Phân lập và xác định gen BPMS trên NST 20p11.23 là gen ứng viên gây béo phì trong hội chứng MOMO

Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu nhằm tìm gen gây béo phì bệnh lý từ một chuyển đoạn đồng hợp t(16;20)(q21;p11.23) trên một bé trai với hội chứng MOMO, một hội chứng hiếm với béo phì là triệu chứng quan trọng nhất. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 Nghiên cứu Y học PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH GEN BPMS TRÊN NST 20p11.23 LÀ GEN ỨNG VIÊN GÂY BÉO PHÌ TRONG HỘI CHỨNG MOMO Vũ Phi Yên*, Taine Laurence**, Trần Công Toại*, Briault Sylvain*** TĨM TẮT Đặt vấn đề: Béo phì bệnh lý phức tạp, ñã trở thành đại dịch tầm cỡ tồn cầu Việc nghiên cứu xác ñịnh ñầy ñủ gen liên quan ñến béo phì trơng đợi nhằm giúp nắm ñược tranh tổng quan chế bệnh sinh bệnh lý này, nhằm phát triển chiến lược dự phòng điều trị hiệu Nhìn chung, dạng béo phì hội chứng thường có liên quan ñến bất thường nhiễm sắc thể Mục tiêu: Chúng nghiên cứu tìm gen gây béo phì bệnh lý từ chuyển ñoạn ñồng hợp t(16;20)(q21;p11.23) bé trai với hội chứng MOMO, hội chứng với béo phì triệu chứng quan trọng Phương pháp nghiên cứu: Xác định xác hai điểm gãy phương pháp lai FISH, PCR đoạn dài, phân tích trình tự Nghiên cứu gen ứng viên phương pháp phân tích tin sinh học in silico, RT-PCR, RACE-PCR mơ đích não, mơ mỡ Kết quả: Sau xác định xác hai điểm gãy khảo sát gen vòng 1,5 Mb quanh hai ñiểm gãy, nghiên cứu gen bị cắt ñứt ñiểm gãy NST 20 ñề nghị gọi tên BPMS (BreakPoint in the MOMO Syndrome), có biểu mô tương hợp với bệnh sinh béo phì, biểu bệnh nhân Chúng tơi ñề nghị xem ñây gen ứng viên gây hội chứng MOMO vị trí biểu gen bệnh nhân Các kết nghiên cứu chúng tơi cấu trúc hồn chỉnh BPMS, ñặc biệt isoform gen não cung cấp hiểu biết tảng cho việc nghiên cứu chức gen tương lai Từ khóa: Béo phì bệnh lý, Phân lập từ vị trí, Điều hòa cảm giác thèm ăn, hội chứng MOMO ABSTRACT IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF THE BPMS GENE ON CHROMOSOME 20P11.23 AS CANDIDATE GENE FOR A SYNDROMIC OBESITY: MOMO SYNDROME Vu Phi Yen, Taine Laurence, Tran Cong Toai, Briault Sylvain * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 14 - Supplement of No - 2010: 195 - 201 Introduction: Obesity is a complex disease which has become a new and dangerous global epidemic The identification of genes involved in obesity is expected to increase our understanding of its pathogenesis Frequently, syndromic cases of obesity are associated with chromosomal anomalies Objective: We report on the clinical, cytogenetic and molecular findings in a boy with MOMO syndrome, a rare syndrome with morbid obesity, and our positional cloning strategy to identify the candidate genes from his homozygous translocation t(16;20)(q21;p11.23) Results: The fine mapping work identified the breakpoint of chromosome 20, which disrupts a new gene: BPMS (BreakPoint in the MOMO Syndrome) We suggest that BPMS is a candidate gene for this syndromic obesity in basing on its position and its loss of expression in the patient The results of our explorations of its complete structure and its isoforms in the brain laid the groundwork for the further investigation on its functions Keywords: Morbid obesity, Positional cloning, Appetite regulation, MOMO syndrome béo phì chiếm đa số cộng đồng thường kết ĐẶT VẤN ĐỀ tương tác ñịa di truyền cá thể Béo phì bệnh lý phức tạp yếu tố (1) yếu tố mơi trường (xã hội, thói quen ăn uống, di truyền góp phần từ 40 – 70% Các trường hợp lối sống)(10) Những trường hợp béo phì nghiêm trọng Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Khoa Di truyền Y học, Bệnh viện Pellegrin, Bordeaux, Pháp ***INSERM Đơn vị nghiên cu 619, Trng i hc Franỗois Rabelais, Tours, Phỏp a liên hệ: TS.BS.Vũ Phi Yên ĐT: 0907.822.538 Email: vuphiyen@pnt.edu.vn * ** Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Kỹ Thuật Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2010 195 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 ñược nghiên cứu sâu giúp phát nhiều gen quan trọng điều hòa cán cân lượng thể(2,9) Tổn thương gen gây nhiều bệnh lý béo phì đơn gen trầm trọng xuất sớm trẻ em(9) Trong trường hợp bình thường, cán cân lượng thể điều hòa chặt chẽ, chủ yếu thơng qua việc điều hòa cảm giác no đói hay thèm ăn(4,6) Khi thể cần lượng, nội tiết tố Ghrelin ñược tiết từ dày, tác ñộng lên thụ thể đặc hiệu vùng đồi, kích thích tổng hợp hai loại neuropeptid NPY AgRP gây cảm giác đói, thèm ăn(4,6) Các yếu tố gây cảm giác no quan trọng Leptin (nội tiết tố từ tế bào mỡ), Serotonin (từ tế bào thần kinh tiết serotonin) tác dụng lên thụ thể ñặc hiệu chúng vùng đồi, kích thích tổng hợp Proopiomelanocortin (POMC)(4) POMC ñược xử lý thành alpha MSH, chất tác ñộng lên thụ thể MC3R MC4R, gây cảm giác no(4,7) Ngoài ra, gen tham gia vào hình thành phơi học nhân thần kinh vùng đồi (ví dụ gen SIM1), bị tổn thương gây béo phì bệnh lý (12) Phần lớn gen quan trọng kể ñã trở thành tâm ñiểm chiến lược ñiều trị Nhưng nay, điều trị béo phì bệnh lý đem lại kết hạn chế, gợi ý nhiều gen quan trọng bệnh sinh béo phì chưa khám phá Cũng lý này, chiến lược tồn diện chẩn đốn ngun nhân béo phì chưa thể hồn thiện chưa hiểu biết đầy đủ bệnh sinh, việc chẩn đốn bệnh lý chủ yếu dựa lâm sàng Trong bối cảnh này, cần nghiên cứu tìm gen lại, “mắt xích thiếu” tranh chung điều hòa cán cân lượng thể Bên cạnh bệnh lý béo phì đơn gen, có dạng béo phì hội chứng, triệu chứng béo phì tiêu chuẩn chẩn đốn quan trọng Tổn thương di truyền trường hợp thường tổn thương gen điều hòa, tổn thương nhiễm sắc thể Hội chứng MOMO hội chứng với trường hợp ñược báo cáo giới (đến thời điểm chẩn đốn bệnh nhân nghiên cứu chúng tôi)(5,13) MOMO chữ viết tắt Macrosomia, Obesity, Macrocephaly, and Ocular Abnormalities: chứng khổng lồ, béo phì, đầu to, bất thường mắt Với trường hợp ñã ñược báo cáo, triệu chứng chậm phát triển tâm thần vận ñộng, xương ñùi cong…cũng ghi nhận, khơng có trường Nghiên cứu Y học hợp bệnh khác gia đình, cha mẹ khơng đồng huyết Do đó, tác giả ñặt giả thiết ñây bệnh di truyền trội Mục tiêu nghiên cứu Phân lập gen ứng viên gây hội chứng béo phì bệnh lý, bệnh nhân có chuyển đoạn đồng hợp nhiễm sắc thể 16 20 mắc hội chứng MOMO ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU Bệnh nhân Bệnh nhân ñầu tiên ñược khảo sát bé trai người Pháp gốc du mục, ñầu tiên cặp cha mẹ ñồng huyết (mức ñộ 2) (Hình 1) Khi sinh, bệnh nhân ñủ tháng, ghi nhận chứng khổng lồ (cân nặng 4,85 kg, +3 ñộ lệch chuẩn) Kể từ 18 tháng, bệnh nhân ăn nhiều từ tuổi ñược theo dõi béo phì Khám lâm sàng khoa Di truyền Y khoa (bệnh viện Pellegrin, Bordeaux) ghi nhận: bệnh nhân tuổi rưỡi, cân nặng 74 kg (+ 20 ĐLC), cao 124 cm (+ 1,5 ĐLC), chu vi vòng đầu 57 cm (+ ĐLC) ( Hình 2) Bệnh nhân có triệu chứng bất thường mắt (cận thị, loạn thị, thiểu sản thần kinh thị), thiểu sản phận sinh dục, xương ñùi cong, cao huyết áp, chậm phát triển trí tuệ Ngồi ra, bệnh nhân có số dấu hiệu dị dạng nhỏ: mũi tròn hình củ hành, gốc mũi rộng, mắt xếch hình hạnh nhân, tật ngón ngắn Tiền sử gia đình ghi nhận bệnh nhân có người anh họ, có cha mẹ đồng huyết (mức ñộ 2), biểu lâm sàng tương tự Tuy nhiên, chúng tơi khơng thu nhận bệnh nhân tham gia nghiên cứu (do khơng liên lạc với gia đình) (Hình 1) Hội Nghị Khoa Học Cơng Nghệ Kỹ Thuật Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2010 196 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 Hình 1: Cây gia bệnh nhân ñầu tiên nghiên cứu Tập hợp triệu chứng lâm sàng hướng chẩn ñoán ñến hội chứng MOMO Các chẩn ñoán phân biệt hội chứng Prader-Willi hội chứng nhiễm sắc thể X dễ gãy, lưỡng bội nguồn cha mẹ (uniparental disomy) ñều ñược xét nghiệm loại trừ Nhiễm sắc thể ñồ cho thấy cha mẹ bệnh nhân có chuyển đoạn t(16;20)(q21;p11.23), bệnh nhân nhận hai NST 16 chuyển ñoạn hai NST 20 chuyển đoạn, nói cách khác, bệnh nhân có chuyển ñoạn ñồng hợp t(16;20)(q21;p11.23) Hướng ñến thu thập nhiều bệnh nhân phục vụ cho phân lập gen, thực kêu gọi hợp tác quốc tế nhằm có ñược ADN bệnh nhân mắc hội chứng Kết thu nhận ñược thêm bệnh nhân từ Pháp, Bỉ, Brasil Các kết thí nghiệm bệnh nhân ñược so sánh với kết nhóm chứng, gồm 50 bệnh nhân bệnh viện Pellegrin, Bordeaux, nhập viện lý khác béo phì, tuổi nhỏ 15 cân nặng bình thường (BMI khoảng 20 - 25) Hình 2: (2a) Bệnh nhân lúc tuổi rưỡi (2b) X quang xương ñùi trái Phương pháp nghiên cứu Đối với bệnh nhân ñầu tiên ñược khảo sát, tế Nghiên cứu Y học bào lympho máu ngoại vi ni cấy, thu hoạch làm NST ñồ FISH, chiết tách ADN ARN (với kit Promega Ambion); phần tế bào lympho hóa virus Ebstein Barr lưu giữ lâu dài, trì nguồn tế bào bệnh nhân Đối với nhóm chứng, ADN ARN chiết xuất từ tế bào lympho máu ngoại vi (với kit Promega Ambion) Đối với bệnh nhân MOMO ñược thu thập thêm, ADN ñược chiết xuất từ tế bào lympho máu ngoại vi (với kit Promega) (1) Xác định xác hai ñiểm gãy NST 16 20 chuyển ñoạn t(16;20)(q21;p11.23) phương pháp: - Thực nhiều ñợt FISH tìm đoạn mồi nằm vắt ngang hai điểm chuyển ñoạn Các ñoạn mồi FISH sử dụng BAC (Bacterial artificial chromosome) (Invitrogen) phóng đại E coli nuôi môi trường Luria Broth; phân lập tinh phương pháp cột lực ADN (bộ kit Qiagen); ñánh dấu huỳnh quang kỹ thuật tổng hợp mạch ñứt gãy (bộ kit Abbott) Các ñợt FISH nhằm thu hẹp vùng mục tiêu nghiên cứu Phân tích vùng mục tiêu thu hẹp nhiều ñoạn PCR ñoạn dài (bộ kit Roche) tổng hợp ñoạn nối 16 – 20 nhiễm sắc thể chuyển đoạn Giải trình tự đoạn nối 16 – 20 nhiễm sắc thể chuyển ñoạn (bộ kit Applied Biosystems) (2) Khảo sát gen quanh hai ñiểm gãy chọn gen ứng viên Các gen vòng 1,5 Mb quanh hai điểm gãy khảo sát biểu mô (mô não mơ mỡ, Clontech), theo giai đoạn phát triển, chức ñã biết tương tác Các thơng tin thu thập từ ngân hàng liệu di truyền Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Kỹ Thuật Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2010 197 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 lớn NCBI, Ensembl, UCSC, Aceview Các gen khảo sát tìm biểu tế bào lymphô người chứng RT-PCR (với kit Invitrogen Applied Biosystems) so sánh với biểu bệnh nhân (3) Nghiên cứu gen ứng viên Gen ứng viên ñược nghiên cứu in silico (dùng ứng dụng BLAST, Pfam); khảo sát biểu tế bào lympho người chứng, so sánh với bệnh Nghiên cứu Y học nhân, tìm biểu mô não mô mỡ RT-PCR, RT-PCR ñịnh lượng (với kit Invitrogen, Applied Biosystems Stratagene) Cấu trúc hoàn chỉnh gen ứng viên tìm kỹ thuật RACE-PCR (với kit Invitrogen Clontech) KẾT QUẢ Xác ñịnh hai ñiểm gãy NST 16 20 Hình 3: Giải trình tự hai điểm gãy Hình 4: Kết RT-PCR gen quanh điểm gãy Hội Nghị Khoa Học Cơng Nghệ Kỹ Thuật Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2010 198 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 Nghiên cứu Y học Hình 5: Quá trình phân lập gen dựa theo vị trí cấu trúc đầy đủ gen RP5-872K7.2 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Kỹ Thuật Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2010 199 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 Nghiên cứu Y học Hai ñoạn mồi RP5-872K7 RP11-467O15 vắt ngang hai ñiểm gãy NST 16 20 Hai ñiểm gãy ñược khoanh vùng, thu hẹp giải trình tự, vị trí xác ñược xác ñịnh sau: ñiểm gãy NST 16 vị trí 61229260 (mất nucleotide), điểm gãy NST 20 vị trí 21026325 (mất nucleotide) (Hình 3) Điểm gãy nhiễm sắc thể 20 cắt ngang gen RP5-872K7.2 Khảo sát gen quanh ñiểm gãy Các gen vòng 1,5 Mb quanh hai điểm gãy khảo sát xem có biểu loại mơ quan trọng bệnh sinh béo phì hay khơng, xem có chức biết liên quan đến điều hòa cán cân lượng hay khơng, xem có thay đổi biểu bệnh nhân so với người chứng hay không Kết gen sau ñây ñược chọn ưu tiên nghiên cứu tiếp: RP5-872K7.2 (hay gleeto), C20ORF19, NKX2-2, NKX2-4, CDH8, FOXA2 Chọn gen ứng viên gen nói khảo sát: - Biểu mơ quan trọng bệnh sinh béo phì: mô mỡ, mô não Hai gen NKX2-4 FOXA2 không biểu hai mơ nói ( Hình 4) - So sánh biểu bệnh nhân nhóm chứng (trên tế bào lympho, nguồn tế bào chúng tơi thu bệnh nhân): gen RP5-872K7.2 biểu chứng, biểu bệnh nhân (kiểm tra lại RT-PCR ñịnh lượng: gen RP5-872K7.2 hoàn toàn biểu bệnh nhân, mức biểu cha mẹ bệnh nhân không khác so với chứng) Gen RP5872K7.2 ñược chọn làm ứng viên cho nghiên cứu Nghiên cứu gen ứng viên Từ nguồn thơng tin tổng hợp từ ngân hàng liệu NCBI, Ensembl Aceview dựa vào kết thực nghiệm, chúng tơi tìm cấu trúc đầy đủ gen RACE-PCR chúng tơi tóm tắt gen RP5-872K7.2 (theo Ensembl) hay gleeto (theo Aceview) sau: - Gen gồm 16 exon, ñược giải mã thành nhiều isoform khác tùy loại mơ (Hình 5) Chuỗi polypeptid dài tổng hợp đạt 93 axit amin, khơng chứa cấu trúc tương tự Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Kỹ Thuật Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2010 200 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 Nghiên cứu Y học cấu trúc vùng chức protein ñã biết Vùng ADN gen RP5-872K7.2 giàu vị trí bám yếu tố mã (transcription factors) Gen bảo tồn qua tiến hóa Gen biểu mơ não, mơ dày, tế bào lympho Trên bệnh nhân khác nghi ngờ hội chứng MOMO, chúng tơi có thực giải trình tự để tìm đột biến gen RP5-872K7.2 Tuy nhiên, mẫu bệnh nhân hạn chế chưa tìm thấy đột biến gây thay đổi axit amin (missense) làm kết thúc sớm giải mã (nonsense), tìm thấy vài đột biến bảo tồn (conservative) BÀN LUẬN Khơng ba trường hợp khác báo cáo, bệnh nhân nghiên cứu chúng tơi có cha mẹ ñồng huyết chuyển ñoạn ñồng hợp nhiễm sắc thể thường Do chúng tơi đặt giả thiết ngược với tác giả trước bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường Các trường hợp chuyển ñoạn ñồng hợp gặp y văn, hội quý giá ñể phân lập gen dựa vị trí Ít khả gen tổng hợp thành protein chuỗi polypeptid dài ñược tổng hợp ñạt 93 axit amin, ngắn so với protein thơng thường, khơng tìm ñược cấu trúc tương tự với protein ñã biết Tuy nhiên, gen RP5-872K7.2 hoạt động ARN, bám vào chuỗi ADN bổ sung theo chế antisense, điều hòa mã gen lân cận, cách ngăn chận bám yếu tố mã gen lân cận(3,11) Ít bảo tồn qua tiến hóa ñặc ñiểm thường gặp gen hoạt động dạng ARN (ví dụ gen Xist, gen Air)(8) Thông qua kết nghiên cứu trên, chúng tơi đưa giả thiết gen RP5-872K7.2: - Có thể gen hoạt động dạng ARN - Có thể giữ chức điều hòa quan trọng với gen vùng - Đặc điểm biểu mơ tương hợp với giả thiết bệnh sinh béo phì Từ đó, chúng tơi có đủ luận chọn gen RP5-872K7.2 gen ứng viên cho hội chứng MOMO, ñặc biệt cho triệu chứng béo phì bật hội chứng Chúng tơi đề nghị gọi gen BPMS: BreakPoint in the MOMO Syndrome: tìm thấy ñiểm gẫy (NST) hội chứng MOMO Hội chứng MOMO gặp số trường hợp thu nhận ñược Các nghiên cứu quy mô lớn hơn, mẫu bệnh nhân lớn để tìm thấy ñột biến gây bệnh giúp khẳng ñịnh vai trò gen BPMS bệnh sinh béo phì KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ Đây báo cáo ñầu tiên bất thường nhiễm sắc thể quan sát thấy hội chứng MOMO, hội chứng gặp với béo phì bệnh lý triệu chứng bật Đặc ñiểm gia hệ chuyển đoạn đồng hợp tìm thấy bệnh nhân giúp chúng tơi đưa giả thiết bệnh di truyền lặn, nhiễm sắc thể thường Sau thực phân lập gen ứng viên dựa vị trí, chúng tơi đề nghị chọn gen BPMS ứng viên hội chứng MOMO Gen cần ñược nghiên cứu sâu chức nghiên cứu tìm đột biến quần thể bệnh nhân lớn TÀI LIỆU THAM KHẢO Allison, D., et al (1996), the heritability of body mass index among an international sample of monozygotic twins reared apart Int J Obes Relat Metab Disord 20(6): p 501-506 Chen, D and A Garg (1999), monogenic disorders of obesity and body fat distribution J Lipid Res 40(10): p 1735-46 Costa, F (2007), Non-coding RNAs: Lost in translation? Gene 386: p 1–10 Klok, M., S Jakobsdottir, and M Drent (2007), the role of leptin and ghrelin in the regulation of food intake and body weight in humans: a review Obes Rev 8(1): p 21-34 Moretti-Ferreira, D., et al (1993), Macrosomia, obesity, macrocephaly and ocular abnormalities (MOMO syndrome) in two unrelated patients: delineation of a newly recognized overgrowth syndrome Am J Med Genet 46(5): p 555-558 Morton, G and M Schwartz (2001), The NPY/AgRP neuron and energy homeostasis Int J Obes Relat Metab Disord 25(Suppl 5) Oswal, A and G Yeo (2007), the leptin melanocortin pathway and the control of body weight: lessons from human and murine genetics Obes Rev 8(4): p 293-306 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Kỹ Thuật Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2010 201 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 10 11 12 13 Nghiên cứu Y học Pang, K.C., M.C Frith, and J.S Mattick (2006), Rapid evolution of noncoding RNAs: lack of conservation does not mean lack of function Trends Genet 22(1) Rankinen, T., et al (2006), the human obesity gene map: the 2005 update Obesity (Silver Spring) 14((4)): p 529-644 Speakman, J (2004), Obesity: The integrated roles of environment and genetics J Nutr 134: p 2090S–2105S Szymanski, M and J Barciszewski (2006), RNA Regulation in Mammals Ann NY Acad Sci 1067: p 461–468 Varela, M.C., et al (2006), A new case of interstitial 6q16.2 deletion in a patient with Prader-Willi-like phenotype and investigation of SIM1 gene deletion in 87 patients with syndromic obesity Eur J Med Genet 49(4): p 298-305 Zannolli, R., et al (2000), MOMO syndrome: a possible third case Clin Dysmorphol 9(4): p 281-284 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Kỹ Thuật Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2010 202 ... với gen vùng - Đặc điểm biểu mơ tương hợp với giả thiết bệnh sinh béo phì Từ đó, chúng tơi có đủ luận chọn gen RP5-872K7.2 gen ứng viên cho hội chứng MOMO, ñặc biệt cho triệu chứng béo phì bật hội. .. biến gây bệnh giúp khẳng định vai trò gen BPMS bệnh sinh béo phì KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ Đây báo cáo ñầu tiên bất thường nhiễm sắc thể quan sát thấy hội chứng MOMO, hội chứng gặp với béo phì bệnh... di truyền trội Mục tiêu nghiên cứu Phân lập gen ứng viên gây hội chứng béo phì bệnh lý, bệnh nhân có chuyển đoạn đồng hợp nhiễm sắc thể 16 20 mắc hội chứng MOMO ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU