phân lập và xác định gene độc lực apxiva của vi khuẩn actinobacillus pleuropneumoniae gây bệnh viêm phổi – màng phổitrên heo tại lò mổ thành phố cần thơ

TR NG I H C C N TH KHOA NÔNG NGHI P VÀ SINH H C NG D NG MÔN THÚ Y BÙI TÂN THI N PHÂN L P VÀ XÁC NH GENE CL C APXIVA C A VI KHU N ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE GÂY B NH VIÊM PH I – MÀNG PH I TRÊN HEO T I LÒ M THÀNH PH C N TH LU N V N T T NGHI P NGÀNH THÚ Y n Th , 12 - 2014 TR NG I H C C N TH KHOA NÔNG NGHI P VÀ SINH H C NG D NG MÔN THÚ Y BÙI TÂN THI N PHÂN L P VÀ XÁC NH GENE CL C APXIVA C A VI KHU N ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE GÂY B NH VIÊM PH I – MÀNG PH I TRÊN HEO T I LÒ M THÀNH PH C N TH LU N V N T T NGHI P NGÀNH THÚ Y CÁN B H NG D N TS. LÝ TH LIÊN KHAI n Th , 12 - 2014 TR NG I H C C N TH KHOA NÔNG NGHI P VÀ SINH H C NG D NG MÔN THÚ Y tài: “Phân l p xác nh gene c l c ApxIVA c a vi khu n Actinobacillus pleuropneumoniae gây b nh viêm ph i – màng ph i heo i lò m thành ph C n Th ” sinh viên Bùi Tân Thi n th c hi n t i phòng Sinh Th c n, B môn Thú Y, Khoa Nông Nghi p Sinh H c ng D ng, Tr ng i h c C n Th , t tháng 1/2014 n tháng 8/2014. n Th , ngày… tháng… n m 2014 C n Th , ngày… tháng… n m 2014 Duy t B môn Giáo viên h ng d n TS. Lý Th Liên Khai n Th , ngày….tháng….n m 2014 Duy t Khoa Nông nghi p Sinh h c ng d ng i I CAM OAN Tôi xin cam oan ây công trình nghiên c u c a riêng tôi, s li u, k t qu c nêu lu n v n trung th c ch a t ng c công b t k công trình khác tr c ó. Sinh viên th c hi n Bùi Tân Thi n ii IC MT Th i gian trôi nhanh t t chân vào tr ng i h c C n Th . Trong su t th i gian h c t p ây, ã nh n c nhi u s giúp , ng viên chân thành cha m , th y cô b n bè. Ngay gi phút ây, ã hoàn thành xong lu n v n t t nghi p c a mình, vô sung s ng mong mu n bày t lòng c m n n nh ng ng i giúp su t th i gian qua. u tiên, xin kính g i l i c m n sâu s c n cha m - ng i ã có công sinh thành, d y d nên ng i. Xin cám n cha m ã lao ng v t v , không ng i c c kh , m a n ng lo cho c y c v v t ch t l n tinh th n, l y ó làm ng l c v t qua nh ng lúc khó kh n. Xin chân thành ghi nh công n cô Lý Th Liên Khai ng i ã h t lòng lo ng, ch b o, ng viên su t trình h c t p th c hi n tài. Quý th y cô B môn Thú Y B môn Ch n Nuôi ã truy n t cho nh ng ki n th c, kinh nghi m quý báu, l n nh n th c xã h i trình h c t p t i tr ng . Chân thành c m n anh Nguy n L ng Tr ng Giang l p Cao h c khóa 19; m t ng i anh c ng nh m t ng i th y ã giúp , ch b o r t nhi u u su t trình hoàn thành tài này. m n b n t p th l p D c Thú Y khóa 36 ã ng hành tôi, i ng i ã nhi t tình giúp ng viên có th hoàn thành t t lu n n này. Tôi c ng xin g i l i cám n n anh ch Cao h c khóa 19, 20 em sinh viên khóa 38 ã giúp th i gian th c hi n lu n v n. Cu i xin cám n quý th y cô H i ng ã dành th i gian quý báu a c lu n v n c a tôi, nghe báo cáo a nh ng l i nh n xét hoàn thi n lu n v n c a mình. Xin m t l n n a cám n t t c . Bùi Tân Thi n iii DANH M C CH vi t t t VI T T T Di n gi i ti ng Anh Di n gi i ti ng Vi t APP Actinobacillus pleuropneumoniae Vi khu n Actinobacillus pleuropneumoniae Apx Apx – Toxins BA Blood agar Bp Base pair CA Chocolate agar CAMP Christie – Atkinson – Munch – Peterson CPS Capsule Polysaccharide c t Apx Th ch máu p base Th ch socola polysaccharide ctv ng tác viên DNA Deoxyribo Nucleic Acid ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay LPS Lipopolysacccharide Màng lipopolysacccharide MHA Mueller Hinton Agar Th ch Mueller Hinton NA Nutrient Agar Th ch dinh d NAD Nicotinamide adenine dinucleotide O.N.P.G Ortho-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside OMPs Outer Membrane Proteins Protein màng PCR Polymerase Chain Reaction Ph n ng chu i polymerase RTX Repeats in Toxin TSA Tryptic Soy Agar ng Th ch Tryptic Soy iv CL C Trang t . i i cam oan . ii i c m t . iii Danh m c ch vi t t t . iv c l c v Danh sách hình . vii Danh sách b ng . viii Tóm l c . ix CH NG 1: TV N CH NG 2: C S LÝ LU N 2.1 Tình hình nghiên c u vi khu n Actinobacillus pleuropneumoniae gây b nh viêm ph i – màng ph i heo n c 2.1.1 Tình hình nghiên c u n c 2.1.2 Tình hình nghiên c u n c . 2.2 c m v vi khu n Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 2.2.1 S l 2.2.2 c v vi khu n APP c tính nuôi c y, phân l p . 2.2.3 Tính gây b nh . 2.2.4. S c kháng 2.2.5. Gene c l c Apx 2.3 c m b nh viêm ph i – màng ph i vi khu n Actinobacillus pleuropneumoniae gây 11 2.3.1 Cách sinh b nh . 11 2.3.2 D ch t b nh . 11 2.3.3 Tri u ch ng 12 2.3.4 B nh tích 13 2.3.5 Ch n oán 16 2.3.6 Phòng b nh . 17 2.3.7 Kháng sinh u tr . 18 CH NG TI N VÀ PH 3.1 Ph NG 3: PH NG PHÁP THÍ NGHI M 19 ng ti n thí nghi m 19 3.1.1 Th i gian, a m . 19 3.1.2 it ng nghiên c u . 19 3.2 Ph ng pháp ti n hành thí nghi m . 20 v 3.2.1 Ph ng pháp l y m u . 20 3.2.2 Ph ng pháp nuôi c y, phân l p, nh danh vi khu n Actinobacillus pleuropneumoniae . 21 3.2.3 Ph ng pháp nh danh vi khu n A. pleuropneomoniae d a vào gene c ApxIVA 23 3.2.4 Ph ng pháp ki m tra tính kháng c a vi khu n APP phân l p c i i m t s lo i kháng sinh . 27 3.2.5 Các ch tiêu theo dõi . 28 3.2.6 Ph CH ng pháp x lý s li u 29 NG 4: K T QU VÀ TH O LU N 30 4.1 Tình hình ho t ng c a lò m thành ph C n Th . 30 4.2 K t qu kh o sát b nh hô h p heo t i lò m Thành ph C n Th 33 4.3 K t qu phân l p, nh danh vi khu n Actinobacillus spp. ng ph n ng sinh hóa 35 4.4 K t qu phân l p c vi khu n Actinobacillus spp. theo ph ng th c ch n nuôi 36 4.5 K t qu phân l p c vi khu n A. pleuropneumoniae d a vào xác nh gene mã hóa c l c apxIVA. 38 4.6 K t qu kh o sát tính kháng c a vi khu n A. pleuropneumoniae phân l p c i v i m t s lo i kháng sinh . 42 4.7 K t qu kh o sát tính a kháng v i m t s lo i kháng sinh c a vi khu n A. pleuropneumoniae phân l p c . 44 CH NG 5: K T LU N VÀ NGH . 46 5.1 K t lu n. 46 5.2 ngh . . 46 TÀI LI U THAM KH O 47 PH CH NG . 53 vi DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang 2.1 Heo b nh viêm ph i - màng ph i th c p tính 12 2.2 Heo b nh viêm ph i - màng ph i th c p tính 13 2.3 Ph i xu t huy t c m khám heo b nhi m A. pleuropneumoniae th c p tính. 14 2.4 Ph i xu t huy t ho i t 14 2.5 Màng ph i viêm dính có t huy t màng ph i th mãn tính. 2.6 Heo tháng tu i b viêm ph i - màng ph i nhi m Actinobacillus pleuropneumoniae 15 3.1 Quy trình nuôi c y phân l p vi khu n Actinobacillus 22 3.2 Quy trình th c hi n ph n ng PCR 23 3.3 Quy trình th c hi n kháng sinh 27 4.1 S 30 4.2 Ph 4.3 Khu v c gi t m heo, làm lòng 32 4.4 Heo b nh hô h p - n m th th b ng, ho 34 4.5 Ph i heo b nh hô h p - xu t huy t n a bên ph i 35 4.6 K t qu ch y 39 4.7 Khu n l c A. pleuropneumoniae môi tr chocolate 4.8 Hình thái vi khu n APP xem d i x100 4.9 heo b nh viêm ph i - màng ph i heo b nh viêm ph i - 15 k t c u lò m thành ph C n Th ng ti n v n chuy n thân th t n di gene 32 c l c apxIVA c a vi khu n APP ng th ch i kính hi n vi 40 phóng 40 Ph i viêm dính s APP n - rách màng bao ph i nhi m vi khu n 41 4.10 Ph i viêm dính s n nhi m vi khu n APP 41 4.11 K t qu kháng sinh 4.12 S c a vi khu n A. pleuropneumoniae a kháng v i kháng sinh c a vi khu n APP phân l p vii 43 c 45 DANH SÁCH B NG ng Tên b ng 3.1 Trang c tính sinh hóa c a ch ng Actinobacillus 23 3.2 Thành ph n h n h p c a ph n ng PCR 3.3 Trình t nucleotide c a c p khu n A. pleuropneomoniae 3.4 Chu trình nhi t cho ph n ng PCR pleuropneomoniae 3.5 Các chu n m c ng kính vòng vô khu n 28 4.1 K t qu kh o sát heo b nh hô h p t i lò m thành ph C n Th 33 4.2 T l m ud 35 4.3 T l heo nhi m vi khu n Actinobacillus spp. theo ph th c ch n nuôi 4.4 K t qu nh danh vi khu n APP d a vào gene mã hóa apxIVA 4.5 S 4.6 K t qu n m i dùng 24 nh danh vi 25 nh danh vi khu n A. 26 ng tính v i vi khu n Actinobacillus spp. kháng c a vi khu n APP ng cl c i v i m t s lo i kháng sinh a kháng kháng sinh c a vi khu n APP phân l p viii 37 c 38 42 44 v i amoxicillin, APP kháng v i colistin. Tuy nhiên, k t qu nghiên c u cho th y vi khu n APP nh y c m v i neomycin (100%), v i nghiên c u c a Nguy n Qu c Huy ctv. (2013) xét nghi m 90 m u b nh ph m t heo m c PRRS t i t nh B c Giang cho th y vi khu n APP phân l p c ã kháng v i neomycin. u có th vi c s d ng kháng sinh công tác phòng u tr b a ph ng nhau. Vi khu n APP phân l p lo i kháng sinh florfenicol (hình 4.11). c t i lò m thành ph C n Th m n c m cao v i Hình 4.11: K t qu kháng sinh c a vi khu n A. pleuropneumoniae 43 4.7 K t qu kh o sát tính a kháng v i m t s lo i kháng sinh c a vi khu n A. pleuropneumoniae phân l p c Vi c l m d ng kháng sinh không c n thi t làm cho A. pleuropneumoniae kháng i nhi u lo i kháng sinh. Vì v y tình hình a kháng c a APP phân l p c i t s lo i kháng sinh c nghiên c u th hi n qua b ng 4.6. ng 4.6: K t qu a kháng kháng sinh c a vi khu n APP phân l p c lo i kháng sinh K u a kháng ch ng l (%) FFC, Co, Te, Ci 33,33 FFC, Co, Te 33,33 FFC, Ci 33,33 Kháng t c vi khu n APP phân l p c u a kháng v i nh t lo i kháng sinh (b ng 4.6). Trong ó có ch ng kháng v i lo i kháng sinh florfenicol ciprofloxacin; s kháng v i lo i kháng sinh g m: florfenicol, colistin tetracycline c ng c tìm th y ch ng APP. Riêng ch ng có s a kháng cao bao g m c lo i kháng sinh là: florfenicol, colistin, tetracycline ciprofloxacin (hình 4.12). Vi c vi khu n APP phân l p c kháng v i nhi u lo i kháng sinh có th nh ng lo i kháng sinh th ng c tr n vào th c n phòng b nh cho heo. Bên c nh ó, vi c s d ng kháng sinh m t cách tùy ti n th i gian dài c a ng i ch n nuôi; hay s l m d ng kháng sinh công tác u tr c a thú y ã góp ph n làm cho tình hình a kháng c a APP tr nên ph c t p h n. t qu ki m tra s a kháng v i kháng sinh c a ch ng APP phân l p ct lò m thành ph C n Th phù h p v i nghiên c u c a Chang et al. (2002), ki m tra 60 ch ng APP c phân l p t ph i c a nh ng heo ch t viêm ph i – màng ph i trang tr i khác t i ài Loan th i gian 1985-1993. Tác gi ti n hành ki m tra s nh y c m c a ch ng APP phân l p cv i kháng sinh b ng ph ng pháp khu ch tán th ch. K t qu cho th y 55 ch ng APP phân l p c (92%) kháng v i ho c nhi u h n lo i kháng sinh. Trong ó, ampicillin, chloramphenicol, flumequine, nalidixic acid, streptomycin, sulfonamide / trimethoprim, tetracycline lo i kháng sinh a kháng ph bi n nh t. 44 a kháng v i kháng sinh c a vi khu n A. pleuropneumoniae phân l p c ph bi n, có xu h ng t ng lên v t l ch ng lo i thu c b kháng. Do ó c n có bi n pháp s d ng thu c kháng sinh ch n nuôi thú y h p lý nh m h n ch kh n ng kháng thu c c a A. pleuropneumoniae. Hình 4.12: S a kháng v i kháng sinh c a vi khu n APP phân l p 45 c CH NG T LU N VÀ NGH 5.1 K t lu n. Quá trình th c hi n tài “Phân l p xác nh gene c l c ApxIVA c a vi khu n Actinobacillus pleuropneumoniae gây b nh viêm ph i – màng ph i heo t i lò m thành ph C n Th ”, rút c m t s k t lu n sau: l heo b nh hô h p t i lò m thành ph C n Th t ng i th p 4,27%. hi n di n c a vi khu n APP heo t i lò m thành ph C n Th không ph thu c vào ngu n g c heo nh p v lò m . Khi s d ng ph ng pháp PCR có th a vào gene mã hóa c l c apxIVA. nh danh xác c vi khu n APP Vi khu n APP phân l p c nh y c m cao v i amoxicillin, neomycin. kháng cao v i florfenicol kháng v a v i ciprofloxacin, tetracycline, colistin. t c ch ng APP phân l p c u cho k t qu kháng sinh nhi u nh t lo i kháng sinh. 5.2 Xác a kháng v i nh t lo i ngh . nh serotype c a vi khu n APP ã phân l p c. r ng ki m tra s kháng c a vi khu n APP v i nhi u lo i kháng sinh, t tìm gi i pháp u tr t t nh t. 46 ó TÀI LI U THAM KH O Tài li u ti ng Vi t 1. Cù H u Phú, Nguy n Ng c Nhiên, Nguy n Thu H ng, Âu Xuân Tu n, Nguy n Bích Th y V Ng c Quý, 2005. Xác nh nguyên nhân gây b nh ng hô h p c a heo nuôi t i m t s t nh thu c khu v c phía B c. p chí khoa h c k thu t thú y, 12 (4). 2. ng Xuân Bình, Nguy n Th Ngân Phan H ng Phúc, 2007. Tình hình nhi m Actinobacillus pleuropneumoniae b nh viêm ph i – màng ph i n. p chí khoa h c k thu t thú y, 14 (2): 56-59. 3. Th Vi t Thu Nguy n c Hi n, 2012. Giáo trình B nh Truy n Nhi m Gia Súc Gia C m. Nhà xu t b n i h c C n Th : 211-215. 4. John Carr, 2001. H i ch ng b nh hô h p c a l n. Ng i d ch: Nguy n Ti n ng. T p chí khoa h c k thu t thú y, (4): 89-93. 5. Lê V n D ng, Nguy n Quang Tuyên, Cù H u Phú Hoàng ng Huy n, 2012. K t qu phân l p xác nh m t s c tính sinh h c c a ch ng Actinobacillus pleuropneumoniae l n d ng tính v i virus r i lo n hô h p sinh s n t i t nh B c Giang. p chí khoa h c k thu t thú y, 19 (3): 45-50. 6. Ngô Phú C ng, 2010. Kh o sát b nh tích ph i heo t i lò m phân p vi khu n APP ki m tra tính nh y c m c a vi khu n v i m t s kháng sinh. Lu n v n t t nghi p cao h c ngành Thú Y. i h c C n Th , C n Th . 7. Nguy n Qu c Huy, Lê V n D ng, Nguy n Quang Tuyên, Cù H u Phú Hoàng ng Huy n, 2013. Xác nh c l c kh n ng m n c m v i kháng sinh c a ch ng Actinobacillus pleuropneumoniae phân l p t l n m c PRRS t i t nh B c Giang. p chí khoa h c k thu t thú y, 20(5): 54-60. 8. Nguy n Th Thu H ng, Ng c Thúy, Cù H u Phú, Tr ng V n Dung, Âu Xuân T n Lê Th Minh H ng, 2009. ng d ng k thu t PCR xác nh c t (Apx) có vi khu n Actinobacillus pleuropneumoniae phân l p t n b nh t i m t s t nh phía B c Vi t Nam. p chí khoa h c k thu t thú y, 16 (4): 51-57. 9. Phan Th Kim Duyên, 2011. Nuôi c y, phân l p ki m tra tính nh y c m i i kháng sinh c a vi khu n Actinobacillus Pasteurella gây b nh ng hô p heo t i t nh ng Tháp. Lu n v n t t nghi p Bác s Thú Y, khoa Nông Nghi p & Sinh H c ng D ng, tr ng i h c C n Th . 10. Th Chành a, 2007. B c u Kh o sát b nh ng hô h p heo sau cai a n xu t chu ng t i tr i th c nghi m Khoa Nông Nghi p & Sinh H c ng D ng. Lu n v n t t nghi p Bác s Thú Y, Khoa Nông Nghi p & Sinh c ng D ng, Tr ng i h c C n Th . 47 11. Tiêu Quang An Nguy n H u Nam, 2011. Xác nh m t s vi khu n k phát gây ch t l n vùng d ch tai xanh huy n V n Lâm – H ng Yên m 2010. p chí khoa h c k thu t thú y, 18 (3): 53-60. 12. Tô H , Iwata Akira Nagai Shinya, 2014. Actinobacillus pluropneumoniae: type huy t thanh, c l c ch n oán phòng thí nghi m. p chí khoa h c thu t thú y, 21(3): 91-97. 13. Tr nh Quang Hi p, Cù H u Phú, Nguy n Thu H ng, Âu Xuân Tu n (2004), “Xác nh c tính sinh v t hoá h c, c l c c a vi khu n Actinobacillus, Pasteurella Streptocococcus gây b nh viêm ph i l n”, T p chí khoa h ccông ngh c a B Nông nghi p PTNT (4), tr. 476-477. 14. Tr ng Th Thu Th o, 2012. S l u hành c a m t s vi khu n ng hô p c a heo t i t nh ng Tháp, Sóc Tr ng TP. C n Th . Lu n v n t t nghi p cao h c ngành Thú Y. i h c C n Th , C n Th . 15. Võ Phong V Anh Tu n Athipoo Nuntaprasert, 2011. Phát hi n gene apxIV c a vi khu n A. pleuropneumoniae phân l p heo nuôi th t Thái Lan n m 2011. T p san Khoa h c Giáo d c, (2): 85-87. 16. Ng c Quý, 2008. Xác nh vai trò gây b nh viêm ph i màng ph i l n a vi khu n Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida th nghi m vaccine phòng b nh. Lu n v n Th c s Nông Nghi p. i h c Nông Nghi p Hà N i. Tài li u ti ng Anh 1. Archambault M., S. Rioux and M. Jacques, 1999. Evaluation of the hemoglobin binding activity of Actinobacillus pleuropneumoniae using fluorescein labeled pig hemoglobin and flow cytometry. FEMS Microbiol Lett, 173: 17-25. 2. Bauer A. W., Kirby W. M., Sherris J. C. and Turck M., 1966. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Amer. J. Clin. Pathol., 45: 493-496. 3. Belanger M., D. Dubreuil, J. Harel, C. Girard and M. Jacques, 1990. Role of lipopolysaccharide in adhenrence of Actinobacillus pleuropneumoniae to porcine tracheal rings. Infect. Immun., 58: 3523-3530. 4. Chang Chao-Fu, Tung-Mao Yeh, Chin-Cheng Chou, Yung-Fu Chang and Tai-Sheng Chiang, 2002. Antimicrobial susceptibility and plasmid analysis of Actinobacillus pleuropneumoniae isolated in Taiwan. Veterinary Microbiology, 84: 169-177. 5. Chiers K., Freddy H., Ingrid V. O., Gerard C. and Richard D., 1999. Early in vivo interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with tonsils of pigs. Veterinary Microbiology, 68: 301-306. 48 6. Christensen G and Mousing J., 1992. Respiratory System. Eds: A. D. Leman, B. Straw, W. L. Mengeling, S. D’Allaire and D. J. Taylor. Disease of swine. Iowa State University Press, Ames, 138-162. 7. Clinical and Laboratory Standards Institute, 2012. Performance Standards For Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement: p.172. 8. Diarra M. S., J. A. Dolence, E. K. Dolence, I. Darwish, M. J. Miller, F. Malouin and M. Jacques, 1996. Growth of Actinobacillus pleuropneumoniae is promoted by exogenous hydroxamate and catechol siderophores. Appl. Environ. Microbiol, 62: 853-859. 9. Fittipaldi N., Andre B., Josee H., Marylene K. and Marcelo G., 2003. Evaluation and field validiation of PCR test for detection of Actinobacillus pleuropneumoniae in subclinically infected pigs. Journal of Clinical Microbiology, 41(11): 5085-5093. 10. Frey J., Bosse J. T., Chang Y. F., Cullen J. M., Fenwick B. et al., 1993. Actinobacillus pleuropneumoniae RTX toxins: Uniform designation of haemolysins, cytolysins pleurotocin and their genes. Journal of General Microbiology, 139: 1723-1728. 11. Frey J., 1995. Virulence in Actinobacillus pleuropneumoniae and the RTX toxins. Trends in Microbiol, 3(7): 257 – 261. 12. Gerlach G. F., S. Klashsinsky, C. Anderson, A. A. Porter and P. J. Willson, 1992. Characterization of two genes encoding distinct transferring binding proteins in diffirent Actinobacillus pleuropneumoniae isolates. Infect Immun, 60: 3253-3261. 13. Gottschalk Marcelo and Taylor David J., 2006. Actinobacillus pleuropneumoniae. Diseases of Swine (9th edition). Straw B. E., Zimmerman J. J., D’Allaire S., Taylor D. J. (eds). Blackwell Publishing Company, Ames, Iowa: 563-576. 14. Gottschalk Marcelo., 2012. Actinobacillosis. Diseases of Swine (10th edition). Jeffrey J. Zimmerman, Locke A. Karriker, Alejandro Ramirez, Kent J. Schwartz, Gregory W. Stevenson. Blackwell Publishing Company, Ames, Iowa: 653-669. 15. Gram T., Ahrens P. and Nielsen J.P., 1996. Evaluation of a PCR for detection of Actinobacillus pleuropneumoniae in mixed bacterial cultures from tonsils. Vet. Microbiol, 51 (1-2): 95-104. 16. Jacobsen M. J. and Nielsen J. P., 1995. Development and evaluation of a selective and indicate medium for isolation of Actinobacillus pleuropneumoniae from tonsils. Veterinary Microbiology, 47: 191-197. 49 17. Jacques M., 2004. Surface polysacpcharides and iron-uptake systems of Actinobacillus pleuropneumoniae. The Canadian Journal of Veterinary Research, 68:81-85. 18. Jansen R., J. Briaire, E. M. Kamp, A. Gielkens and M. A. Smitts, 1993. Structure analysis of the Actinobacillus pleuropneumoniae RTX-toxin-I (ApxI) operon. Infect. Immun., 61: 3688-3695. 19. Jensen A. E. and T. A. Bertram, 1986. Morphological and biochemical comparison of virulent and avirulent isolates of Haemophilus pleuropneumoniae serotype 5. Infect Immun, 52: 419-424. 20. Kamp E. M., Popma J. K., Anakotta J. and Smits M. A., 1991. Identification of hemolytic and cytotoxic proteins of Actinobacillus pleuropneumoniae by using monoclonal antinodies. Infection and Immunity, 59: 3079-3085. 21. Kamp E. M., Vermeulen T. M., Smits M. A. and Haagsma J., 1994. Production of Apx toxins by field strains of Actinobacillus pleuropneumoniae and Actinobacillus suis. Infection and Immunity, 62: 4063-4065. 22. Kucerova Z., Jaglic Z., Ondriasova R. and Nedbalcova K., 2005. Serotype distribution of Actinobacillus pleuropneumoniae isolated from porcine pleuropneumoniae in the Czech Republic during period 2003-2004. Vet. Med., 50 (8): 355-360. 23. Lo T. M., Christine K. W. and Inzana T. J., 1998. Detection and identification of Actinobacillus pluropneumoniae serotype by multiplex PCR. Journal of Clinical Microbiology, 36(6): 1704-1710. 24. Loera-Muro A., Francisco J. Avelar-Gozález, Victor M. Loera-Muro, Mario Jacques, and Alma L. Guerrero-Barrera, 2013. Presence of Actinobacillus pleuropneumoniae, Streptococcus suis, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Haemophilus parasuis and Mycoplasma hyopneumoniae in upper respiratory tract of swine in farms from Aguascalientes, Mexico. Open Journal of Animal Sciences, (2): 132-137. 25. MacInnes J. I. and S. Rosendal, 1988. Prevention and control of Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae infection in swine: A review. Can. Vet. J, 572-573. 26. MacInnes J. I., Gottschalk M., Lone A. G., Metcalf D. S., Ojha S., Rosendal T. and Watson S. B., 2008. Prevalence of Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, and Streptococcus suis in representative Ontario swine herds. Can J Vet Res., 72 (3): 242-248. 27. Marois C., Cariolet R., Morvan H. and Kobisch M., 2008. Transmission of pathogenic respiratory bacteria to specific pathogen free pigs at slaughter. Vet Microbiol., 129 (3-4): 325-332. 50 28. Moller K. and Kilian M., 1990. V factor-dependent members of the family Pasteurellaceae in the porcine upper respiratory tract. J Clin Microbiol. Dec; 28 (12): 2711-2716. 29. Nicolet J., 1992. Actinobacillus pleuropneumoniae. Eds: A. D. Leman, B. Straw, W. L. Mengeling, S. D’Allaire and D. J. Taylor. Disease of swine. Iowa State University Press, Ames, 401-408. 30. Quinn P. J., B. K. Markey, F. C. Leonard, E. S. FitzPatrick, S. Fanning and P. J. Hartigan, 2011. Chapter 26: Actinobacillus species. Veterinary Microbiology and Microbal disease. Wiley – Blackwell: 420-430. 31. Rayamajhi N., Shin S. J., Kang S. G., Lee D. Y., Ahn J. M., and Yoo H. S., 2005. Development and use of a multiplex polymerase chain reaction assay based on Apx toxin genes for genotypeing of Actinobacillus pleuropneumoniae isolates. J Vet Diagn Invest, 17 (4): 359-362. 32. Schaller A., Kuhn R., Kuhnert P. et al., 1999. Characterization of apxIVA, a new RTX determinant of Actinobacillus pleuropneumoniae. Microbiology, 145: 2015-2116. 33. Schaller A., Djordjevic S. P., Eames G. J., Forbes W. A., Kuhn R. et al., 2001. Identification and detection of Actinobacillus pleuropneumoniae by PCR based on the gene apxIVA. Veterinary microbiology, 79: 47-62. 34. Sidibé M., Serge Messier, Serge Lariviere, Marcelo Gottschalk and Khyali R. Mittal, 1993. Detection of Actinobacillus pluropneumoniae in the porcine upper respiratory tract as a complement to serological tests. Can J Vet Res, 57: 204-208. 35. Sthitmatee N., Theerapol S., Luksana M., Thavajchai S. and Ted T., 2003. Identification of the Actinobacillus pluropneumoniae serotype using PCR base-apx genes. Molercular and Cellular Probes, 17: 301-305. 36. Tonpitak W, 2010. Isolation of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 15-like strain from a porcine tonsil in Thailand: A case report. Thai J. Vet. Med., 40(3): 343-348. 37. Ward C. K. and Inzana T. J., 1997. Identification and Characterization of a DNA region involved in the export of capsular polysaccharide by Actinobacillus pluropneumoniae serotype 5a. Infection and Immunity, 65(6): 2491-2496. Tài li u t internet. 1. http://vietdvm.com/heo/benh-tren-heo/item/451-benh-viem-mang-phoi-trenheo-app.html 2. http://www.respig.com/diseases/app.asp 3. http://www.tgw1916.net/pathology_pigs.html 51 4. http://www.respig.com/diseases/app.asp 5. https://www.agriculture.gov.ie/animalhealthwelfare/laboratoryservices/region alveterinarylaboratoryreports/rvlmonthlyreports2009/april2009rvlmonthlyrep ort/ 6. http://thuyduyenhung.com/index.php/cau-h-i-thu-ng-g-p/176-benh-tranmang-phoi-o-lon 7. OIE, 2009. In Mia Kim (FAO), Jan Pedersen (USDA-APHIS). Collection of Specimens for Detection of Influenza from Swine. http://www.offlu.net/index.php?id=184 8. White M, 2012a. Respiratory Disease in Growing pigs Module, part acute respiratory disease. http://www.nadis.org.uk/bulletins/respiratory-disease-in-growing-pigsmodule/part-1-acute-respiratory-disease.aspx 9. White M, 2012b. Respiratory Disease in Growing pigs Module, part chronic respiratory disease. http://www.nadis.org.uk/bulletins/respiratory-disease-in-growing-pigsmodule/part-2-chronic-respiratory-disease(2).aspx 52 PH CH NG So sánh t l heo có d u hi u b nh hô h p theo t nh Tr s kh o sát Nghi m th c m ud 55 90 86 92 323 n Th ng Tháp Trà Vinh n Tre ng c t Chi-Square Test: D ng S m u âm 2.335 1.631 1.580 1.688 7.234 ng hàng 2.390 1.721 1.666 1.780 7.557 ng tính, Âm tính Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts D ng tính 55 102.15 21.765 Âm tính 2335 2287.85 0.972 Total 2390 90 73.56 3.675 1631 1647.44 0.164 1721 86 71.21 3.073 1580 1594.79 0.137 1666 92 76.08 3.331 1688 1703.92 0.149 1780 Total 323 7234 7557 Chi-Sq = 33.266, DF = 3, P-Value = 0.000 So sánh t l heo có d u hi u b nh hô h p gi a C n Th Nghi m th c n Th ng Tháp ng c t Tr s kh o sát m ud 55 90 145 ng 53 S m u âm 2.335 1.631 3.966 ng Tháp ng hàng 2.390 1.721 4.111 Chi-Square Test: D ng tính, Âm tính Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts D ng tính 55 84.30 10.183 Âm tính 2335 2305.70 0.372 Total 2390 90 60.70 14.141 1631 1660.30 0.517 1721 Total 145 3966 4111 Chi-Sq = 25.213, DF = 1, P-Value = 0.000 So sánh t l heo có d u hi u b nh hô h p gi a C n Th Trà Vinh Tr s kh o sát Nghi m th c m ud 55 86 141 n Th Trà Vinh ng c t Chi-Square Test: D ng S m u âm 2.335 1.580 3.915 ng hàng 2.390 1.666 4.056 ng tính, Âm tính Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts D ng tính 55 83.08 9.493 Âm tính 2335 2306.92 0.342 Total 2390 86 57.92 13.619 1580 1608.08 0.490 1666 Total 141 3915 4056 Chi-Sq = 23.944, DF = 1, P-Value = 0.000 54 So sánh t l heo có d u hi u b nh hô h p gi a C n Th B n Tre Tr s kh o sát Nghi m th c m ud 55 92 147 n Th n Tre ng c t Chi-Square Test: D ng ng hàng S m u âm 2.335 1.688 4.023 2.390 1.780 4.170 ng tính, Âm tính Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts D ng tính 55 84.25 10.156 Âm tính 2335 2305.75 0.371 Total 2390 92 62.75 13.637 1688 1717.25 0.498 1780 Total 147 4023 4170 Chi-Sq = 24.662, DF = 1, P-Value = 0.000 So sánh t l heo có d u hi u b nh hô h p gi a Tr s kh o sát Nghi m th c m ud 90 86 176 ng Tháp Trà Vinh ng c t Chi-Square Test: D ng Tháp Trà Vinh ng S m u âm 1.631 1.580 3.211 ng hàng 1.721 1.666 3.387 ng tính, Âm tính Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts D ng tính 90 89.43 0.004 Âm tính 1631 1631.57 0.000 Total 1721 86 86.57 0.004 1580 1579.43 0.000 1666 Total 176 3211 3387 55 Chi-Sq = 0.008, DF = 1, P-Value = 0.930 So sánh t l heo có d u hi u b nh hô h p gi a Tr s kh o sát Nghi m th c m ud 90 92 182 ng Tháp n Tre ng c t Chi-Square Test: D ng Tháp B n Tre ng S m u âm 1.631 1.688 3.319 ng hàng 1.721 1.780 3.501 ng tính, Âm tính Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts D ng tính 90 89.47 0.003 Âm tính 1631 1631.53 0.000 Total 1721 92 92.53 0.003 1688 1687.47 0.000 1780 Total 182 3319 3501 Chi-Sq = 0.007, DF = 1, P-Value = 0.935 So sánh t l heo có d u hi u b nh hô h p gi a Trà Vinh B n Tre Tr s kh o sát Nghi m th c m ud 86 92 178 Trà Vinh n Tre ng c t Chi-Square Test: D ng S m u âm 1.580 1.688 3.268 ng hàng 1.666 1.780 3.446 ng tính, Âm tính Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts D ng tính 86 86.06 0.000 Âm tính 1580 1579.94 0.000 Total 1666 92 91.94 1688 1688.06 1780 56 Total 0.000 0.000 178 3268 3446 Chi-Sq = 0.000, DF = 1, P-Value = 0.993 So sánh t l phân l p c vi khu n Actinobacillus spp. d a vào ph n ng sinh hóa theo t nh Tr s kh o sát Nghi m th c m ud 2 12 n Th ng Tháp Trà Vinh n Tre ng c t m= n= Tr s Chi Bình Ph ng 0.93125 T P (Ho) = 0.81788 NS K t qu phân l p ch n nuôi ng S m u âm 2 1 Tr s kh o sát Nghi m th c m= n= Tr s Chi Bình Ph ng 1.10938 T P (Ho) = 0.29222 NS 18 c vi khu n Actinobacillus spp. theo ph Tr i h Tr i kín ng c t ng hàng m ud 12 57 ng S m u âm ng th c ng hàng 10 18 So sánh t l phân l p theo t nh Nghi m th c n Th ng Tháp Trà Vinh n Tre ng c t H0 : PA =PB EPT = t qu : NS c vi khu n APP d a vào gene Tr s kh o sát m ud 1 3.272727 58 ng S m u âm 2 c t ApxIVA ng hàng 2 12 [...]... n Th và l y m u b nh ph m th c hi n tài: Phân l p và xác nh gene c l c ApxIVA c a vi khu n Actinobacillus pleuropneumoniae gây b nh vi m ph i – màng ph i trên heo t i lò m thành ph C n Th ” c tiêu c a tài Xác nh t l nhi m vi khu n APP trên heo b nh hô h p t i lò m thành ph C n Th Xác nh tính kháng c a vi khu n APP v i m t s lo i kháng sinh 2 CH NG 2 S LÝ LU N 2.1 Tình hình nghiên c u vi khu n Actinobacillus. .. H u Phú và ctv., 2005) ng Xuân Bình và ctv (2007), ã phân l p c vi khu n Actinobacillus pleuropneumoniae v i t l m u d ng tính là 37,83% trong t ng s 37 b nh ph m ph i heo có tri u ch ng, b nh tích vi m dính màng ph i t i hai t nh là Hà Tây và Thái Nguyên Trong nghiên c u Xác nh vai trò gây b nh vi m ph i – màng ph i trên heo a vi khu n Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và th nghi...TÓM L C Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) là nguyên nhân gây b nh vi m ph i màng ph i trên heo, b nh lan r ng kh p th gi i và là nguyên nhân gây t n th t kinh t nghiêm tr ng nh ng tr i nuôi heo Ti n hành phân l p vi khu n APP t 18 m u b nh ph m, c l y lò m Thành ph C n Th trong th i gian t tháng 01/2014 t i tháng 08/2014 Vi khu n APP c xác nh d a vào gene c l c apxIVA b ng ph ng pháp PCR và ki m... khám heo b nhi m A pleuropneumoniae th c p tính (http://www.respig.com/diseases/app.asp) Hình 2.4: Ph i xu t huy t và ho i t (http://www.tgw1916.net/pathology_pigs.html) 14 heo b nh vi m ph i - màng ph i Hình 2.5: Màng ph i vi m dính có t huy t heo b nh vi m ph i - màng ph i th mãn tính (http://www.respig.com/diseases/app.asp) Hình 2.6: Heo 3 tháng tu i b vi m ph i - màng ph i Actinobacillus pleuropneumoniae. .. qu phân l p c vi khu n Actinobacillus pleuropneumoniae i t l 3,49% Thái Bình, 7,78% H i Phòng, và 8,33% Hà Tây (V Ng c Quý, 2008) Nguy n Th Thu H ng và ctv (2009), ã ti n hành th c hi n hai ph n ng multiplex PCR xác nh s hi n di n c a các gene ngo i c t (Apx) có trong các ch ng vi khu n APP gây b nh vi m ph i – màng ph i heo phân l p t i mi n B c Vi t Nam Ph n ng multiplex PCR 1: dùng xác nh các gene. .. Actinobacillus pleuropneumoniae gây nh vi m ph i – màng ph i trên heo trong và ngoài n c 2.1.1 Tình hình nghiên c u trong n c Trong quá trình xác nh nguyên nhân gây b nh ng hô h p trên heo nuôi i m t s t nh Mi n B c, Cù H u Phú và c ng s ã phân l p c vi khu n Actinobacillus pleuropneumoniae v i t l 0,19% trong t ng s 53 m u ph i m khám và h ch lympho; 7,93% trên t ng s 542 m u d ch ngoáy m i Tác gi ng cho bi t vi. .. i các b nh tích gây ra b i các tác nhân vi khu n sinh m nh A pyogenes, Staphylococcus aureus ng th i, khi ch n oán b nh vi m ph i – màng ph i do APP gây nên c n ph i phân bi t v i các b nh khác nh vi m ph i a ph ng do Mycoplasma, h i ch ng r i lo n sinh s n và hô h p heo (PPRS), b nh cúm và vi m ph i do Salmonella choleraesuis,… và ch n oán phân bi t v i m t s vi khu n khác trong h Pasteurellae nh P... là: ApxI, ApxII, ApxIII và ApxIV (1 và 2) Riêng gene ApxIVcó m t t t 15 ch ng huy t thanh h c c a vi khu n APP và r t h u ích phát hi n t t c 15 ch ng c a vi khu n APP (Sthitmatee et al., 2003) Vi t Nam, b nh vi m ph i vi m màng ph i ã có t lâu nh ng b nh ch c nghiên c u t n m 1996 n nay t i B môn vi trùng (Vi n Thú y) khi phân l p c vi khu n A pleuropneumoniae t heo b nh m t s a ph ng thu c vùng ng... ra qua vi c a ng v t m i vào àn S v n chuy n và tr n àn làm t ng s l ng heo m c b nh vi m ph i – màng ph i.Các y u t khác nh m t àn quá ông, u ki n khí h u thay i t ng t nh t là khi có s thay i nhi t , m không khí cao và thông thoáng kém làm s phát tri n và lan truy n b nh nhanh có nh h ng l n n s ng heo m c b nh và ch t Do ó không ng c nhiên khi th y t l các t bùng phát cao nh t heo ang l n và heo chu... d u hi u lâm sàng Hình 2.1: Heo b nh vi m ph i – màng ph i th quá c p tính (http://vietdvm.com /heo/ benh-tren -heo/ item/451-benh-viem-mang-phoi-tren -heo- app.html) 12 + Th c p tính: : thân nhi t heo t ng (s t t 40,5 – 41 oC), i l i khó kh n, m t i, da , con v t tr nên r và n ít hay b n Nh ng tri u ch ng hô h p d i nh khó th , ho và th nh tho ng th b ng mi ng Do suy hô h p và suy tim n n t máu nh ng b . NGHIP VÀ SINH HC NG DNG  MÔN THÚ Y BÙI TÂN THIN PHÂN LP VÀ XÁC NH GENE C LC APXIVA CA VI KHUN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE GÂY BNH VI M PHI – MÀNG PHI TRÊN HEO TI LÒ M THÀNH. NGHIP VÀ SINH HC NG DNG  MÔN THÚ Y BÙI TÂN THIN PHÂN LP VÀ XÁC NH GENE C LC APXIVA CA VI KHUN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE GÂY BNH VI M PHI – MÀNG PHI TRÊN HEO TI LÒ M THÀNH. NGHIP VÀ SINH HC NG DNG  MÔN THÚ Y  tài: Phân lp và xác nh gene c lc ApxIVA ca vi khun Actinobacillus pleuropneumoniae gây bnh vi m phi – màng phi trên heo i lò m thành