phân lập và xác định gen độc tổ của vibrio trong hải sản tươi sống ở nha trang

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2012 THÔNG BÁO KHOA HỌC PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH GEN ĐỘC TỐ CỦA VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS TRONG HẢI SẢN TƯƠI SỐNG Ở NHA TRANG ISOLATION AND DETECTION OF TOXIN GENES OF VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS IN FRESH SEAFOOD IN NHA TRANG Nguyễn Văn Duy1, Nguyễn Thị Cẩm Ly2 Ngày nhận bài: 16/06/2011; Ngày phản biện thơng qua: 28/09/2011; Ngày duyệt đăng: 10/06/2012 TĨM TẮT Tiêu thụ hải sản tươi sống ngun nhân bệnh tiêu hóa cấp vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra. Vi khuẩn gây nhiễm trùng vết thương nhiễm trùng huyết phổ biến hơn. Cho đến chế gây bệnh V. parahaemolyticus chưa nghiên cứu đầy đủ. Mục đích nghiên cứu phân lập xác định số gen độc tố V. parahaemolyticus từ mẫu hải sản chợ thành phố Nha Trang. Sử dụng kỹ thuật PCR giải trình tự gen, chúng tơi phát gen điều hòa độc tố toxR gen mã hóa độc tố hemolysin khơng bền nhiệt tlh có mặt tất năm chủng phân lập được. Tuy nhiên, khơng tìm thấy chủng dương tính với gen tdh trh mã hóa độc tố hemolysin bền nhiệt. Có thể sử dụng kết nghiên cứu làm sở khoa học cho việc xây dựng phương pháp phát nhanh vi khuẩn mẫu hải sản, phát triển vaccin điều trị bệnh Vibrio gây ra, cho nghiên cứu độc tính hemolysin từ Vibrio Việt Nam. Từ khóa: Hemolysin, hải sản, tlh, toxR, Vibrio parahaemolyticus ABSTRACT The consumption of raw or undercooked seafood is the predominant reason of the acute gastroenteritis caused by Vibrio parahaemolyticus. Primary septicemia and wound infections also occur, but are less common than seafood-borne disease. Up to date the disease mechanism of V. parahaemolyticus infections has not been fully elucidated. The aim of the present work is to isolate and detect some toxin genes of V. parahaemolyticus from seafood samples in some markets in Nha Trang city. Using PCR and sequence analysis, we detected the presence of the toxin regulatory gene toxR and thermolabile hemolysin gene tlh in all five isolated strains but none of thermostable hemolysin genes tdh and trh were found. Our results contribute into establishing a rapid bacterial detection method in seafood, developing a future vaccine against pathogenic Vibrio and building a scientific basis for further research on toxicity of hemolysins in Vibrio in Vietnam. Keywords: Hemolysin, seafood, tlh, toxR, Vibrio parahaemolyticus I. ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus tác nhân phổ biến gây ngộ độc thực phẩm nhiều nước châu Á Trung Quốc, Nhật Bản Đài Loan, châu Âu Tây Ban Nha, Pháp khắp Châu Mỹ, điển hình Hoa Kỳ (Daniels et al., 2000). Tại Việt Nam từ năm 1999 đến 2008 có khoảng 1000 vụ ngộ độc thực phẩm báo cáo với 25.000 người mắc, có 300 người tử vong. Riêng tỉnh Khánh Hòa, từ 1995 đến 2001 có 548 ca tiêu chảy (Tuyet et al., 2002), từ năm 2001 đến 2008 có 215 ca ngộ độc thực phẩm, có ca tử vong. Phân tích vi sinh cho thấy số 548 trường hợp tiêu chảy trên, có 53% dương tính với V. parahaemolyticus. V. parahaemolyticus gây viêm đường tiêu hóa, nhiễm trùng vết thương nhiễm trùng huyết người. Nhiễm trùng huyết mối đe dọa ng- TS. Nguyễn Văn Duy: Viện Cơng nghệ Sinh học & Mơi trường - Trường Đại học Nha Trang Nguyễn Thị Cẩm Ly: Sinh viên Khóa 49 Ngành CNSH - Trường Đại học Nha Trang 42 ❖ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản hiêm trọng sinh vật gây bệnh lây lan nhanh độc tố chúng sinh tồn lâu dài lưu thơng máu. Theo khóa phân loại Bergey, V. parahaemolyticus vi khuẩn Gram âm, hình dấu phẩy, có tiêm mao đầu, di động, kỵ khí tùy tiện ưa mơi trường kiềm mặn. Chúng thường sống cửa sơng ven biển hầu hết vùng giới. Người ta phân lập chúng cát, bùn nước biển, hải sản (Vesth et al., 2010). V. parahaemolyticus gây bệnh người thơng qua tiêu thụ hải sản nấu chưa chín qua vết thương tiếp xúc với động vật biển vùng nước ấm ven biển, đặc biệt Đơng Nam Á. Tuy nhiên, khơng phải chủng V. parahaemolyticus gây bệnh chúng mang gen độc tố khác nhau. Trong số đó, hemolysin loại độc tố phổ biến lồi Vibrio gây bệnh. Đây ngoại độc tố làm phân giải tế bào hồng cầu giải phóng hemoglobin. Ở lồi V. parahaemolyticus, có ba gen độc tố hemolysin bao gồm tdh trh mã hóa hemolysin bền nhiệt tlh mã hóa hemolysin khơng bền nhiệt. Cả hai gen tdh trh nằm operon độc tố Vp-toxRS, điều hòa gen toxR có trình tự bảo tồn cao lồi (Nishibuchi & Kaper, 1995). II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Chuẩn bị mẫu phân lập vi khuẩn V. parahaemolyticus Tổng số mẫu tơm bạc, mẫu tơm sú, mẫu cua biển mẫu mực ống thu mua từ chợ thành phố Nha Trang vào tháng 4/2010. Mỗi 1g phần nội tạng mẫu bổ sung ml dung dịch APW (alkaline peptone water) bao gồm pepton 10 g/l NaCl 30 g/l pH 8,5, sau ủ 370C 6-8 để tăng sinh vi sinh vật. Sau tăng sinh, vi khuẩn Vibrio phân lập mơi trường chọn lọc TCBS (Thiosulfate citrate bile sucrose agar) (Marlina et al., 2007) pH 8,6, 370C 24 giờ. Xác định đặc điểm hình thái hóa sinh (khả chịu muối, lên men đường, sử dụng lysin) theo mơ tả Trần Linh Thước (2007). Dựa vào khóa phân loại Bergey để sơ lựa chọn chủng V. parahaemolyticus cho nghiên cứu tiếp theo. 2. Tách chiết DNA hệ gen V. parahaemolyticus Các chủng vi khuẩn ni mơi trường LB với 3% NaCl, lắc 18 Số 2/2012 150 vòng/phút. Dịch ni cấy ly tâm 13.000 vòng/phút phút 4OC để thu tế bào (Luan et al., 2007). DNA tổng số tách chiết kit Wizard® SV Genomic DNA (Promega) theo hướng dẫn nhà sản xuất sau bảo quản 40C. 3. Xác định gen độc tố kỹ thuật PCR Để xác định gen độc tố toxR, tdh, trh tlh, cặp mồi tương ứng tổng hợp IDT (Mỹ) có trình tự nucleotide trình bày Bảng (Luan et al., 2007; Marlina et al., 2007). Phản ứng PCR chuẩn bị thể tích 50µl với thành phần nồng độ cuối sau: DNA (2-20 ng), mồi (0,1µM), dNTP (0,4µM), MgCl2 (2 mM), Taq polymerase (1,25 U) đệm Tag (1X). Chu kì nhiệt chạy với pha đầu 94OC phút, 35 chu kì gồm giai đoạn 94, 50 720C, giai đoạn phút, pha cuối 72OC phút. Sản phẩm PCR điện di gel agarose - 1,5% đệm TBE 0,5X, sau nhuộm với ethidium bromide đọc kết máy chụp ảnh gel (Biorad). 4. Giải phân tích trình tự Sản phẩm PCR tinh kit PCR clean up system (Promega) theo hướng dẫn nhà sản xuất sử dụng làm khn trực tiếp cho phản ứng tiền giải trình tự theo ngun tắc dye-labelled dideoxy terminator (Big Dye Terminator v. 3.1, Applied Biosystems) với cặp mồi toxR-F/toxR-R tlh-F/tlh-R theo chương trình nhiệt sau: 960C 20 giây, 500C 20 giây 600C phút. Sản phẩm phản ứng phân tích máy phân tích trình tự tự động ABI Prism 3700 DNA Analyser (Applied Biosystems). Các trình tự phân tích, chỉnh sửa phần mềm BioEdit 7.1.3.0, so sánh với trình tự nucleotide tương đồng Genbank suy diễn tới trình tự amino acid tương ứng chương trình BLAST (www.ncbi.nlm.nih. gov/blast/). III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Phân lập chủng Vibrio parahaemolyticus từ mẫu hải sản tươi sống Chúng tơi thu tổng số 40 chủng vi khuẩn có đặc điểm hình thái khuẩn lạc đa dạng. Trong số đó, có 24 (60%) chủng mang đặc điểm hình thái vi khuẩn Vibrio, kí hiệu từ C1-C24. Điều phù hợp với thơng báo trước có khoảng 50% số chủng phân lập từ nước biển TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ❖ 43 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản nhuyễn thể hai mảnh vỏ có khuẩn lạc mọc mơi trường TCBS thuộc chi Vibrio chủng lại Aeromonas, Pseudomonas, Flavobacterium, Pasteurella hay Agrobacterium (Croci et al., 2001). Các khuẩn lạc màu xanh Số 2/2012 thường V. parahaemolyticus V. cholerae V. alginolyticus có khuẩn lạc màu vàng lên men đường sucrose mơi trường TCBS. Các khuẩn lạc có màu sắc khác sinh trường yếu chưa xác định. Hình 1. Khuẩn lạc (trái) tế bào nhuộm Gram (phải) chủng V. parahaemolyticus C1 Bảng 1. Trình tự nucleotide cặp mồi Mồi toxR-F Trình tự oligonucleotide (5´- 3´) GTCTTCTGACGCAATCGTTG Bảng 2. Đặc điểm hóa sinh chủng Cơ chất Chủng C1 C2 C7 C15 C23 - - - - - ++ ++ ++ ++ ++ + + + + + - - - - - toxR-R ATACGAGTGGTTGCTGTCATG tdh-F GTAAAGGTCTCTGACTTTTGGAC tdh-R TGGAATAGAACCTTCATCTTCACC Lactose - - - - - trh-F TTGGCTTCGATATTTTCAGTATCT Arabinose + + + + + trh-R CATAACAAACATATGCCCATTTCC Sucrose - - - - - tlh-F AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG Maltose + + + + + tlh-R GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC NaCl (%) Mannitol + + + + + Lysin + + + + - Chú thích: (+): sinh trưởng, (-): khơng sinh trưởng Dựa theo khóa phân loại Bergy, chúng tơi lựa chọn chủng (C1, C2, C7, C15, C23) có đặc điểm hình thái tương tự với vi khuẩn V. parahaemolyticus như: khuẩn lạc hình tròn, bờ đều, màu xanh xanh đậm, tế bào hình phẩy khuẩn, nhuộm Gram âm tính, đường kính - 4mm (Hình 1). Về đặc tính hóa sinh, tất chủng có khả chịu mặn khoảng - 6% NaCl, lên men đường arabinose, maltose, mannitol khơng lên men đường lactose sucrose. Ngoại trừ chủng C23, tất chủng có khả sử dụng lysin (Bảng 2). Do đó, tất chủng tiếp tục giữ lại để nghiên cứu mức độ phân tử. 44 ❖ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG 2. Xác định gen độc tố chủng Vibrio kỹ thuật PCR Kết điện di từ Hình cho thấy, sản phẩm PCR dài khoảng 370 bp 450 bp tương ứng với đoạn gen toxR đoạn gen tlh phát tất chủng Vibrio. Gen toxR có trình tự bảo tồn đặc trưng cho V. parahaemolyticus (Nishibuchi, Kaper, 1995) nên sản phẩm PCR quan sát chứng xác nhận chủng nghiên cứu thuộc lồi vi khuẩn này. Gen tlh mã hóa độc tố hemolysin khơng bền nhiệt TLH. Độc tố bị bất hoạt 60 oC 10 phút tính độc người chưa nghiên cứu, có mặt gen tlh tất chủng V. parahaemolyticus phân Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản lập cho thấy tiềm gây bệnh chúng người ăn sống hải sản lớn. Tuy nhiên, khơng có chủng phát mang gen tdh trh mã hóa độc tố hemolysin bền nhiệt. Kết phù hợp Số 2/2012 với nghiên cứu trước cho thấy gần tất mẫu từ mơi trường khơng có (Iida et al., 1997) có với tỉ lệ thấp - 5% (Nishibuchi, Kaper, 1995) chủng mang gen này. Hình 2. Sản phẩm khuếch đại đoạn gen toxR tlh chủng Vibrio M: Marker kb; 1- chủng C1; 2- chủng C2; 3- chủng C7; 4- chủng C15; 5- chủng C23 3. Giải trình tự đoạn gen độc tố toxR tlh V. parahaemolyticus Kết giải trình tự đoạn gen toxR tlh hai chủng C1 C2 cho thấy trình tự đoạn gen toxR tlh chủng hồn tồn giống với tổng số 366 bp 451 bp tương ứng. Thơng tin hai trình tự gửi lưu trữ Ngân hàng Gen Quốc tế (Genbank) với số hiệu gen toxR JQ929913 tlh JQ929914. Theo Bảng 3, so sánh với trình tự tương đồng toxR Genbank chương trình BLAST xác nhận chắn chủng C1 C2 thuộc lồi Vibrio parahaemolyticus. Tỉ lệ tương đồng chủng phân tích với chủng khác thuộc lồi V. parahaemolyticus cao, giống hồn tồn (100%) trình tự nucleotide gen toxR với chủng tương đồng tới 99% với hàng chục chủng khác. Gen toxR lồi V. alginolyticus đạt 84 - 91% độ tương đồng so với gen chủng C1 (Bảng 3). Bảng 3. So sánh trình tự đoạn gen toxR V. parahaemolyticus C1 với trình tự tương đồng Genbank cơng cụ BLAST Số hiệu gen Chủng Tổng số điểm Tỉ lệ che phủ Mức ý nghĩa Độ tương đồng AB372519.1 V. parahaemolyticus p4 (071022) 675 99% 0,0 100% AB029914.1 V. parahaemolyticus AN-8917 675 99% 0,0 100% AB029910.1 V. parahaemolyticus Y-27669 675 99% 0,0 100% EU155587.1 V. parahaemolyticus Vp252 580 85% 1e-162 100% EU155586.1 V. parahaemolyticus Vp250 580 85% 1e-162 100% EU155584.1 V. parahaemolyticus Vp136 580 85% 1e-162 100% …………… ………………………………………… AB372526.1 V. alginolyticus a20-6-23 335 66% 1e-88 91% …………… ………………………………………… AB372534.1 V. alginolyticus a12 (071022) 230 63% 6e-57 84% Khơng giống toxR gen bảo thủ đặc trưng cho lồi V. parahaemolyticus, gen tlh có trình tự tương đồng cao với trình tự số lồi khác Oceanimonas sp. (98%) (dữ liệu khơng ra). Giống Vibrio, Oceanimonas nhóm vi khuẩn biển TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ❖ 45 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản thuộc Proteobacteria chúng thuộc họ Aeromonadaceae, khác xa với họ Vibrionaceae hệ thống phân loại. Tuy vậy, gen tlh chúng lại có tỉ lệ tương đồng cao, chứng Số 2/2012 tỏ trình tự gen tlh khơng đặc trưng cho lồi V. parahaemolyticus, chí phân bố bên ngồi họ Vibrionaceae. Hình 3. Cây phát sinh chủng loại taxon có trình tự amino acid tương đồng với trình tự amino acid suy diễn từ đoạn gen tlh V. parahaemolyticus C1 Kết tiến hành chương trình BLAST, sử dụng phương pháp Neighbor Joining với độ sai khác trình tự tối đa 0,7. Kí hiệu “unknown” cho V. parahaemolyticus C1. 46 ❖ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Điều thú vị chạy chương trình BLAST cho trình tự amino acid suy diễn từ đoạn gen tlh V. parahaemolyticus C1, chúng tơi thấy trình tự amino acid protein TLH bảo thủ cao họ Vibrionaceae (chi Vibrio chi Photobacterium) (Hình 3). Điều phù hợp với nghiên cứu trước cho nhóm gen vhh/tlh phổ biến lồi Vibrio, lồi gần gũi với V. harveyi V. fischeri (Wang et al., 2007). Gần đây, nghiên cứu TLH V. alginolyticus V05 cho thấy trình tự amino acid protein có tỉ lệ tương đồng 94 83% so với TLH V. parahaemolyticus VHH V. harveyi (Jia et al., 2010). Người ta thành cơng tạo protein tái tổ hợp TLH thể hoạt tính phospholipase lòng đỏ trứng gà hoạt tính hemolysin chống lại hồng cầu cá bơn. Khi gây nhiễm vào cá ngựa cho thấy độc tính TLH với liều gây chết (LD50) vào khoảng 0,8µg protein/g cá (Jia et al., 2010). Do đó, TLH có tiềm phát triển làm vaccin điều trị bệnh thủy sản làm marker chẩn đốn bệnh Vibrio gây ra. Số 2/2012 IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Dựa đặc điểm hình thái, hóa sinh sinh học phân tử, chúng tơi phân lập tuyển chọn chủng V. parahaemolyticus từ mẫu hải sản chợ Nha Trang. Tất chủng mang gen toxR tlh khơng chủng có gen tdh hay trh. Gen toxR gen điều hòa gen độc tố, có trình tự bảo tồn đặc trưng cho lồi nên sử dụng làm gen đích để xây dựng phương pháp phát nhanh V. parahaemolyticus mẫu hải sản kỹ thuật PCR. Trong đó, gen tlh mã hóa hemolysin khơng bền nhiệt có trình tự amino acid bảo thủ họ Vibrionaceae, nên có tiềm làm vaccin điều trị bệnh thủy sản marker chẩn đốn bệnh Vibrio. Chúng tơi khuyến cáo người tiêu dùng nên ăn hải sản chín để phòng tránh độc tính hemolysin khơng bền nhiệt từ Vibrio. Hơn nữa, nghiên cứu khẳng định thêm ưu điểm bật phương pháp sinh học phân tử, khơng cho phép định danh xác V. parahaemolyticus đến lồi mà giúp phân biệt chủng mang gen độc tố với chủng khơng độc lồi. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Trần Linh Thước (2007). Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm. Nxb. Giáo dục, Hà Nội. 2. Croci L, Serratore P, Cozzi L, Stacchini A, Milandri S, Suffredini E, Toti L (2001) Detection of Vibrionaceae in mussels and in their seawater growing area. Lett Appl Microbiol, 32(1): 57-61. 3. Daniels NA, MacKinnon L, Bishop R, Altekruse S, Ray B, Hammond RM, Thompson S, Wilson S, Bean NH, Griffin PM, Slutsker L (2000). Vibrio parahaemolyticus infections in the United States, 1973-1998. J Infect Dis, 181(5):1661-6. 4. Iida T, Suthienkul O, Park KS, Tang GQ, Yamamoto RK, Ishibashi M, Yamamoto K, Honda T (1997). Evidence for genetic linkage between the ure and trh genes in Vibrio parahaemolyticus. J Med Microbiol 46(8):639-45. 5. Jia A, Woo NY, Zhang XH (2010). Expression, purification, and characterization of thermolabile hemolysin (TLH) from Vibrio alginolyticus. Dis Aquat Organ, 90(2):121-7. 6. Luan XY, Chen JX, Zhang XH, Jia JT, Sun FR, Li Y (2007). Comparison of different primers for rapid detection of Vibrio parahaemolyticus using the polymerase chain reaction. Lett Appl Microbiol, 44(3):242-7 7. Marlina E, Radu S, Kqueen C Y, Napis S, Zakaria Z, Mutalib S A and Nishibuchi M (2007). Detection of tdh and trh genes in Vibrio parahaemolyticus isolated from Corbicula moltkiana prime in West Sumatera, Indonesia. Southeast Asian J Trop Med Public Health, 38(2): 349-355. 8. Nishibuchi M, Kaper JB (1995). Thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus: a virulence gene acquired by a marine bacterium. Infect Immun 63(6):2093-9. 9. Tuyet DT, Thiem VD, Von Seidlein L, Chowdhury A, Park E, Canh DG, Chien BT, Van Tung T, Naficy A, Rao MR, Ali M, Lee H, Sy TH, Nichibuchi M, Clemens J and Trach DD (2002). Clinical, epidemiological, and socioeconomic analysis of an outbreak of Vibrio parahaemolyticus in Khanh Hoa Province, Vietnam. Infect Dis, 186(11):1615-1620. 10. Vesth T, Wassenaar T M, Hallin P F, Snipen L, Lagesen K and Ussery D W (2010). On the origins of a Vibrio species. Microb Ecol, 59:1-13. 11. Wang SX, Zhang XH, Zhong YB, Sun BG, Chen JX (2007). Genes encoding the Vibrio harveyi hemolysin (VHH)/thermolabile hemolysin (TLH) are widespread in vibrios. Wei Sheng Wu Xue Bao, 47(5):874-81. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ❖ 47 . Thủy sản Số 2/2012 42 ❖ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH GEN ĐỘC TỐ CỦA VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS TRONG HẢI SẢN TƯƠI SỐNG Ở NHA TRANG ISOLATION AND DETECTION OF TOXIN GENES OF VIBRIO. hướng dẫn của nhà sản xuất và sau đó bảo quản ở 4 0 C. 3. Xác định gen độc tố bằng kỹ thuật PCR Để xác định 4 gen độc tố toxR, tdh, trh và tlh, 4 cặp mồi tương ứng đã được tổng hợp bởi IDT (Mỹ). bệnh của V. parahaemolyticus vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ. Mục đích của nghiên cứu này là phân lập và xác định một số gen độc tố của V. parahaemolyticus từ các mẫu hải sản tại các chợ ở thành