phân lập vi khuẩn vibrio trên cá bớp bị lở loét

PHÂN LẬP VI KHUẨN Vibrio TRÊN CÁ BỚP (Rachycentron canadum) BỊ LỞ LOÉT IDENTIFICATION Vibrio ISOLATES FROM CUTANEOUS ULCERATIONS ON COBIA (Rachycentron canadum) Nguyễn Thị Thúy An *, Trần Ngọc Hải Từ Thanh Dung Lớp Cao học NTTS K18, Đại học Cần Thơ Email: ngthuyan803@yahoo.com.vn ABSTRACT Vibriosis is one of the most serious diseases, causing severe losses in the World’s marine fish production. In this study, two species of Vibrio alginolyticus and Vibrio parahaemolyticus were identified from cutaneous ulcerations on cobia (Rachycentron canadum). Conventional identification and rapid identification system, API 20E were used in this study. A total of 22 isolates were obtained from infected cobia in the brackish-water hatchery in College of Aquaculture and Fisheries, Cantho University. Clinical signs were cutaneous hemorrhage, ulcerations, and bloody peritoneal fluid. Pure colonies were observed in TCBS agar (thiosulphate citrate bile salt sucrose). The isolates from diseased cobia were motile and Gram-negative bacilli, able to grow in 4-8% NaCl media with temperature ranging 25-37oC, oxidase, catalase and O/F positive, and sensitive to the vibriostatic agent O/129 (150µg). Antimicrobial susceptibility testing showed that most isolates are sensitive to flofenicol, doxycycline, flumequine but resistant to cephalexin and colistin sulphate. The virulence of bacterial isolates and control mesures of the disease should be considered in further studies. Key words: cobia, Rachycentron canadum, bacterial diseases, Vibrio ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, cá bớp đối tượng quan tâm trọng chúng có nhiều ưu điểm cá có tốc độ tăng trưởng nhanh, khả chống chịu cao thích hợp với điều kiện sóng gió vùng biển khơi, giá trị kinh tế cao (Nguyễn Quang Huy, 2002). Việc phát triển mở rộng diện tích nuôi cá bớp đòi hỏi số lượng lớn cá giống, để đáp ứng yêu cầu này, công nghệ sản xuất giống nhân tạo cá bớp tập trung nghiên cứu đầu tư phát triển. Gần trường Đại học Cần Thơ nghiên cứu sản xuất giống thành công cá bớp góp phần đáp ứng nhu cầu thị trường phát triển đối tượng vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long. Tuy nhiên, trình ương nuôi gặp nhiều khó khăn, tỷ lệ cá hao hụt nhiều dịch bệnh làm giảm hiệu sản xuất. Nhóm vi khuẩn Vibrio xác định tác nhân gây bệnh phổ biến loài cá biển giới. Theo Peggy and Ruth (2009), tỷ lệ cá chết nhiễm Vibrio 50% đợt dịch, cá có dấu hiệu hôn mê, màu sắc thể biến đổi xuất vùng hoại tử. Khi cá bệnh nặng nội quan xuất huyết bên chứa đầy dịch lỏng. Năm 2001, Vibrio alginolyticus xác định tác nhân gây bệnh cá bớp có dấu hiệu lở loét Đài Loan (Rajan et al., 2001). Đến năm 2006 Vibrio vulnificus Liu et al. xác định nguyên nhân gây bệnh cá bớp. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu thức cá bớp bị lở loét nuôi ĐBSCL. Trong báo này, trình bày kết phân lập, đặc điểm sinh lý, sinh hóa vi khuẩn xác định độ nhạy số loại kháng sinh vi khuẩn phân lập nhằm cung cấp thông tin cho việc phòng trị bệnh hiệu quả. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp thu mẫu Cá bớp thu trực tiếp từ bể ương composite trại thực nghiệm nước lợ - Khoa Thủy Sản – ĐHCT. Cá thu cá có dấu hiệu bệnh suốt thời gian ương (từ cá bột lên cá giống). Chỉ thu cá (5 – con) bể có xuất cá bệnh thu cá khỏe bể dấu hiệu bệnh lý. Tổng số 14 đợt thu mẫu gồm 51 mẫu cá bệnh 12 mẫu cá khỏe. 406 Phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng Tổng số 63 mẫu cá gồm cá bột, cá hương cá giống kiểm tra ký sinh trùng (KST) tổng thể gồm da, mang, vây nội quan. Phương pháp định danh KST dựa vào đặc điểm hình thái cấu tạo KST theo phương pháp nghiên cứu KST cá Hà Ký (1992), Đỗ Thị Hòa ctv (2004) Bùi Quang Tề (2008). Phương pháp phân lập định danh vi khuẩn Quan sát ghi nhận dấu hiệu bệnh lý bên ngoài. Sử dụng cồn 70% sát trùng mặt cá lau sạch, dùng dao tiệt trùng vạch đường vết thương, gan, thận tỳ tạng. Sau dùng que cấy lấy mẫu bệnh phẩm từ điểm vừa rạch cấy môi trường Tryptic soya agar (TSA, bổ sung 1,5% NaCl) môi trường Thiosulphate citrate bile salt sucrose agar (TCBS). Ủ đĩa tủ ấm nhiệt độ 28oC. Sau 24 – 48 ghi nhận màu sắc, hình dạng khuẩn lạc, tiến hành tách ròng đạt đĩa cấy thuần. Định danh vi khuẩn dựa theo đặc điểm hình thái, sinh hóa vi khuẩn xác định cách kiểm tra tiêu bản, test O/F, test O/129 sử dụng kít API 20E. Phương pháp lập kháng sinh đồ Chọn 10 loại kháng sinh gồm: Rifampicin (RD/5µg), Florfenicol (FFC/30µg ), Cephalexin (CL/30µg ), Doxycycline (DO/30µg), Cefotaxin (CTX/30µg), Ciprofloxacin (CIP/5µg), Flumequine (UB/30µg), Amoxycilin + Clavulanic acid (2:1) (AMC/30µg), Colistin sulphate (CT/10µg) Erythromycin (E/15µg). Phương pháp lập kháng sinh đồ thực theo tiêu chuẩn Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2006. Sử dụng môi trường TSA (bổ sung thêm 1,5% NaCl). Sau 24h tiến hành đo đường kính vòng vô trùng (mm) nhằm xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình kháng. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết phân lập vi khuẩn cá Bớp Dấu hiệu bệnh lý Cá bớp có dấu hiệu bệnh lý: cá bỏ ăn, lờ đờ, xuất vùng hoại tử thân xuất huyết nội quan, số có tượng bụng trương to có chứa dịch lỏng bên trong. Vi khuẩn phân lập hầu hết vùng nội quan gan, thận tỳ tạng. Khi quan sát kính hiển vi cho thấy vi khuẩn gram âm, hình que ngắn. Hình 1: Cá bớp bị lở loét bên thân (trái), bụng cá trương to (phải) Kết phân lập vi khuẩn Kết phân lập 22 chủng vi khuẩn từ gan, thận tỳ tạng cá bớp bệnh. Trên môi trường TSA (bổ sung 1,5% NaCl) sau 24 giờ, 28oC vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc hình tròn, trơn, màu trắng đục, kích thước từ – 2mm. Các khuẩn lạc cấy môi trường TCBS, kết ghi nhận có dạng khuẩn lạc: màu vàng, tròn, lõm, kích thước từ – 2mm khuẩn lạc màu xanh, tròn, trơn, kích thước khoảng 2mm. 407 Kết định danh kít API 20E cho thấy nhóm vi khuẩn có khuẩn lạc màu vàng Vibrio alginolyuticus, nhóm vi khuẩn có khuẩn lạc màu xanh Vibrio parahaemolyticus. Sự khác biệt V. alginolyuticus V. parahaemolyticus V. alginolyuticus có khả sử dụng sucrose V. parahaemolyticus không sử dụng sucrose (Buller, 2004). Bảng 1: Đặc điểm hình thái, sinh-hóa chủng vi khuẩn phân lập cá bớp chủng tham khảo Chỉ tiêu Nhuộm Gram Hình dạng Di động TCBS Sinh Catalase Sinh Oxidase Phản ứng lên men yếm khí Phản ứng lên men hiếu khí Phản ứng với O129 β-Galactosidaza V. alginolyticus Phân lập Buller, 2004 que ngắn que ngắn + + Y Y + + + + + + + + + + + +/+/- + 53 v - V. parahaemolyticus Phân lập ATCC 43996 que ngắn que ngắn + + G G + + + + + + + + + + + + - + + - Arginine Lysine Ornithine Sử dụng Citrate Sinh H2S Sinh Ureaza Sinh Tryptophane deaminaza Sinh Indole + + + + Phản ứng Voges-Proskauer 83 Sinh Gelatinaza -/+ v + + Sử dụng đường Glucose + + + + Mannitol + + + + Inositol Sorbitol Rhamnose Sucrose + + Melibiose Amygdaline + 67 + w Arabinnose Ghi chú: (+) dương tính; (-) âm tính; Y = màu vàng; G= màu xanh; v = variable reaction; w = weak Qua bảng cho thấy, vi khuẩn phân lập vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, di động, phản ứng dương tính với oxidase catalase, có khả lên men hai điều kiện hiếu khí yếm khí. Tất chủng cho phản ứng âm tính với β-Galactosidaza, arginine phản ứng Voges-Proskauer cho phản ứng dương tính với lysine, chúng không sinh ureaza H2S sinh indole. Tất mọc môi trường TCBS, sử dụng đường glucose manitol không sử dụng đường inositol, sorbitol, rhamnose arabinose, 408 nhạy cảm với hợp chất 2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine (O/129) nồng độ 150µg lại kháng với hợp chất nồng độ 10µg. Khi so sánh đặc điểm sinh hóa chủng phân lập với chủng tham khảo Buller (2004) nhận thấy chủng V. alginolyticus có vài tiêu sai khác mức độ cho phép chủng V. parahaemolyticus tất tiêu phù hợp với chủng tham khảo. Theo Rajan et al. (2001), phân lập xác định V. alginolyticus từ cá bớp bị xuất huyết lở loét thân Đài Loan. Theo Liu et al. (2004), V. alginolyticus xác định tác nhân gây bệnh cá bớp có dấu hiệu da có màu tối, mắt bị hư hỏng có chứa dịch xoang bụng. Bên cạnh đó, khảo sát khả chịu mặn chủng vi khuẩn nồng độ 0, 1, 2, 4, 8% NaCl môi trường lỏng BHI (Brain Heart Infusion). Kết cho thấy vi khuẩn sinh trưởng môi trường có nồng độ NaCl từ – 8%. Và đa số chủng vi khuẩn phát triển nhiệt độ từ 25-37 oC. Tuy nhiên, kết nghiên cứu cao so với kết nghiên cứu khác V. parahaemolyticus (ATCC 43996) phát triển môi trường chứa 0–3% NaCl (Buller (2004). Theo Rajan et al. (2001), V. alginolyticus phát triển 3-6% NaCl không phát triển NaCl 8%. Kết kháng sinh đồ Trong nghiên cứu tìm thấy hầu hết chủng vi khuẩn (V. alginolyticus V. parahaemolyticus) nhạy với flofenicol, doxycyclin flumequine. Ngoài ra, tìm thấy chủng vi khuẩn kháng với loại kháng sinh cephalexin colistin sulphate. Đối với loại kháng sinh lại, rifamicin ciprofloxacin nhạy đến 90% 10% nhạy trung bình; cefotaxin có 80% nhạy 20% nhạy trung bình; amoxycillin tính nhạy thấp 60% lại 40% nhạy trung bình; riêng erythromycin nhạy 30%, nhạy trung bình đến 60% 10% chủng vi khuẩn nói kháng lại loại kháng sinh này. Tỷ lệ % 100 90 80 70 60 Nhạy 50 Trung Bình 40 Kháng 30 20 10 FFC RD DO CL E CIP AMC CTX UB CT Loại kháng sinh Hình 3: Tỷ lệ phần trăm chủng vi khuẩn nhạy với loại thuốc kháng sinh Ghi chú: FFC: Flofernicol, RD: Rifamicin, DO: Doxycycline, CL: Cephalexin, E: Erythromycin, CIP: Ciprofloxacin, AMC: Amoxycillin, CTX: Cefotaxin, UB: Flumequine CT: Colistin sulphate. Kết phù hợp với nghiên cứu Rajan et al. (2001), phân lập V. alginolyticus cá bớp Đài Loan nhận thấy V. alginolyticus nhạy cảm với flumequine. Trong nghiên cứu Viên Đại Phúc (2011), có loại kháng sinh Kanamycin, erythromycin, cephalexin ampicicllin kháng với V. alginolyticus phân lập cá chẽm bị lở loét Khánh Hòa. Qua kết kháng sinh đồ cho thấy sử dụng flofenicol, doxycyclin, flumequine, rifamicin ciprofloxacin để điều trị cho cá bớp cá bị xuất huyết, lở loét. Tuy nhiên, cần có nhiều nghiên cứu liều lượng phương pháp sử dụng kháng sinh để hiệu điều trị cao hơn. 409 KẾT LUẬN Vi khuẩn Vibrio alginolyticus Vibrio parahaemolyticus phân lập cá bớp có dấu hiệu xuất huyết, lở loét bụng trương to có chứa dịch bên trong. Kết kháng sinh đồ cho thấy hầu hết chủng vi khuẩn phân lập nhạy với flofenicol, doxycycin, flumequine hầu hết kháng với cephalexin colistin sulphate. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đỗ Thị Hòa, Trần Vỹ Hích, Nguyễn Thị Thùy Giang, Phan Văn Út Nguyễn Thị Nguyệt Huệ (2008). Các loại bệnh thường gặp cá biển nuôi Khánh Hòa. Tạp chí Khoa Học – Công Nghệ Thủy Sản số 2/2008: 16-23. Trường Đại học Nha Trang. Hà Ký, 1992. Phương pháp nghiên cứu tác nhân gây bệnh ký sinh trùng cá. Dịch từ gốc V.A. Musselius. Bộ Thủy sản, Hà Nội. Nguyễn Quang Huy, 2002. Tình hình sản xuất nuôi thương phẩm cá bớp (Rachycentron canadum). Tạp chí thủy sản, số 7: 14 – 16 Viên Đại Phúc, 2011. Tìm hiểu tác nhân gây bệnh lở loét cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi lồng biển Nha Trang – Khánh Hòa. Luận văn thạc sĩ sinh học. Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. 73 trang Tài liệu tiếng Anh Buller, N.B. (Editor), 2004. Bacteria from fish and other aquatic animal: A practical identification manual. 361pp. Health Protection Agency (2007). Identification of Vibrio species. National Standard Method BSOP ID 19 Issue 2. http://www.hpa-standardmethods.org.uk/pdf sops.asp Inglis, V., R. J. Roberts and N. R. Bromage, 1993. Bacterial diseases of fish. Institute of Aquaculture, University of Stirling, 312pp. Kaiser, J. B and G. J. Hoff, 2005. Species profile cobia. SRAC publication No. 7202. Liu, P., J. Lin, P. Hsiao, and K. Lee, 2004. Isolation and characterzation of pathogenic vibrio anginolyticus from diseased cobia (Rachycertron canadum). Journal of Basic Microbiolory. 44: 23 – 28 Matthew, J. M., A. Kenneth, J. Webb and G. J. Holt, 2006. Growth and survival of juvenile cobia, Rachycentron canadum, at different salinities in a recirculating aquaculture system. Aquaculture 253, 398–407. McLean, E., G. Salze, S. R. Craig, 2008. Parasites, diseases and defomities of cobia. Ribarstvo 66 (1): – 6. Rajan, P. R., C. Lopez, J. H. Y. Lin and H. L. Yang, 2001. Vibrio alginolyticus infection in cobia (Rachycentron canadum) cultured in Taiwan. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists. 21: 228 – 234. Shaffer, R. V. and E.L. Nakamura, 1989 Synopsis of Biological Data on the cobia, Rachycentron canadum, (Pisces: Rachycentridae). FAO Fisheries syynop 153 (NMFS/S 153) U.S. DEP. Commer, NOAA Technical report NMFS 82-21p Supranee, C. and R. J. Robert, 1999. Pathology and Histopathology of Eppizootic Ulcerative Syndrome (EUS). Aquatic Animal Healh Research Institue Department of Fisheries Bangkok, Thailand. 33pp. Svennevig, N. 2001. Farming of Cobia or Black kingfish (Rachycertron canadum). Internet http://www.eraca.org/grouper/News/02/Cobia-Niels.htm Toranzo, A. E., B. Magariños, J. L. Romalde, 2005. A review of the main bacterial fish diseases in mariculture systems. Aquaculture 246: 37 – 61. 410 . animal: A practical identification manual. 361pp. Health Protection Agency (2007). Identification of Vibrio species. National Standard Method BSOP ID 19 Issue 2. http://www.hpa-standardmethods.org.uk/pdf. (Rachycentron canadum) BỊ LỞ LOÉT IDENTIFICATION Vibrio ISOLATES FROM CUTANEOUS ULCERATIONS ON COBIA (Rachycentron canadum) Nguyễn Thị Thúy An * , Trần Ngọc Hải và Từ Thanh Dung Lớp Cao học NTTS. thương phẩm cá bớp (Rachycentron canadum). Tạp chí thủy sản, số 7: 14 – 16 Viên Đại Phúc, 2011. Tìm hiểu tác nhân gây bệnh lở loét trên cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi lồng biển tại Nha Trang