Như vậy, với sản lượng lương thực ổn định gần 370.000 tấn/năm, đảm bảo lương thực cho hơn 860.000 người Một số địa phương có năng suất lúa khá cao như: Thành phố Tuy Hòa (8,2 tấn/ha), huyện Phú Hòa (7,6 tấn/ha), Đông Hòa (7,4 tấn/ha), huyện Tây Hòa đạt (7,2 tấn/ha) trong vụ Đông Xuân

2013 - 2014 (Sở Nông nghiệp Phú Yên, 2014)

Bảng 2.1 Diện tích, năng suất và sản lượng lúa các huyện, thị xã và thành phố năm

2014

Diện tích Năng suất Sản lượng Diện tích Năng suất Sản lượng

Nguồn: Sở nông nghiệp và PTNT Phú Yên (2014)

2.2 Hiện trạng sử dụng phân bón ở Việt Nam và Phú Yên

2.2.1 Hiện trạng sử dụng phân bón hóa học ở Việt Nam, Phú Yên và hiệu suất sử dụng phân bón hóa học

2.2.1.1 Ở Việt Nam

Nhu cầu phân bón hàng năm của Việt Nam khoảng 7,5 - 8 triệu tấn phân bón các loại trong đó loại phân NPK có nhu cầu cao nhất khoảng 2,5 triệu tấn/năm, kế đến là phân urea (2 triệu tấn/năm), phân lân (1,3 triệu tấn/năm) Nhu cầu từng loại phân bón: phân urea chiếm 25%, phân SA 7%, phân kali 9%, phân DAP 9%, phân lân 17%, phân NPK 33% (Báo cáo nông sản Việt

Nam, 2008) trong đó năm 2012 cả nước cần khoảng 9,88 triệu tấn phân bón các loại:

Bảng 2.2 Nhu cầu và khả năng cung ứng phân bón năm 2011 (Đơn vị: Triệu tấn)

850 ngàn tấn SA, 950 ngàn tấn kali, 900 ngàn tấn DAP, 3,8 triệu tấn NPK và 1,8 triệu tấn lân Tuy nhiên, hiện nay sản xuất công nghiệp phân bón trong nước mới đáp ứng 77,6%, vẫn phải nhập khẩu 2,47 triệu tấn phân bón các loại (Cục Trồng trọt, 2014)

Bảng 2.3 Tổng lượng phân bón hóa học trong sản xuất nông nghiệp ở Phú Yên

Năm Tổng lượng phân bón (ĐVT: tấn)

Khối lượng, tỷ lệ phân bón đã sử dụng trên 1 ha đất canh tác là 560 kg/ha Tổng diện tích đất tự nhiên của Phú Yên 504.531 ha, diện tích đất dành cho sản xuất nông nghiệp là 124.815 ha Diện tích gieo trồng cây hàng năm 94.132 ha trong đó diện tích trồng lúa 57.021 ha

Đất trồng lúa ở tỉnh Phú Yên có độ phì không cao, vì vậy trong quá trình trồng lúa nông dân đã sử dụng một lượng lớn phân bón hóa học các loại như phân đạm dạng urea, phân lân và kali Lượng phân bón cho lúa tính cho 1 ha trong 1 vụ gồm 120 kg N, 80 kg P2O5 và 60 kg K2O Trong năm 2011 đã sử dụng 45.710 tấn, bao gồm 17.000 tấn phân đạm, 22.168 tấn phân lân và 6.542 tấn phân kali (Sở Nông nghiệp và PTNT Phú Yên, 2012)

2.2.1.3 Hiệu suất sử dụng phân bón hóa học hiện nay và các nguyên nhân làm tổn thất lượng phân bón

* Hiệu suất sử dụng phân bón hóa học

Tốc độ sản xuất và tiêu thụ phân bón của thế giới và Việt Nam không ngừng tăng lên Bất cứ một loại phân bón nào cũng không thể được thực vật hấp thụ toàn bộ, hệ số sử dụng phân bón của cây trồng ở mức thấp Hiệu suất hấp thụ phân bón tùy theo loại đất, giống cây trồng, thời vụ, phương pháp bón, loại phân bón,

Theo Nguyễn Đức Khiển (2002), cây trồng chỉ sử dụng 35 - 40% lượng phân đạm bón vào đất, lượng đạm còn lại bị mất đi do nhiều nguyên nhân khác nhau Ở Việt Nam hiệu suất sử dụng phân bón chỉ khoảng 35 - 40%, còn lại 60 - 65% lượng phân bón bị mất đi Nhu cầu sử dụng phân bón Việt Nam năm 2010 là 8,9 triệu tấn, như vậy lượng mất đi khoảng 5,3 - 5,7 triệu tấn (Hoàng Văn Tại, 2011) Chỉ có 30 - 45% lượng phân đạm, 40 - 50% phân kali

và không quá 30% lượng phân lân được cây trồng hấp thụ, phần còn lại bị tổn thất do nhiều nguyên nhân Ở Việt Nam, chỉ tính riêng phân đạm, khi nhu cầu

sử dụng là 3,3 triệu tấn urea/năm thì tổn thất hàng năm đã lên tới khoảng 1,5 triệu tấn Lượng phân bón dư thừa sẽ gây ô nhiễm môi trường (Nguyễn Đức Khiển, 2002).

* Các quá trình và nguyên nhân gây tổn thất lượng phân bón hóa học + Quá trình hòa tan

Tất cả các dạng phân hóa học sau khi bón vào đất đều phải trải qua các quá trình phân giải phức tạp, đầu tiên là quá trình hòa tan và khuếch tán Tốc

độ hòa tan phụ thuộc vào độ tan của phân bón, độ pH, nhiệt độ môi trường và một số yếu tố quan trọng khác, trong đó độ tan là yếu tố ảnh hưởng nhất Quá trình hòa tan của phân bón là quá trình cần thiết để cây trồng có thể

năng hấp thụ của bộ rễ không phải là không giới hạn, phần dinh dưỡng chưa được hấp thụ ngay tồn tại trong dung dịch rất dễ bị rửa trôi theo nước tưới, nước mưa và các hình thức thẩm lậu khác nhau Đây là nguyên nhân cơ bản gây tổn thất phân bón trong quá trình sử dụng (De Datta, 1987)

+ Quá trình thủy phân

Trong quá trình thủy phân, do tác động của hệ vi sinh vật đất, đặc biệt là các vi khuẩn sản sinh enzyme urease, urea được chuyển hóa dần sang dạng muối ammoni

+ Quá trình nitrate hóa

Quá trình nitrate hóa (nitrification) xảy ra thông qua hai giai đoạn liên

tục Đầu tiên, vi khuẩn Nitrosomonas chuyển đạm ở dạng amoni sang dạng nitrite Sau đó vi khuẩn Nitrobacter chuyển nitrite sang dạng nitrate

Quá trình nitrate hóa xảy ra dưới tác động của hệ vi sinh vật nên chịu ảnh hưởng rõ rệt của yếu tố nhiệt độ Khi nhiệt độ đất > 10°C, độ pH của đất

> 5 thì quá trình nitrate hoá xảy ra rất nhanh, ở nhiệt độ 30°C thì sau 15 ngày

có trên 90% lượng đạm ở dạng ammoni bị chuyển hoá sang dạng nitrite

Anion NO3- mang điện tích cùng dấu với điện tích của hạt keo đất nên chúng đẩy nhau, vì vậy nitrate rất dễ bị rửa trôi Đây là nguyên nhân chính gây tổn thất đạm thông qua quá trình nitrate hóa

+ Quá trình khử nitrate

Quá trình khử nitrate (denitrification) là quá trình không thuận nghịch, xảy ra dưới tác dụng của các vi khuẩn khử nitơ theo xu hướng chuyển hóa, phân giải nitrate thành các hợp chất của nitrogen ở dạng khí, thoát vào khí quyển

NO3- NO2-

urease

Như vậy, quá trình khử nitrate cũng là một nguyên nhân gây nên hiện tượng tổn thất đạm và làm giảm hiệu suất sử dụng phân đạm trong nông nghiệp (De Datta, 1987)

* Quá trình cố định lân liên quan đến thành phần cơ lý của đất

Tính chất và thành phần cơ lý của đất có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất

sử dụng phân bón và năng suất cây trồng Khi nhiệt độ môi trường hoặc điều kiện canh tác thay đổi, hàm lượng các ion H+, Al3+ và Fe2+ thay đổi theo làm tăng nhanh hàm lượng sắt, nhôm di động trong đất, hiện tượng này gọi là đất

bị chua hóa hoặc đất bị nhiễm phèn Khi đó các ion Al3+ và Fe2+ sẽ khuếch tán

và kết tủa lên bề mặt bộ rễ của cây trồng, làm cho rễ mất khả năng hô hấp và hấp thụ chất dinh dưỡng Đất giàu sắt và nhôm di động sẽ làm giảm hiệu quả

sử dụng của phân lân do hiện tượng cố định lân trong đất Lân dễ tan bị chuyển hóa thành lân khó tan, được giữ lại trong hệ keo đất dưới dạng không hữu hiệu nên cây trồng không thể hấp thụ được

Quá trình cố định lân gây ra bởi các tác nhân hydroxid sắt, nhôm ngậm nước Các khoáng sét trong đất với cấu trúc kaolinit có năng lực cố định lân cao hơn nhiều so với các khoáng sét có cấu trúc kiểu hydromicat, vetmiculic, thông qua các hydroxid trên bề mặt

X-OH + H3PO4 XH2PO4 + OH

-(X là Al3+ và Fe2+)

Khi pH giảm, kaolinit trở nên trội điện tích dương và sự hấp phụ lân tăng đột ngột, nhất là ở giai đoạn khi pH từ 5 chuyển xuống 4 và thấp hơn, vì độ hoà tan của Al tăng nhanh Lân bị hấp phụ trên bề mặt các oxid hydrat hoá của

Fe và Al tinh thể hoặc vô định hình, về bản chất là những keo dương trao đổi

OH- với anion PO43- Năng lực cố định lân phụ thuộc bản chất của đất, khó có thể cải tạo căn bản mà chỉ có thể điều khiển cục bộ trong phạm vi hệ rễ và cải thiện môi trường đất (Sanyal và De Datta, 1991)

Khác với lân, kali là nguyên tố có năng lực trao đổi ion mạnh nên khả năng chuyển hoá K2O ở dạng tổng số sang dạng trao đổi khá dễ dàng Việc thất thoát phân kali trong đất xảy ra do rửa trôi và làm hàm lượng kali trong đất giảm nhanh.

2.2.2 Phân bón hữu cơ

Theo Vũ Ngọc Nông (1999), phân hữu cơ là các loại chất hữu cơ đã phân hủy và có khả năng cung cấp chất dinh dưỡng cho cây Phân hữu cơ là tên gọi chung của các loại phân được sản xuất từ các vật liệu hữu cơ như xác bã thực vật, phân chuồng, phân xanh, các chế phẩm nông nghiệp và công nghiệp

Theo Bùi Huy Hiền (2013), phân hữu cơ được chia thành 2 nhóm là phân hữu cơ truyền thống và phân hữu cơ công nghiệp

Phân hữu cơ truyền thống là loại phân có nguồn gốc từ các chất thải của người, động vật hoặc từ các phế phẩm trong trồng trọt, chăn nuôi, chế biến nông lâm, thủy sản, rác thải hữu cơ, các loại than bùn được chế biến theo phương pháp ủ truyền thống Phân hữu cơ truyền thống có thể chia làm 4 loại: phân chuồng, phân xanh, phân than bùn và phân rác

Phân hữu cơ công nghiệp được chế biến từ các nguồn hữu cơ khác nhau

để tạo thành phân bón tốt hơn so với nguyên liệu thô ban đầu Có thể chia làm

5 loại: phân hữu cơ, phân hữu cơ khoáng, phân hữu cơ sinh học, phân vi sinh

và phân hữu cơ vi sinh Hiện nay, phân hữu cơ công nghiệp là dạng phân bón

ít ảnh hưởng đến môi trường Tuy nhiên, do sự phát triển của phân bón hóa học với tiện dụng của nó mà việc sử phân hữu cơ này ngày càng ít đi, đặc biệt trong canh tác lúa (Bùi Huy Hiền, 2013)

2.2.3 Phân hữu cơ - vi sinh

Phân hữu cơ - vi sinh là sản phẩm được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu hữu cơ khác nhau nhằm cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng, cải tạo đất, chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống được tuyển chọn như vi sinh vật cố định đạm, vi sinh vật phân giải lân, vi sinh vật kích thích sự sinh trưởng cây trồng, vi sinh vật đối kháng, với mật số lớn hơn 106 tế bào/g Phân vi sinh góp phần nâng cao năng suất, chất lượng nông sản và không ảnh hưởng xấu đến người, động thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản (TCVN 6169: 1996)

2.2.4 Phân vi sinh

2.2.4.1 Khái niệm phân vi sinh

Theo TCVN 6169:1996, phân vi sinh là sản phẩm chứa một hay nhiều dòng vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn có mật số đạt 106 tế bào/g Thông qua quá trình hoạt động của chúng, sau khi bón vào đất tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng sử dụng được (N, P, K) góp phần nâng cao năng suất và chất lượng nông sản Phân vi sinh đảm bảo không gây ảnh hưởng xấu đến người, động thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản

2.2.4.2 Tình hình nghiên cứu phân bón vi sinh ở Việt Nam

Ở Việt Nam, phân vi sinh cố định đạm ở cây họ đậu và phân vi sinh phân

giải lân đã được nghiên cứu từ 1960 Đến năm 1987, phân Nitragin trên chất mang than bùn được hoàn thiện Ngày nay các nhà khoa học đã tập trung

nhiều vào việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật dùng trong sản xuất phân vi

sinh

Phân bón vi sinh được chia làm nhiều dạng khác nhau tùy công nghệ sản xuất, tính năng, trạng thái vật lý và tác dụng của vi sinh vật có trong phân bón + Tuỳ công nghệ sản xuất, người ta có thể chia phân vi sinh thành hai loại:

- Phân vi sinh trên nền chất mang khử trùng

- Phân vi sinh trên nền chất mang không khử trùng

+ Dựa vào đặc tính tác dụng của vi sinh vật sử dụng bao gồm các loại:

- Phân vi sinh chức năng: là sản phẩm không chỉ có chứa các vi sinh vật làm phân bón như cố định đạm, hòa tan lân khó tan, kích thích sinh trưởng thực vật mà còn có các loại vi sinh vật có khả năng ức chế, tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh cây trồng (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2001)

+ Dựa theo trạng thái vật lý của phân bón:

Căn cứ vào trạng thái vật lý của phân bón, có thể chia phân bón vi sinh thành các loại sau:

- Phân vi sinh dạng bột

- Phân vi sinh dạng lỏng

- Phân vi sinh dạng viên được tạo thành khi sinh khối vi sinh vật được phối trộn và xử lý cùng chất mang tạo thành các hạt phân bón có chứa các vi sinh vật sống đã được tuyển chọn (Nguyễn Minh Hưng, 2007)

Hiện nay ở Việt Nam có hơn 10.000 chủng vi sinh vật được bảo tồn và lưu trữ ở các nơi như: Bảo tàng giống vi sinh vật VTCC, Viện Công nghiệp thực phẩm Hà Nội, Viện Bảo vệ thực vật, Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, Các chủng vi sinh vật và hoạt tính sinh học chính được sử dụng trong sản xuất phân bón nông nghiệp:

- Vi sinh vật cố định đạm: Rhizobium (R leguminosarum), Bradyrhizobium (B japonicum), Frankia (F alni), Azotobacter (A chroococcum, A vinelendii), Azospirillum (A lipoferum)

- Vi sinh vật hòa tan lân khó tan: các chủng được dùng trong thương mại

như Bacillus megaterium, B circulans, B Subtilis, …

- Vi sinh vật ức chế vi sinh vật gây bệnh: các chủng trong thương mại

như Bacillus licheniformis, Bacillus polyfermenticus, …

- Vi sinh vật sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật: các chủng được

dùng trong thương mại như Pseudomonas fluorescens, Azotobacter chroococcum, ….

Bảng 2.4 Một số giống vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân vi sinh ở Việt Nam (Nguyễn Minh Hưng, 2007)

trong sản xuất

Các vi sinh vật sử dụng trong phân sinh học có khả năng cố định đạm, hòa tan kali và lân khó tan hoặc kích thích sự phát triển thực vật Hầu hết các

vi sinh vật sử dụng để sản xuất phân vi sinh có liên quan chặt chẽ với rễ cây, vùng đất xung quanh rễ hoặc ở trong thân và lá của cây trồng

Phân bón vi sinh ở Việt Nam, mặc dù được nghiên cứu từ lâu Song do tác động của nhiều yếu tố nên mức độ ứng dụng hiện nay còn hạn chế

2.3 Vai trò của phân bón đối với cây lúa

2.3.1 Vai trò của đạm đối với cây lúa

Đạm là chất dinh dưỡng rất quan trọng đối với cây lúa, theo thống kê trên thế giới có khoảng 67% tổng lượng phân bón dùng cho cây lúa (Vlek và Byrnes, 1986) Khả năng hấp thu đạm của cây lúa dựa vào giai đoạn phát triển, tùy lượng đạm trong đất và phân bón Phân đạm được cây hấp thụ chủ yếu ở giai đoạn bắt đầu sự phát triển, đất sau khi bón đạm bị mất đi hoặc tồn

lưu (Bufogle et al., 1997) Mối liên quan giữa đạm hấp thu và tổng lượng đạm cần thiết cho giai đoạn phát triển tùy vào lượng đạm cung cấp (Guindo et al., 1994) và tổng lượng phân bón đạm có sẵn (Bufogle et al., 1997)

Cây lúa cần nhiều đạm vào giai đoạn đầu của chu kỳ sinh trưởng, nhất là trong thời kỳ đâm chồi (De Datta, 1970) Đạm là chất tạo dạng cây lúa, là thành phần chủ yếu của protein và chất diệp lục làm lá xanh tốt, tăng chiều cao cây, số chồi và kích thước lá Do đó, dựa vào màu sắc và kích thước lá, chiều cao và khả năng nở bụi của cây lúa, người ta có thể chẩn đoán tình trạng dinh dưỡng đạm trong cây Đạm quyết định năng suất lúa và tăng kích thước hạt Đạm giúp hô hấp của rễ do tác dụng ngăn cản ảnh hưởng độc của H2S có nhiều trong đất ngập nước (Gomez, 1971)

Ở giai đoạn sinh trưởng ban đầu, đạm tích lũy chủ yếu trong thân lá, khi lúa trổ, khoảng 48 - 71% đạm được đưa lên bông Trong cây, đạm dễ dàng được chuyển vị từ lá già sang lá non, từ mô trưởng thành sang mô non nên triệu chứng thiếu đạm thường xảy ra trước tiên ở lá già rồi lan dần đến các lá bên trên Thiếu đạm, cây lúa lùn hẳn lại, nở bụi ít, chồi nhỏ, lá ngắn hẹp, trở nên vàng và rụi sớm, cây lúa còi cọc không phát triển Ở giai đoạn sinh sản, đạm có vai trò trong việc tạo mầm hoa, giúp tăng số hạt trên gié, số gié trên bông và số chồi hữu hiệu Nếu thiếu đạm, cây lúa sẽ cho bông ngắn, ít hạt, hạt nhỏ và nhiều hạt bị lép (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008)

2.3.2 Vai trò của lân đối với cây lúa

Lân là một trong những chất dinh dưỡng đa lượng thiết yếu nhất cần cho

sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng Lân là chất tạo năng lượng, là thành phần của ATP, NADP và các nucleotide Các nucleotide này đóng vai trò quan trọng trong các quá trình cố định, dự trữ và vận chuyển năng lượng, đồng thời chúng tham gia trong các quá trình sinh tổng hợp polysaccaride, lipid, protein

và acid nucleic Thúc đẩy việc sử dụng và tổng hợp chất đạm trong cây, kích thích rễ phát triển Lân giúp cây lúa nhanh phục hồi sau khi cấy, nở bụi mạnh, kết nhiều hạt chắc, tăng phẩm chất gạo, giúp lúa chín sớm Lân thường tập trung nhiều trong hạt Cây lúa cần lân nhất là trong giai đoạn đầu, nên cần bón

bông Lân có vai trò quan trọng nên khi thiếu lân cây có những biểu hiện về hình thái bên ngoài, năng suất và chất lượng thu hoạch Thiếu lân, cây lúa lùn hẳn, nở bụi kém, lá rất thẳng hẹp và màu sậm hơn bình thường hoặc ngả sang màu tím bầm, lúa sẽ trổ và chín muộn, hạt không no đầy và phẩm chất giảm (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008) Theo De Datta (1970), tác dụng của lân ngoài việc tăng năng suất lúa, còn kích thích sự phát triển của hệ thống rễ, giúp cây kháng hạn, trổ và chín sớm, đồng thời kích thích sự đâm chồi và tăng phẩm chất hạt gạo, tăng lượng lân chứa trong hạt

2.3.3 Vai trò của kali đối với cây lúa

Kali là nguyên tố đa lượng cần thiết cho thực vật Kali tham gia nhiều quá trình sinh lý, sinh hóa quan trọng của cây Kali hoạt hóa ít nhất 60 loại enzyme khác nhau cần thiết cho sự sinh trưởng của cây, giúp cho quá trình vận chuyển và tổng hợp các chất trong cây, duy trì sức trương của tế bào, tăng cường quá trình quang hợp ở cây, giúp cây cứng cáp, tăng khả năng chống sâu bệnh, chống ngã đổ, chịu hạn và lạnh khỏe hơn, Vì vậy kali rất cần thiết cho

sự sinh trưởng, phát triển cũng như năng suất và phẩm chất của cây trồng Kali tăng số hạt chắc trên bông và làm hạt no đầy hơn Kali tập trung chủ yếu trong rơm rạ, chỉ khoảng 6 - 20% ở trên bông (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008), (De Datta, 1970)

2.4 Tổng quan về vi khuẩn nội sinh

Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn trải qua phần lớn vòng đời sống bên trong cây trồng (Quispel, 1992) Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật Vùng rễ là nơi tiếp giáp giữa rễ thực vật và đất, nơi lắng đọng các chất hữu cơ

và là nơi xuất phát của các môi trường sống và các nguồn sống khác nhau cho các vi sinh vật đất Thực vật có thể thay đổi vùng rễ của chúng nhờ sự hấp thu các chất dinh dưỡng, độ ẩm, oxy từ vùng rễ và các chất do rễ tiết ra Đặc tính quan trọng của các dịch rễ là có tỉ lệ C/N cao nên có thể đẩy mạnh sự phong phú của các vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ (Döbereiner, 1974) Ngược lại, vi sinh vật vùng rễ có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của cây do

sự tác động của chúng đến giá trị của các chất dinh dưỡng, sự phát triển và

hình thái của rễ (Harari et al., 1988)

Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các vi khuẩn nội sinh có thể tập trung tại

vị trí xâm nhập hay di chuyển khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong,

vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al., 2002)

Mật số của quần thể vi khuẩn nội sinh rất biến động, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ, nhưng cũng phụ thuộc vào giai

đoạn phát triển của cây chủ và các điều kiện môi trường (Pillay và Nowak,

(Benhamou et al., 1996) và kích thích cây trồng chống chịu với nhân tố vô sinh và hữu sinh (Hallmann et al., 1997)

2.4.1 Các nhóm vi khuẩn nội sinh thực vật

* Vi khuẩn Azospirillum

Vi khuẩn Azospirillum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, có khả năng

chuyển động và có dạng hình que ngắn, kích thước biến động trong khoảng

0,8 - 1,7 μm chiều rộng và 1,4 - 3,7 μm chiều dài Các loài Azospirillum phân

bố rộng và gắn liền với sự đa dạng của cây trồng (Seshadri et al., 2000)

Trong những năm 1984 - 1985, người ta đã phát hiện nhiều loài của chi

Azospirillum trong vùng rễ của cỏ Kallar (Leptochloa fusca) (Reinhold et al.,

1986), trong đó các vi khuẩn xâm nhập vào nhu mô rễ có khả năng cố định

đạm, hòa tan lân ở dạng khó tan và các chất dinh dưỡng khác (Seshadri et al., 2000), sản xuất chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Vande et al., 1999), hay kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng (Rangaraijan et al., 2003)

Okon và Labandera-Gonzalez (1994) thử nghiệm ngoài đồng các cây trồng

được bổ sung với Azospirillum đã nhận thấy sản lượng cây trồng tăng 5 - 30%,

Mô gỗ

Mô libe Nội bì

Vi khuẩn nội sinh

phát triển tốt hơn, tương quan với việc tăng tỉ lệ nước và khoáng được rễ hấp thu

* Vi khuẩn Azotobacter

Döbereiner (1974) phân lập được loài Azotobacter paspali từ các cây cỏ đang sinh trưởng trước phòng thí nghiệm của bà Sự khám phá ra vi khuẩn A paspali là một bước quan trọng trong sự cố định đạm cộng sinh Đây là loài đặc hiệu cho cỏ Paspalum notatum và khoai lang

* Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus

Vào năm 1988, Cavalcante và Döbereiner đã phân lập được G diazotrophicus từ rễ, thân và lá mía trồng ở Brazil, chúng hiện diện trong các

khoảng trống gian bào của tế bào nhu mô và được xem là vi khuẩn nội sinh bắt

buộc Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus thuộc họ Acetobacteraceae

là những vi khuẩn Gram âm, vi hiếu khí bắt buộc, tế bào hình que và không có

nội bào tử (Muthukumarasamy et al., 2002) Vi khuẩn này có ở nhiều loại cây

hòa bản khác nhau như bắp, lúa hoang, cỏ voi, khóm, cà rốt, củ cải đường, cải bắp và cây cà phê với các đặc tính ưu việt như có khả năng cố định đạm, tổng

hợp cả IAA, gibberellin và hòa tan lân khó tan (Muthukumarasamy et al., 2002; Madhaiyan et al., 2004)

* Vi khuẩn Herbaspirillum

Vi khuẩn Herbaspirillum thuộc nhóm β - Proteobacteria là vi khuẩn vi

hiếu khí, vi khuẩn cố định đạm sống trong rễ của nhiều cây không phải là họ đậu, bao gồm các loại cây họ hòa bản có giá trị kinh tế Hai loài

Herbaspirillum seropedicae và Herbaspirillum rubrisubalbicans đã được tìm thấy ở cây bắp, mía đường, lúa hoang và lúa trồng (Baldani et al., 1986) Vi

khuẩn này cũng được tìm thấy ở cỏ chăn nuôi và các cây trồng nhiệt đới như

khóm, chuối (Cruz et al., 2001) Trong vùng rễ, chúng có khả năng cố định đạm mạnh mẽ (Baldani et al., 1986), ngoài ra chúng còn di chuyển đến cả những vùng ở thân và lá (Barraquio et al., 1997) Các nhà khoa học Nhật Bản (Elbeltagy et al., 2001) nghiên cứu quần lạc ở rễ lúa trồng của Herbaspirillum

sp B501 được phân lập từ lúa hoang bằng cách đưa gen gfp (mã hóa protein

GFP tạo chất huỳnh quang xanh) với gen nhảy pUTgftx2 vào vi khuẩn và vi khuẩn này được bổ sung vào các hạt lúa hoang Kết quả nhận thấy

Herbaspirillum sp dòng B501gfp1 tập trung một phần trong các bao lá mầm,

lá, hạt và rễ lúa, chúng cư trú trong các khoảng trống gian bào ở các lá non thứ

3 trước khi lá nở rộng của các cây lúa hoang có hạt được bổ sung vi khuẩn Đáng chú ý vi khuẩn này còn xâm nhập cả vào các mô non của lá thứ 4

* Vi khuẩn Klebsiella

Vi khuẩn Klebsiella thuộc nhóm γ - Proteobacteria (Gram âm), có dạng

hình que, không hay ít chuyển động, kết nang, sống kỵ khí không bắt buộc Có

2 loài quan trọng là Klebsiella pneumoniae và K oxytoca Vi khuẩn Klebsiella

thường xuất hiện tự nhiên trong đất, một số xâm nhập vào cây trồng và sống nội sinh trong cây Có khoảng 30% các dòng của 2 loài này có thể cố định

đạm trong các điều kiện kỵ khí (Iniguez et al., 2004) Sau đó, các nhà nghiên cứu sử dụng vi khuẩn K oxytoca dòng GR-3 bổ sung cho giống lúa

Malviyadhan-36 thì nhận thấy vi khuẩn này giúp gia tăng toàn bộ chiều dài cây và tăng hàm lượng chlorophyll-a có hiệu quả, đồng thời chúng còn kích thích sự thành lập rễ bên và rễ bất định cho cây

* Vi khuẩn Enterobacter

Vi khuẩn Enterobacter cũng thuộc nhóm γ - Proteobacteria (vi khuẩn

Gram âm), có dạng hình que, sống kỵ khí không bắt buộc Một số loài của vi khuẩn này sống ở vùng rễ hay nội sinh bên trong các mô thực vật có khả năng

cố định đạm, là vi khuẩn kích thích sự sinh trưởng thực vật Hwangbo et al (2003) đã phân lập được loài Enterobacter intermedium từ vùng rễ của một số

cây cỏ ở Nam Triều Tiên, chúng có khả năng hòa tan các dạng lân khó tan để cung cấp cho cây theo cơ chế acid hóa bằng cách sản xuất hợp chất 2- ketogluconic acid

* Vi khuẩn Azoarcus

Bilal et al., (1987) đã phân lập được một số loại vi khuẩn Azoarcus sống trong cỏ Kallar khi người ta phát hiện lúa mì sống trong vùng trước đây có cỏ thì có năng suất cao mà không cần bón nhiều phân hóa học Vi khuẩn này còn được phân lập từ rễ lúa, kích thích sự sinh trưởng của lúa Ở những nơi trong vùng rễ có hàm lượng oxy thấp, vi khuẩn này có khả năng cố định đạm tốt

(Malik et al., 1997)

* Vi khuẩn Pseudomonas

Vi khuẩn Pseudomonas spp phân bố rộng rãi và có nhiều loài, là vi

khuẩn sống tự do, chúng được tìm thấy khắp nơi trong đất, nước, thực vật,

động vật Vi khuẩn Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, hình que, có chiên mao ở cực, không có khả năng tạo nội bào tử Chi Pseudomonas spp có nhiều loài có khả năng cố định đạm như Pseudomonas diminuta, P fluorescens, P paucimobilis, P pseudoflava, P putida, P stutzeri và P vesicularis (Chan et al., 1994) Một số dòng vi khuẩn Pseudomonas có khả năng hòa tan lân như P fluorescens, P putida, P chlororaphis (Canttenlla et al., 1999) Một số loài

thuộc chi Pseudomonas như: P putida, P fluorescens, P syringae có khả

năng tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật như: IAA, cytokinin kích thích sự sinh trưởng của bộ rễ cây và làm tăng khả năng hấp thụ chất dinh

dưỡng trong đất (Glickmann et al., 1998), một số có khả năng kháng lại một

số vi sinh vật gây hại cây trồng Nhiều loài Pseudomonas được tìm thấy nội

sinh trong nhiều loài thực vật như bông vải, đậu nành, cà phê, lúa hoang, lúa

trồng (Koomnok et al., 2007) và khoai lang (Khan và Doty, 2009)

* Vi khuẩn Burkholderia

Vi khuẩn Burkholderia là vi khuẩn Gram âm, dạng que ngắn, chúng có

thể di chuyển nhờ chiên mao ở đầu Chúng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí, trong môi trường ít khí oxy thì phát triển mạnh Vi khuẩn này có khả năng cố định đạm và tạo nốt sần trong những cây

họ đậu vùng nhiệt đới (Mounlin et al., 2001) Vi khuẩn Burkholderia sống

cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định đạm, kích thích sự sinh trưởng của cây trồng, hiện diện vùng rễ và rễ của nhiều loài cây như: bắp, mía, cà phê

(Scarpella et al., 2003)

Trong số 40 loài thuộc chi Burkholderia, có nhiều loài có khả năng cố định đạm như: Burkholderia vietnamiensis, B brasilensis, B kururiensis, B tuberum, B phymatum, B unamae, B tropicalis và B terrae (Goris et al., 2004) Vi khuẩn B tropicalis được tìm thấy trong cây khóm (Trần Thanh Phong và Cao Ngọc Điệp, 2012) Loài B vietnamiensis tìm thấy trong rễ lúa trồng ở miền Nam Việt Nam Thí nghiệm ở lúa cho thấy loài B vietnamiensis

sau 14 ngày bổ sung giúp tăng khả năng đâm chồi 33%, số lượng rễ tăng 57%,

bề mặt lá tăng 30% và năng suất lúa tăng 13 - 22% (Van et al., 1994)

2.4.2 Các nhóm vi khuẩn nội sinh cây lúa

Vi khuẩn nội sinh trong thân, rễ, hạt và lá ở cây lúa rất đa dạng bao gồm

nhiều loài khác nhau và được ghi nhận ở Bảng 2.5

Bảng 2.5 Vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây lúa

Alphaproteobacteria

Betaproteobacteria

2.4.3 Đặc điểm của vi khuẩn nội sinh thực vật - ở cây lúa

* Qúa trình xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật của vi khuẩn nội sinh

+ Nguồn gốc vi khuẩn nội sinh

Qua các kết quả nghiên cứu thu được từ thân, lá, hạt và rễ, Mano và Morisaki (2008) cho rằng nguồn gốc của vi khuẩn nội sinh phải là đất vùng rễ McIncroy và Klopper (1995) đã xác định hạt giống như là nguồn của vi khuẩn nội sinh trên bắp ngọt và bông vải Vi khuẩn nội sinh từ môi trường bên ngoài,

ở vùng rễ và rễ hạt đang nảy mầm tấn công vào khí khổng, vết thương Hầu hết vi khuẩn nội sinh đều có ở vùng rễ Nhiều vi khuẩn nội sinh không chỉ tấn công vào rễ mà chúng còn tấn công vào hạt và lá

+ Sự di chuyển của vi khuẩn nội sinh

Theo Hallmann (2001), thường vi khuẩn nội sinh di chuyển từ môi trường bên ngoài đến cây chủ bằng các cơ chế hóa hướng động, ngẫu nhiên hoặc cả hai Rễ cây tiết ra bên ngoài một số hợp chất hóa học giúp vi khuẩn

nội sinh tìm đến và quần tụ trên bề mặt rễ Vi khuẩn có lợi Pseudomonas fluorescens và Azospirillum brasilense hướng đến rễ lúa mì do rễ tổng hợp và

phóng thích hợp chất kích thích (Bashan, 1986) Sự tiếp xúc do rễ phát triển

để tìm nguồn nước hay chất dinh dưỡng cũng là cơ hội ngẫu nhiên quan trọng

để vi khuẩn có thể tiếp xúc với lông hút của rễ non

+ Tiếp xúc

Lectin là một hợp chất trung gian để gắn chặt vi khuẩn nội sinh vào bề

mặt rễ Duiff và Lemanceau (1997) đã chứng minh vi khuẩn Pseudomonas fluorescens dòng WCS417r hiện diện trên bề mặt rễ do hợp chất lipo-