Phân lập và xác định gen độc tố của vi khuẩn vibrio parahaemolyticus trong hải sản tươi sống tại các chợ ở thành phố nha trang

Mật độ tế bào và đặc điểm hình thái của các chủng Vibrio được phân lập từ các mẫu hải sản ở chợ Vĩnh Hải, Vĩnh Thọ, chợ biển Bãi Dương .... Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Văn Duy và

TS Phạm Thu Thủy đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy, truyền đạt kinh nghiệm và giúp

đỡ tôi từng bước tiếp cận và hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học

và môi trường Thầy cô đã tận tình giúp đỡ, giảng dạy và truyền đạt kiến thức quý báu, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có được nền tảng kiến thức bước tiếp những chặng đường tiếp theo

Con xin gửi lòng biết ơn đến ba mẹ và anh chị đã luôn bên cạnh động viên, ủng hộ và dành cho con tất cả tình yêu thương, con sẽ luôn cố gắng sống và phấn đấu với niềm tin yêu này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn lớp 48 CNSH, đã đồng hành

và chia sẽ buồn vui với tôi trong những năm tháng sinh viên, trong suốt khóa học cũng như quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến chị Minh Nhật và nhóm G8-50SH đã quan tâm và nhiệt tình giúp đỡ để bài luận văn được hoàn thành

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người đã dành cho tôi tình cảm quý báu này!

Nha Trang, tháng 07 năm 2010

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Cẩm Ly

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

LỜI NÓI ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm hải sản 2

1.1.1 Trên thế giới 2

1.1.2 Ở Việt Nam 6

1.2 Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 7

1.2.1 Phân loại chi Vibrio 7

1.2.2 Đặc điểm của V parahaemolyticus 9

1.2.3 Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của V parahaemolyticus 12

1.2.4 Khả năng gây bệnh của V parahaemolyticus 13

1.2.5 Gen độc tố của V parahaemolyticus 14

1.3 Mục tiêu và tính cấp thiết của đề tài 18

1.3.1 Mục tiêu 18

1.3.2 Tính cấp thiết 18

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Vật liệu 19

2.1.1 Mẫu 19

2.1.2 Thiết bị chuyên dụng 19

2.1.3 Hóa chất, môi trường và thuốc thử 20

2.2 Nội dung nghiên cứu 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Phân lập vi khuẩn V parahaemolyticus 25

2.3.2 Xác định đặc điểm hình thái của vi khuẩn Vibrio 26

2.3.3 Xác định khả năng sinh trưởng 27

2.3.4 Xác định một số đặc tính sinh hóa của các chủng Vibrio 28

2.3.5 Bảo quản chủng vi khuẩn 30

2.3.6 Tách chiết DNA hệ gen từ tế bào vi khuẩn V parahaemolyticus 30

2.3.7 Xác định gen độc tố bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 31

2.3.8 Điện di trên gel agarose và đọc kết quả điện di 33

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Phân lập vi khuẩn vi khuẩn Vibrio từ thực phẩm hải sản 35

3.2 Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng Vibrio 39

3.3 Đường cong sinh trưởng của các chủng Vibrio 41

3.4 Một số đặc tính sinh hóa của V parahaemolyticus 42

3.5 Xác định gen độc tố của các chủng Vibrio bằng kỹ thuật PCR 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT

Deoxynucleotide triphosphate dNTP

Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose TCBS

Thermostable direct hemolysin tdh (TDH)

Random Amplification of Polymorphic DNA RAPD Loop mediated isothermal amplification LAMP

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các nhóm thực phẩm V parahaemolyticus gây ngộ độc thực phẩm 4

Bảng 1.2 Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi V parahaemolyticus do tiêu thụ thực phẩm hải sản 1993 -2000 Hồng Kông 5

Bảng 1.3 Các triệu chứng lâm sàng viêm dạ dày ruột gây ra bởi Vibrio parahaemolyticus 5

Bảng 1.4 Các đặc tính khác nhau của các loài thường gây bệnh trên người liên quan đến việc tiêu thụ hải sản 8

Bảng 1.5 Các kháng nguyên của V parahaemolyticus (1986) 11

Bảng 2.1 Các mẫu hải sản thu mua từ một số chợ ở thành phố Nha Trang dùng để phân lập vi khuẩn Vibrio 19

Bảng 2.2 Đặc điểm các mồi sử dụng cho phản ứng PCR: 32

Bảng 2.3 Các thành phần sử dụng trong phản ứng PCR 32

Bảng 3.1 Mật độ tế bào và đặc điểm hình thái của các chủng Vibrio được phân lập từ các mẫu hải sản ở chợ Vĩnh Hải, Vĩnh Thọ, chợ biển (Bãi Dương) 36

Bảng 3.2 Khả năng chịu muối của các chủng Vibrio 43

Bảng 3.3 Khả năng lên men đường của các chủng vi khuẩn Vibrio 44

Bảng 3.4 Khả năng sử dụng lysin của các chủng vi khuẩn 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn V parahaemolyticus được quan sát dưới kính hiển vi 9

Hình 1.2 Hai nhiễm sắc thể dạng vòng của V parahaemolyticus 17

Hình 2.1 Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài 24

Hình 2.2 Sơ đồ chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR 33

Hình 3.1 Các khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio sau một ngày (24 giờ) nuôi trên môi trường thạch TCBS ở điều kiện pH 8,5, nhiệt độ 370C 35

Hình 3.2 Các khuẩn lạc chủng C2 màu xanh (A) và khuẩn lạc chủng C13 màu vàng sữa (B) 35

Hình 3.3 Tế bào chủng vi khuẩn C2 được soi tươi 39

Hình 3.4 Tế bào của chủng vi khuẩn Vibrio C7 sau khi nhuộm Gram 40

Hình 3.5 Đường cong sinh trưởng của các chủng Vibrio (C1, C2, C7, C15, C23) nuôi trên môi trường APW, ở pH 8,5 ± 0,2, nhiệt độ phòng và lắc ở 150 vòng/phút 41

Hình 3.6 Thí nghiệm lên men đường của chủng vi khuẩn C15 (A) và C2 (B) 44

Hình 3.7 Thí nghiệm sử dụng lysin của các chủng Vibrio 45

Hình 3.8 DNA tổng số của các chủng vi khuẩn được điện di và soi dưới tia UV 46

Hình 3.9 Sản phẩm khuếch đại gen toxR được điện di và soi dưới tia UV 47

LỜI NÓI ĐẦU

Trong những năm trở lại đây, nhiều địa phương trên cả nước thường xuyên phải đối mặt với tình trạng ngộ độc thực phẩm, có nơi ngộ độc thực phẩm đã xảy ra hàng loạt Có nhiều nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm trong đó tiêu thụ hải sản là một trong những nguyên nhân chính yếu Các món ăn hải sản ngày càng phong phú

và là thực phẩm bổ dưỡng hàng đầu, đi kèm đó cũng chứa đựng nhiều nguy cơ tiềm

ẩn gây hại cho sức khỏe của con người

Khi ăn các món ăn sống như ăn gỏi, ăn tái người ăn rất dễ bị nhiễm các bệnh

về hệ tiêu hóa Dù mang lại nguồn dinh dưỡng cao nhưng phải sử dụng nguồn hải sản tươi, đun nấu chín, hợp vệ sinh, tuyệt đối không được ăn tái nếu không sẽ bị nhiễm khuẩn, nhiễm độc, làm lây truyền dịch bệnh tiêu chảy cấp và các bệnh truyền nhiễm đường tiêu hoá

Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn thường sống kí sinh trên các

đối tượng hải sản như tôm, mực, cua, cá,… chúng được coi là nguyên nhân chính gây ra các vụ ngộ độc thức ăn nên cần nghiên cứu khả năng gây bệnh của chúng

Đề tài “Phân lập và xác định gen độc tố của vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus trong hải sản tươi sống tại các chợ ở thành phố Nha Trang”

được tiến hành với mục tiêu:

Phân lập và định danh loài V parahaemolyticus ở các chợ thành phố

Nha Trang có mặt trong một số hải sản tươi sống (tôm, mực, cá, cua…)

Xác định gen độc tố của vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật PCR, tạo cơ

sở khoa học cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh sớm

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm hải sản

1.1.1 Trên thế giới

Ngộ độc thực phẩm là một vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến sức khoẻ con người, có thể gây ra nguy hiểm, thậm chí tử vong Triệu chứng của ngộ độc thực phẩm bao gồm buồn nôn, co thắt dạ dày, tiêu chảy, nôn, sốt và đau đầu Triệu chứng

có thể xảy ra trong vòng 30 phút sau khi ăn trong một vài giờ, hoặc vài ngày sau đó

và ở mức độ nặng, nhẹ khác nhau

Vi khuẩn V parahaemolyticus là nguyên nhân phổ biến gây ngộ độc thực

phẩm ở nhiều nước châu Á, bao gồm Trung Quốc (31,1% vụ dịch ngộ độc thực phẩm được báo cáo giữa năm 1991 và 2001), Nhật Bản (chiếm 20-30% các trường hợp từ 1981 đến 1993) và Đài Loan (69% trường hợp được báo cáo giữa năm 1981

và 2003) Ngoài ra, dịch còn xảy ra ở các nước châu Âu như Tây Ban Nha (1989,

1999, 2004), Pháp (1997) và cả Châu Mỹ, điển hình là Hoa Kỳ (Norinaga và cộng

độc lớn nhất xuất hiện trong tháng tám Từ 1996-1998, đã có 496 ổ dịch, với 24.373

trường hợp do V parahaemolyticus gây ra Số lượng các trường hợp ngộ độc thực phẩm V parahaemolyticus tăng gấp đôi vào năm 1998 so với năm 1997

Ấn Độ: Thời kì 1994-1996, xác định được 146 bệnh nhân bị ngộ độc do vi

khuẩn V parahaemolyticus (Okuda và cộng sự, 1997) Tỷ lệ này tăng đột ngột vào tháng hai năm 1996 và vẫn còn cao cho đến tháng tám Tỷ lệ của bệnh do V

parahaemolyticus tăng lên liên quan đến tăng sự lưu hành của chủng O3: K6 Tỷ lệ

mắc tiêu chảy do chủng O3: K6 chiếm 63% các chủng phân lập từ bệnh nhân ở Calcutta giữa tháng 9 năm 1996 và tháng 4 năm 1997

Mexico: Tổng số 266 mẫu nước biển, nhuyễn thể và cá thu thập từ 12 điểm khác nhau trong đầm phá Pueblo Viejo, Mexico vào các tháng khác nhau trong năm

cho thấy: V parahaemolyticus được tìm thấy ở 11 trong 12 điểm trên Các chủng đã

được kiểm tra kiểu huyết thanh cho mục đích dịch tễ học và O3 là nhóm huyết thanh

thường gặp nhất Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng nhân tố tác động đến phân bố V

parahaemolyticus trong môi trường bao gồm nhiệt độ nước, muối, nồng độ oxy, sự

tương tác với thực vật nổi, sự có mặt của các trầm tích, chất hữu cơ trong huyền phù,

cá và hải sản cũng như sự lên xuống của thủy triều ở cửa sông (Maria và cộng sự,

2004)

Chile: Tóm tắt dịch bệnh tiêu chảy liên quan đến tiêu thụ hải sản và V

parahaemolyticus xảy ra trong mùa hè năm 2004 và 2005 ở các vùng quanh của

Puerto Montt, Chile V parahaemolyticus thu được từ động vật có vỏ và mẫu lâm sàng trong thời gian dịch bệnh chủ yếu thuộc nhóm O3: K6 (Loreto và cộng sự,

2005)

Đài Loan : Từ năm 1983 đến 1993, có 786 chủng Vibrio parahaemolyticus đã

được thu thập từ các dịch bệnh truyền qua thực phẩm và một số các trường hợp tiêu chảy ở miền bắc Đài Loan, gồm 42 kiểu huyết thanh Năm kiểu huyết thanh thường gặp là K8 (36,8%), K15 (10,8%), K12 (8,7%), K56 (7,9%) và K63 (4,7%) Đa số

chủng gây ra bệnh có kiểu huyết thanh là O3:K6 (Wong và cộng sự, 2000)

Gần đây, bệnh tiêu chảy do V parahaemolyticus đã được báo cáo từ Việt Nam, Úc, Hoa Kỳ, Trung Mỹ và Anh Tại châu Phi, V parahaemolyticus lần đầu

tiên được xác định trong các dịch bệnh tại Togo Do triệu chứng phát bệnh tương tự với tả nên người ta đẩy mạnh về công tác y tế công cộng (Bockemuhl và Triemer, 1974)

V parahaemolyticus là nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm như viêm

dạ dày ruột ở người thông qua tiêu thụ hải sản nấu chưa chín hoặc vết thương tiếp xúc

với động vật biển hoặc vùng nước ấm ven biển đặc biệt là ở Đông Nam Á (Wong và

cộng sự, 2000) Khi nhiệt độ tăng lên trong một khoảng thời gian ngắn là đủ cho vi

khuẩn V parahaemolyticus phát triển cho đến khi đạt đến mức độ nhiễm độc (106 vi

khuẩn) (Daniels và cộng sự, 2000)

Trong những năm gần đây, Sở Y tế Hồng Kông nghiên cứu cho biết Vibrio

parahaemolyticus đã liên tục gây ngộ độc và được xếp vào nguyên nhân hàng đầu

Bảng 1.2 Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi V parahaemolyticus do tiêu thụ thực

(Nguồn: Risk Assessment Studies, Report No.20, 2005 )

Bảng 1.3 Các triệu chứng lâm sàng viêm dạ dày ruột gây ra bởi Vibrio

V parahaemolyticus là một loại vi khuẩn ưa mặn, có khả năng gây ngộ độc

thực phẩm và viêm dạ dày ruột, vết thương nhiễm trùng, và nhiễm trùng huyết ở người Nhiễm trùng huyết là mối đe dọa nghiêm trọng vì sinh vật gây bệnh lây lan nhanh hoặc sự hiện diện và tồn tại lâu dài của các độc tố do chúng sản xuất ra lưu thông trong máu Dấu hiệu đặc trưng là sốt hoặc hạ huyết áp và khả năng phân tách các vi sinh vật từ máu Trong trường hợp nhiễm trùng huyết, các triệu chứng có thể bao gồm sưng, đau đớn tứ chi với xuất huyết (Hlady, 1997; Klontz, 1990) Tử vong cũng có thể xảy ra tiếp theo khi có sự xuất hiện của nhiễm trùng huyết Thời gian ủ bệnh có thể từ 2 giờ đến 10 ngày (Barker và Gangarosa, 1974)

1.1.2 Ở Việt Nam

Tại Việt Nam từ năm 1999 đến 2008 đã có khoảng 1.000 vụ ngộ độc thực phẩm được báo cáo với trên 25.000 người mắc, trong đó có 300 người tử vong Riêng tại tỉnh Khánh Hòa, tình hình ngộ độc thực phẩm xảy ra tính từ năm 2001 đến

2008 có 215 ca ngộ độc, trong đó có 7 ca tử vong Nguyên nhân của các vụ ngộ độc thực phẩm là do cá nóc (25 ca), vi sinh vật (48 ca), nấm dại (46 ca) Thời điểm trong năm hay xảy ra ngộ độc thực phẩm là từ tháng 7 đến tháng 12 Loại thực phẩm gây ngộ độc thực phẩm thường gặp là rau, thịt, nhưng hải sản cũng chiếm 11,11% các ca ngộ độc

Theo báo cáo của Tuyet và cộng sự (2002) đã có 548 ca nhiễm bệnh do V

parahaemolyticus gây ra được xác định giữa 1/1995 đến 9/2001 ở Khánh Hòa

Trong thời gian này, các nhà nghiên cứu ghi nhận trong số này có 471 người lớn và

có 57 trẻ em Phân tích vi sinh cho thấy trong số 548 trường hợp tiêu chảy, có 53%

dương tính với vi khuẩn V parahaemolyticus Nhiều địa phương trên cả nước hiện

phải đối mặt với tình trạng ngộ độc thực phẩm ngày càng tăng do nhu cầu ăn hải sản ngày càng nhiều, có nơi ngộ độc thực phẩm đã xảy ra hàng loạt Điều kiện để dịch bệnh xuất hiện là do tình trạng vệ sinh môi trường, nước, thực phẩm kém, đặc biệt là

thói quen, sở thích ăn gỏi, ăn tái hải sản

Tuy các phương tiện truyền thông đưa tin về ngộ độc thực phẩm do loài này gây ra rất nhiều do chúng gây bệnh trên các loài hải sản như tôm, cá (Võ Văn Nha

và cộng sự, 2006) nhưng ở nước ta còn có ít nghiên cứu cơ bản về gen độc tố của vi

khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh Đề tài được thực hiện để đáp ứng tình hình

thực tế ấy, làm cơ sở cho nghiên cứu chẩn đoán và điều trị bệnh kịp thời

1.2 Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

1.2.1 Phân loại chi Vibrio

Vibrio thuộc chi vi khuẩn Gram âm, hình dấu phẩy và di động bằng tiêm mao

đơn cực dinh dưỡng theo phương thức dị dưỡng hữu cơ (Thompson và cộng sự,

2004) Chúng là loài lên men tùy tiện (facultative) và hầu hết dương tính với phản

ứng oxydase Chi Vibrio được chia ra thành các loài không ưa mặn (V cholerae) và các loài ưa mặn (V parahaemolyticus, V alginolyticus) Chúng khác nhau về kích

cỡ, có thể là dài và mảnh hoặc ngắn và mập, dễ dàng sống trên môi trường chứa

dinh dưỡng và sống tốt khi môi trường giàu oxy Hầu hết các loài Vibrio sống ở

30oC nhưng có một số loài ưa mặn sinh trưởng ở 37oC và các loài V

parahaemolyticus, V alginolyticus, V cholerae có thể sinh trưởng ở 42oC Các loài

Vibrio hầu hết sống trong môi trường trung tính nhưng chúng cũng có khả năng chịu

được môi trường kiềm, còn kém phát triển trong môi trường chứa acid Chúng sinh trưởng tốt trong khoảng pH từ 7,4 – 9,6, ức chế ở pH 6,8 và 10,2 (Rujiwat, 2007)

Các loài Vibrio chủ yếu sống ở nước và phân bố dựa vào nhiệt độ, nồng độ

Na+, hàm lượng dinh dưỡng có trong nước và sự có mặt của các loài thực vật và động vật (McCarter, 1999) Chúng thường sống ở biển hoặc cửa sông, trên bề mặt

và trong ruột động vật biển Người ta thường phân lập chúng từ các cặn trầm tích,

nước, thực vật và hải sản Các loài hải sản là nơi an toàn cho các loài Vibrio sinh

sống, bao gồm các loài như trai, sò, cua, tôm, mực Đối với các loài không ưa mặn, chúng có thể được phân lập từ mẫu nước ngọt (Rujiwat, 2007)

Hầu hết các loài Vibrio phân lập từ các mẫu lâm sàng của người đều gây bệnh ngoại trừ V vurnissi Vibrio spp thường gây tiêu chảy hoặc nhiễm độc ngoài ruột (extraintestinal infection), riêng V cholerae có thể gây ra cả hai hiện tượng Gần đây các loài V fluvialis, V hollisae, V minicus cũng liên quan đến gây bệnh ở người, nhưng ít phổ biến Các loài khác thuộc họ Vibrionaceae, gồm V vulnificus,

AliiVibrio salmonicida và V harveyi, là tác nhân gây bệnh trên các loài hải sản và

chúng gây ra thiệt hại lớn về kinh tế Photobacterium profundum, đại diện cho một chi khác trong họ Vibrionaceae, cũng được kể đến trong danh sách các loài gây

bệnh trên hải sản (Rujiwat, 2007)

Bảng 1.4 Các đặc tính khác nhau của các loài thường gây bệnh trên người liên quan đến việc tiêu thụ hải sản

** Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides

Các từ viết tắt: V = vàng; Km = không mọc hoặc mọc rất ít; N = nhạy cảm; 0 = không làm;

X = màu xanh; T = tùy chủng (có thể mọc hoặc không mọc); K= kháng; Ti = màu tía (purple); AGS = Arginine glucose slant; mCPC = Modified cellobiose polymyxin; KK = Slant alkaline / Butt alkaline (thạch nghiêng có kiềm); Ka = Slant alkaline/ Butt slightly acidic (sinh hơi);

KA = Slant alkaline /Butt acidic (thạch nghiêng có acid)

Nguồn: www.fda.gov

1.2.2 Đặc điểm của V parahaemolyticus

Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn V parahaemolyticus được quan sát dưới kính hiển vi

(Tế bào vi khuẩn có hình dấu phẩy, di động bằng lông mao đơn cực)

Phân loại khoa học của Vibrio parahaemolyticus:

Theo khóa phân loại của Bergey, V parahaemolyticus là một loại vi khuẩn

Gram âm, hình dấu phẩy, có tiêm mao ở một đầu, di động, kỵ khí tùy tiện và ưa môi

trường kiềm mặn Chúng có thời gian thế hệ 8-9 phút (Daniels và cộng sự, 2000),

thường sống ở các cửa sông và ven biển của hầu hết các vùng trên thế giới Người ta cũng đã phân lập được chúng trong cát, bùn và nước biển, cũng như ở hải sản

(Maria và cộng sự, 2004)

Các đặc tính sinh hóa đặc trưng cho V parahaemolyticus theo như mô tả trên

gồm: phản ứng oxydase (+), khả năng sử dụng lysin (+), ornithin (+), arginine (+), khả năng lên men đường arabinose (+), lactose (-), sucrose (-), mannitol (+), mannose (+), sống được trong phạm vi muối từ 3-8%, không mọc ở môi trường

không có muối (0%) hoặc muối quá cao (10%)

Các chủng V parahaemolyticus phân lập có thể phân biệt nhau bằng kiểu huyết thanh (serotyping) Hệ thống để xác định các kiểu huyết thanh của V

parahaemolyticus dựa trên các cấu trúc kháng nguyên khác nhau của các nhóm

lipopolysaccharides (gọi tắt là nhóm O) và các loại nang (gọi tắt là các loại K)

(Joseph và cộng sự, 1983) Theo nguồn từ FDA, có 12 nhóm O và 65 loại K đã được

xác định (Bảng 1.5)

Bảng 1.5 Các kháng nguyên của V parahaemolyticus (1986)

Các kiểu huyết thanh (O4: K48 và O1: K56, và O3: K6) chiếm ưu thế trong

các dịch bệnh (Nandini và cộng sự, 2000) Các chủng V parahaemolyticus được

phân lập cùng một kiểu huyết thanh có thể giống nhau hoặc phân biệt với nhau

Không phải tất cả các chủng V parahaemolyticus đều gây bệnh ở người Thực tế,

phần lớn các chủng phân lập từ môi trường hoặc hải sản không gây bệnh Các chủng gây bệnh thì sản xuất ra thermostable direct hemolysin (TDH) TDH là một enzyme

có thể làm tan (phá vỡ) các tế bào hồng cầu trên môi trường thạch máu Wagatsuma, được gọi là hiện tượng Kanagawa Vai trò của các độc tố trong cơ chế gây bệnh

chưa được biết rõ ( Kozo và cộng sự, 2003)

Dịch bệnh do V parahaemolyticus gây ra có xu hướng tập trung dọc theo

vùng ven biển trong mùa hè và đầu mùa thu khi nhiệt độ nước cao hơn mức nhiệt độ bình thường Các loại thực phẩm liên quan đến các vụ ngộ độc thường là mực ống,

cá thu, cá ngừ, cá mòi, cua, tôm, và các loại động vật hai mảnh vỏ như hàu, sò, trai

Thời kì ủ bệnh thường là 12 đến 24 giờ, kèm theo các triệu chứng nôn, mửa, đau bụng, tiêu chảy đôi khi sốt Các triệu chứng thường kéo dài trong 72 giờ, nhưng có thể kéo dài đến 10 ngày đối với người có hệ thống miễn dịch suy giảm

1.2.3 Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của V parahaemolyticus

Có nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện V parahaemolyticus như

dựa vào quan sát hình thái dưới kính hiển vi, các đặc tính sinh hóa và các kĩ thuật sinh học phân tử như PCR, RAPD, miễn dịch phân tử

Khi quan sát dưới kính hiển vi, V parahaemolyticus có hình dấu phẩy, di

động bằng tiêm mao đơn cực Về kích cỡ tùy thuộc vào chủng, có chủng thì dài, mảnh hoặc ngắn, mập Khi nhuộm Gram, chúng được phát hiện là Gram âm

Các loài V parahaemolyticus khi nuôi cấy trên môi trường thạch chọn lọc

Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS) có màu xanh lá cây hoặc màu xanh

đậm trên thạch (Kudo và cộng sự, 2003) Ngoài ra, V parahaemolyticus còn phát

triển trên môi trường chọn lọc khác là CHROMagarTM Vibrio cho thấy các khuẩn lạc

có màu tía hoặc tím

Cuối cùng, V parahaemolyticus có thể được phát hiện bằng các kĩ thuật sinh

học phân tử như PCR, RAPD, LAMP, RT- PCR Kỹ thuật PCR được sử dụng để

phát hiện V parahaemolyticus trong các mẫu khác nhau bao gồm hải sản hoặc mẫu

nước Phương pháp này thực hiện nhanh, dễ dàng và đáng tin cậy Chính vì vậy, kỹ

thuật này được ứng dụng để khuếch đại các gen độc tố (toxR, tdh, trh) Gen tdh, trh

là các gen trực tiếp sản xuất ra các protein độc tố TDH, TRH Còn gen toxR là gen điều hòa operon độc tố, đoạn gen này là bảo tồn đối với V parahaemolyticus (Kim

và cộng sự, 1999) Ngoài toxR, gen gyrB cũng là gen bảo tồn nên ta cũng có thể

thực hiện phản ứng PCR đối với đoạn gen này để xác định loài V parahaemolyticus (Zulkifli và cộng sự, 2009)

1.2.4 Khả năng gây bệnh của V parahaemolyticus

V parahaemolyticus là nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm, như viêm

dạ dày ruột ở người thông qua tiêu thụ hải sản nấu chưa chín hoặc qua vết thương tiếp xúc với động vật biển hoặc vùng nước ấm ven biển đặc biệt là ở Đông Nam Á

(Wong và cộng sự, 2000) Loài này có thế hệ thời gian ngắn (8-9 phút) Chúng chỉ

cần một thời gian ngắn có nhiệt độ tăng (khoảng từ 30 - 42oC, tối ưu là 37oC) là đủ

để phát triển đến mức độ lây nhiễm (106 tế bào/ml) (Daniels và cộng sự, 2000)

Hầu hết các kết quả lâm sàng cho thấy bệnh do các chủng có mang gen

thermostable direct hemolysin (tdh), gen tdh - related hemolysin (trh) hoặc mang cả

hai gen Loài vi khuẩn này gây bệnh không chỉ trên người mà còn là các đối tượng

hải sản như tôm, cá, (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004)

Khi gây bệnh trên người, sự lây nhiễm có thể qua đường ăn uống, lây nhiễm

từ người sang người do tiếp xúc với mầm bệnh (chất nôn, phân, dụng cụ, ), người bệnh không rửa tay kỹ, ăn thực phẩm tươi sống hay chưa nấu chín Đây là nguyên nhân chủ yếu gây ra viêm dạ dày ruột (gastroenteritis) cấp tính Sự lây nhiễm qua vết thương cũng có, nhưng ít phổ biến hơn ngộ độc do ăn hải sản và thực phẩm bị nhiễm chéo với các loại thực phẩm hải sản khác Theo trung tâm an toàn thực phẩm Hồng Kông, quá trình chế biến bị lây nhiễm hoặc nguồn nước sử dụng bị nhiễm và

xử lý không đúng cách Ngoài ra, bơi lội hoặc làm việc ở vùng bị ảnh hưởng có thể dẫn đến nhiễm trùng mắt hoặc tai và các vết thương hở

Bên cạnh loài V parahaemolyticus, các loài Vibrio khác cũng gây ra các vấn

đề nghiêm trọng trong hoạt động nuôi tôm và hầu hết là tác nhân gây bệnh trên vật

chủ hải sản Các loài Vibrio được phân lập từ bệnh tôm là V parahaemolyticus, V

harveyi, V alginolyticus, V.vulnificus, V damsela, V anguillarum và V fluvialis

(Leangphibul và cộng sự, 1985; Lightner, 1988; Ruangpan và Kitao, 1991; Nash và

cộng sự, 1992; Jiravanichpaisal và cộng sự, 1994) Vibrio spp đều có thể xâm nhập

và gây bệnh khi điều kiện môi trường thuận lợi đến các giai đoạn phát triển của tôm như ấu trùng, hậu ấu trùng, tiền trưởng thành và trưởng thành

1.2.5 Gen độc tố của V parahaemolyticus

V parahaemolyticus được công nhận là nhân tố gây ra viêm dạ dày ruột liên

quan đến sự tiêu thụ hải sản, nhưng không phải chủng nào của loài này cũng gây bệnh Một yếu tố độc tính từ lâu đã được coi liên quan đến dịch tễ học liên kết với bệnh là hemolysin Hemolysin là ngoại độc tố, tấn công vào màng tế bào máu và làm tan tế bào Hemolysin chuyển các ion liên kết với protein như hemolysin, transferrin, lactoferrin thành dạng tự do Các ion này (Fe3+) sẽ liên kết với các phức chất dạng chelator ở ngoài tế bào (Zhang và Austin, 1998) Trong nhiều trường hợp, phạm vi tấn công của hemolysin không dừng ở các tế bào hồng cầu mà còn mở rộng phạm vi đến các tế bào biểu mô, tế bào thần kinh và các tế bào nhân đa hình (polymorphonuclear) làm tăng cường độc tố và gây phá hủy các mô Kết quả của sự phân giải này là giải phóng beta-hemolysin (phân hủy hoàn toàn hemoglobin) và alpha-hemolysin (phân hủy không hoàn toàn hemoglobin) Hemolysin được sản xuất

bởi nhiều loài vi khuẩn khác nhau, bao gồm: Escherchia coli, Pseudomonas

aeruginosa và các loài Vibrio (Zhang và Austin, 1998) Với mỗi loài, hemolysin có

thể có cơ chế giống nhau hoặc khác nhau trong xâm nhiễm và gây độc

V parahaemolyticus trên môi trường thạch máu Wagatsumar đã sản xuất ra beta-hemolysin Hầu hết các chủng V parahaemolyticus phân lập từ các mẫu lâm

sàng đều cho thấy hoạt tính tán huyết (hemolytic), hoạt tính này được gọi là hiện tượng Kanagawa (KP) nhưng chỉ có 1-5% các chủng không từ nguồn lâm sàng lại cho dương tính KP Do vậy, hemolysin được xem là yếu tố độc tố quan trọng và phản ứng KP được dùng để đánh dấu nhận biết cho các chủng độc hại Hemolysin này có tên là TDH (thermostable direct hemolysin), cấu trúc của nó không có lipid hay carbonhydrat mà là một dimer, bao gồm hai tiểu đơn vị và mỗi tiểu đơn vị có

khối lượng 21 kDa (Takeda và cộng sự, 1978) Nó rất bền nhiệt, khi đun nóng ở

100oC trong 10 phút thì protein bị phân giải còn lại 165 amino acid với một cầu nối

disulfua gần nhóm carboxyl (–COOH) ở cuối cùng (Tsunasawa và cộng sự, 1987),

hoạt tính hemolysin tác động trực tiếp lên tế bào hồng cầu, ly giải phá vỡ hồng cầu TDH gây tiết chất dịch trong ruột cũng như gây ra độc tố cho một vài loại tế bào

Honda và cộng sự (1992) đã chứng tỏ TDH phá vỡ tế bào eucaryote theo ba bước,

đầu tiên chúng liên kết với màng tế bào hồng cầu sau đó chúng tham gia tạo ra các kênh lỗ màng (porin channel) ở tế bào ruột có đường kính khoảng 2 nm, cho phép nhiều loại ion tràn vào như Na+, Mg+, Ca+ Khi TDH tăng lên thì cũng tăng lên các kênh này làm cho các ion này tràn vào tự do và tế bào căng lên hết mức và phá vỡ tế bào do mất cân bằng thẩm thấu

Năm 1988, Honda và các đồng nghiệp phát hiện ra một hemolysin mới trong

khi phân lập các chủng lâm sàng KP dương tính (Honda và cộng sự, 1988)

Hemolysin này được gọi là TDH-related haemolysin (TRH), có tính chất hóa lý,

miễn dịch và sinh học tương tự như TDH TDH và TRH được mã hóa bởi gen tdh và

trh tương ứng, chúng được coi là yếu tố độc tính quan trọng trong gây bệnh của V parahaemolyticus (Nishibuchi và cộng sự, 1992; Honda và Iida, 1993; Xu và cộng

sự, 1994) Gen tdh, trh lần lượt có kích thước 250 và 251bp Giữa các chủng V parahaemolyticus có các gen độc tố khác nhau Hầu như tất cả các mẫu lâm sàng có tdh hoặc trh, hoặc cả hai, trong khi gần như tất cả các mẫu từ môi trường không có

(Shirai và cộng sự, 1990; Suthienkul và cộng sự, 1995; Iida và cộng sự, 1997) hoặc

có với tỉ lệ thấp 1-5% (Nishibuchi và Kaper, 1995, Robert và cộng sự, 2004)

Các chủng V parahaemolyticus gây bệnh là các chủng KP dương tính, có chứa gen tdh và gen trh mã hóa các protein độc tố TDH, TRH nằm trên operon độc

tố V parahaemolyticus toxRS (toxRS), được điều hòa bởi gen toxR Operon

Vp-toxRS có tên này là do cấu trúc và chức năng của nó tương tự với operon của V cholerae là toxRS, là bộ mã hóa cho gen nội độc tố tả Giữa hai operon của hai loài

V parahaemolyticus và V cholerae chiếm lần lượt 52% và 62% trình tự tương

đồng Giống operon toxRS của V cholerae, operon Vp-toxRS không chỉ điều khiển

sự phiên mã của gen độc tố ruột tdh mà còn các gen khác nữa Trình tự của operon

Vp-toxRS còn được phát hiện có trong tất cả các chủng V parahaemolyticus

(Nishibuchi và cộng sự, 1995)

Ở các loài V mimicus, V cholerae, V hollisae (Nishibuchi và Kaper, 1995)

có trình tự gen độc tố tdh, trh giống với gen độc tố tdh, trh ở chủng V

parahaemolyticus gây bệnh nên trong nghiên cứu, Sujeewa và cộng sự (2009)

không chỉ xác định mỗi gen tdh, trh mà còn xác định gen toxR để chỉ ra chính xác đây là loài V parahaemolyticus Gen toxR là gen điều hòa kiểm soát sự biểu hiện

của các gen mã hóa cho các nhân tố độc lực ngoại bào quan trọng và các gen liên

quan đến các độc tố khác Gen toxR có kích thước 368 bp là gen điều hòa cho operon Vp- toxRS (Zulkifli và cộng sự, 2009), tồn tại ở tất cả các chủng V

parahaemolyticus

Ở loài V cholerae, gen toxR được biết là gen điều hòa dịch mã của gen ctx-

mã hóa cho độc tố tả Các nghiên cứu sau đó cũng chỉ ra gen toxR là gen mã hóa protein màng đóng vai trò chủ chốt trong điều hòa gen ctx và nhiều gen khác, bao gồm gen tcp mã hóa độc tố lông mao (toxin-coregulated pili) và gen ompU, ompT

mã hóa các protein màng phía ngoài (OMPs) ở V cholerae Theo thống kê, gen toxR biểu hiện đồng thời gen phá hủy tế bào máu và điều hòa biểu hiện OMP ở loài V

vulnificus Trình tự nucleotide được xác định tương đồng giữa ba gen toxR của ba

loài V cholerae, V parahaemolyticus, V vulnificus là 52- 63% Những điều này chỉ

ra rằng gen toxR là gen điều hòa kiểm soát sự biểu hiện của nhiều gen mã hóa cuả nhiều loài trong chi Vibrio (Jun và cộng sự, 2001)

Chủng V parahaemolyticus có hai nhiễm sắc thể I và II lần lượt có kích

thước 3,2 và 1,9 Mb, hoàn thành giải trình tự vào ngày 10 tháng 3 năm 2003, so

sánh với bộ gen của V cholerae đã chỉ ra nhiều điểm tái sắp xếp trong mỗi nhiễm sắc thể và giữa hai nhiễm sắc thể (Kozo và cộng sự, 2003)

Nhiễm sắc thể I dạng vòng có 3223 gen, chiều dài gồm 3.288.558 nucleotide,

mã hóa 3080 protein, hàm lượng GC 45%, số gen mã hóa là 86%

Nhiễm sắc thể II có 1769 gen mã hóa nên 1752 protein, chiều dài gồm 1.877.212 nucleotide hàm lượng GC trong nhiễm sắc thể là 45% Nhiễm sắc thể II

có chứa các gen độc tố tdh, trh

Hình 1.2 Hai nhiễm sắc thể dạng vòng của V parahaemolyticus

(Từ ngoài vào trong, mỗi một vòng tròn và mỗi một màu sắc là các vùng gen quy định các chức năng riêng của gen trong nhiễm sắc thể)

T3SS (Type III Secretion System) là một trong những hệ thống bài tiết ra các protein của vi khuẩn vào môi trường ngoại bào hoặc vi khuẩn cũng có thể tiêm những protein này vào tế bào vật chủ eucaryote của chúng T3SS cần thiết cho phát sinh bệnh ở các loài vi khuẩn gây bệnh T3SST không xuất hiện ở bộ gen vi khuẩn Nhiễm sắc thể số 2

Nhiễm sắc thể số 1

V cholerae Qua các thí nghiệm phân tích về bộ gen, người ta cho thấy ở loài V parahaemolyticus có hai hệ thống T3SS (Thomson và cộng sự, 2004), chúng đóng

vai trò trong phát sinh bệnh của vi khuẩn này (Honda và cộng sự, 2006) Đó là

T3SS1 và T3SS2, mỗi một hệ thống phân bố lần lượt ở hai nhiễm sắc thể I và II Jun

và cộng sự (2001) đã báo cáo một đảo gen gây bệnh Vp-PAI dài 80 kp trên nhiễm

sắc thể II bảo tồn trong các chủng KP (+) và không có trong KP (-) (Kodama và

cộng sự, 2010) Vp-PAI không chỉ chứa gen tdh mà còn chứa cụm gen T3SS2 Do

vậy, Vp-PAI liên quan đến phát sinh bệnh của V parahaemolyticus gây ra ở người

1.3 Mục tiêu và tính cấp thiết của đề tài

1.3.1 Mục tiêu

Phân lập và định danh loài V parahaemolyticus ở các chợ thành phố Nha

Trang có mặt trong một số hải sản tươi sống (tôm, mực, cá, cua…)

Xác định gen độc tố của vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật PCR, tạo cơ sở khoa học cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh sớm

1.3.2 Tính cấp thiết

Hiện nay hải sản đang là món ăn được nhiều người chú ý đến bởi thành phần dinh dưỡng và khẩu vị của nó Người ta cũng đã chế biến ra rất nhiều món hải sản mới lạ như nướng, tái,… để kích thích nhu cầu đó Đi đôi với việc tiêu thụ các món

này ngày càng nhiều thì các vụ ngộ độc thực phẩm ngày càng tăng Tuyet và cộng

sự (2002) báo cáo đã có 548 ca nhiễm bệnh do V parahaemolyticus gây ra được xác

định giữa 1/1995 đến 9/2001 ở Khánh Hòa Tình hình ngộ độc thực phẩm do ăn hải sản tươi sống không được chế biến kĩ đã được các phương tiện truyền thông đưa tin nhiều, nhưng bản chất sinh học của nó vẫn chưa được quan tâm đầy đủ Khi ngộ độc xảy ra, bệnh nhân không được đưa đi cấp cứu kịp thời có thể dẫn tới tử vong Các nghiên cứu cơ bản trong nước còn rất ít, vì vậy, việc nghiên cứu về gen độc tố tạo

cơ sở cho việc xây dựng phương pháp chẩn đoán để kiểm soát bệnh và để sản xuất

ra thuốc điều trị kịp thời, tiện dụng là rất cần thiết

Đề tài tiến hành nghiên cứu ở mức độ phân tử, là bước đầu tạo cơ sở khoa học để nghiên cứu chẩn đoán và điều trị (sản xuất thuốc) đáp ứng nhu cầu về bệnh học thực phẩm

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Mẫu

Mẫu hải sản (tôm bạc, tôm sú, cua biển, mực ống) được thu mua từ các chợ ở Nha Trang: chợ biển (Bãi Dương), chợ Vĩnh Hải, chợ Vĩnh Thọ từ 15/03 đến 15/04

Bảng 2.1 Các mẫu hải sản thu mua từ một số chợ ở thành phố Nha Trang

dùng để phân lập vi khuẩn Vibrio

Máy lắc (GFL 3005, Đức)

Tủ cấy (Telstar AV 100, OSI Co, Ltd, Tây Ban Nha)

Tủ sấy (Binder, Đức) Nồi khử trùng autoclave (Sturdy industrial Co, Ltd, Đài Loan)

Lò vi sóng phá mẫu (LG, Hàn Quốc)

Máy chụp và phân tích ảnh gel (VWRTM, Mỹ) Máy block nhiệt (VWRTM, Mỹ)

2.1.3 Hóa chất, môi trường và thuốc thử

Các hóa chất chuyên dụng :

DNA marker 100 bp (Biorad, Mỹ), Ethidium bromide 10 mg/ml, proteinase

K 20 mg/ml; Rnase 4 mg/ml

Môi trường tăng sinh: Ankaline Peptone Water (APW)

Pepton : 10 g; Natri clorua (NaCl) : 30 g

Nước cất : 1 lít ; pH = 8,5 ± 0,2

Hoà tan các thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình tam giác Hấp ở nhiệt độ 121oC trong 10 phút Khi bảo quản phải vặn chặt nắp bình, để tránh bay hơi nước và pH bị thay đổi

Môi trường phân lập: Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar (TCBS)

Pepton : 10 g; Cao nấm men : 5 g;

Natri xitrat : 10 g; Natri thiosunphat (Na2S2O3): 10 g;

Mật bò : 5 g; Sucrose : 20g;

NaCl : 10 g; Sắt (III) citrate (FeC6H5O7) : 1 g;

Natri cholate : 3 g; Xanh bromthymol :0,04 g;

Xanh thymol : 0,04 g; Thạch : 15 g ;

Nước cất vô trùng: 1 lít pH = 8,6 ± 0,2

Đun sôi môi trường trong bình tam giác ở 100oC trong lò vi sóng cho đến khi tan hoàn toàn các thành phần môi trường

Môi trường nuôi cấy Luria Bertani (LB)

Trypton : 10 g; Natri clorua (NaCl) : 30 g;

Cao nấm men : 5 g; Nước cất : 1 lít

pH = 7 ± 0,2

Hoà tan các thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình chứa thích hợp Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 10 phút Khi bảo quản phải vặn chặt nắp bình, để tránh bay hơi nước và pH bị thay đổi

Môi trường kiểm tra khả năng chịu muối: muối trypton có giải nồng độ NaCl là 0; 3; 6; 8 và 10 % NaCl (ký hiệu lần lượt là: T1N0; T1N3; T1N6; T1N8 và

T1N10)

Hoà tan 10 g trypton trong 1 lít nước cất Sau đó, thêm lần lượt : 30, 60, 80

và 100 g NaCl để được các canh thang trypton có giải nồng độ NaCl 0; 3; 6; 8 và 10

% Sau đó, khuấy đều, rồi chỉnh pH sao cho môi trường sau khi hấp có pH = 7,2 ± 0,2 Tiến hành rót 5 ml môi trường vào mỗi ống nghiệm Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút Các ống môi trường phải được nút chặt trong quá trình bảo quản để tránh bốc hơi nước làm thay đổi nồng độ muối

Môi trường thử decarboxylase (Môi trường cơ bản)

Môi trường lên men đường (Môi trường cơ bản)

Pepton : 10 g; NaCl : 30 g; Cao thịt bò : 3 g; Phenol đỏ : 0,04 g; Nước cất : 1 lít; pH = 7,0 ± 0,2

Hoà tan các thành phần trên, chỉnh pH rồi rót 2,5 ml vào các ống nghiệm Hấp ở nhiệt độ 1210

C trong 10 phút

Pha các loại dung dịch cacbonhydrat 50% (như: sucrose, lactose, arabinose, D-mannitol và mantose) trong nước cất rồi lọc vô trùng Thêm 0,278 ± 0,002 ml dung dịch này vào ống nghiệm chứa 2,5 ml môi trường cơ bản Môi trường cuối cùng có nồng độ carbohydrat là 5%

Dung dịch nước muối sinh lý

Hoà tan 8,5 g NaCl trong 1 lít nước cất Hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút rồi để nguội

Thuốc nhuộm Tím Violet

Hòa tan 1 g tím violet vào trong 10 ml cồn (dung dịch 1)

Hòa tan 2 g phenol tinh thể vào 10 ml nước cất (dung dịch 2)

Trộn chung dung dịch 1 và dung dịch 2 lại với nhau ta có dung dịch thuốc nhuộm tím violet

Thuốc nhuộm Liugol

Iod tinh thể : 1 g

KI : 2 g

Nước cất : 200 ml

Pha chế: Hòa tan iod vào nước cất, sau đó cho KI vào, bảo quản trong lọ tối màu

Thuốc nhuộm Fuschin

Fuschin kiềm : 1g

Rượu ethylic 95% : 10 ml

Phenol tinh thể : 5g

Nước cất : 100 ml

Pha chế:

Hòa tan Fuschin vào trong 10 ml cồn 95% (dung dịch 1)

Hòa tan phenol tinh thể vào 100 ml nước cất (dung dịch 2)

Trộn đều dung dịch 1 và dung dịch 2 đem lọc, ta có thuốc nhuộm Fuschin

Dung dịch xanh methylen

Rượu ethylic :300 ml

Xanh methylen : 25 g

Hòa tan xanh methylen vào rượu rồi lọc (dung dịch 1)

Dịch lọc 1 thêm 1 ml KOH 1% và 1000 ml nước cất

2.2 Nội dung nghiên cứu

Quy trình thực hiện được sơ đồ hóa trong hình 2.1:

Hình 2.1 Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài

Cấy ria

Khuẩn lạc thuần chủng

Khả năng

ưa muối

Khả năng lên men đường

Khả năng sử dụng lysin

Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn

Kiểm tra các đặc tính sinh hóa