Phân lập và xác định trình tự gien mã hóa Protein vỏ của virut Y ở khoai tây trồng tại Thái Nguyên

Bài viết nghiên cứu phân lập và xác định trình tự gien mã hóa Protein vỏ của virut PVY ở khoai tây được trồng ở Thái Nguyên nhằm phục vụ cho việc tạo giống khoai tây chuyển gien kháng lại virut đã công bố.

32(1): 81-87 3-2010 Tạp chí Sinh học PHÂN LậP Và XáC ĐịNH TRìNH Tự GIEN M HóA PRôTêIN Vỏ CủA VIRút Y KHOAI TÂY TRồNG TạI THáI NGUYÊN NGUYễN THị TÂM Trờng đại học S phạm, đại học Thái Nguyên CHU HOàNG MậU Đại học Thái Nguyên NGUYễN Vũ THANH THANH Trờng đại học Khoa học, đại học Thái Nguyên Khoai tây (Solanum tuberosum L.) lơng thực đợc trồng rộng r i giới Virút X (Potato virus X - PVX), virót Y (Potato virus Y - PVY), virút gây xoăn (Potato leaf roll virus - PLRV), virót A (Potato virus A PVA), virót M (Potato virus M - PVM), virót S (Potato virus S - PVS) gây bệnh xoắn lùn, khảm virút gây bệnh khoai tây Việt Nam Vì sinh trởng chậm, số lợng khối lợng củ bị giảm đáng kể, suất bị giảm rõ rệt Việt Nam, bệnh virút có khắp vùng trồng khoai tây, phổ biến gây hại nặng virút X vµ Y [1, 2] PVY lµ Potyvirus thuéc hä Potyviridae với hệ gien chứa ARN sợi đơn, kích thớc khoảng 9,7kb PVY gây bệnh nghiêm trọng khoai tây, thuốc lá, cà chua số trồng thuộc họ Cà PVY có nhóm khác nhau, là: PVYO, PVYN, PVYNTN, PVYNWi PVYC PVY gồm protein sau: P1, HC (Helper Component), P3, CI (Cylindrical Inclusion), Nia (Nuclear Inclusion A) , Nib (Nuclear Inclusion B), CP (Coat Protein), 6K1, 6K2 [3] Trong báo này, nghiên cứu phân lập xác định trình tự gien m hãa protein vá (CP-Coat Protein) cđa virót PVY ë khoai tây đợc trồng Thái Nguyên nhằm phục vụ cho việc tạo giống khoai tây chuyển gien kháng lại virút đ công bố Trình tự nucleotit vùng m hóa gien CP từ PVY khoai tây trồng Thái Nguyên dài 801 nucleotit, m hóa 267 axit amin Trình tự nucleotit gien CP trình tự axit amin cđa protein CP tõ PVY cđa khoai t©y đ phân lập tơng đồng cao với trình tự đ công bố Ngân hàng gien NCBI I PHƯƠNG PH¸P NGHI£N CøU VËt liƯu Hai mÉu l¸ khoai tây bị nhiễm bệnh thu từ huyện Phú Bình tỉnh Thái Nguyên đợc kí hiệu ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 Các loại hóa chất, dụng cụ thiết bị phục vụ cho thí nghiệm sinh học phân tử Phơng pháp ARN tổng số đợc tách chiết theo hớng dẫn sử dụng hãa chÊt Trizol Reagent cđa h ng Invitrogen (Mü) Tỉng hỵp cADN theo bé kit First stand cDNA synthesis cđa h ng Fermentas Nh©n gien CP b»ng kü thuËt PCR PCR đợc tiến hành với tổng thể tích phản ứng 25 µl gåm: cADN (50 ng/µl) µl, måi (10 µM) µl, dNTP (2,5 mM) µl, MgCl2 (25 mM) 2,5 µl, Taq polymeraza (5 unit/µl) 0,5 µl, dung dịch đệm PCR (10X) 2,5 àl, H2O khử ion 12,5 àl Chu trình nhiệt bao gồm bớc sau: 94oC-3 phút; 94oC-1 phút, 52oC-50 giây, 72oC-1 phút 30 giây lặp lại 30 chu kì; 72oC - 10 phút lu giữ 4oC Sản phẩm PCR nhân gien CP đợc kiểm tra điện di gel agaroza 1% Gien đợc làm (thôi gel) theo Kit h ng Bioneer gắn vào véctơ pBT (phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học cung cấp), sau đợc biến nạp vào tế bào khả biến E coli 81 chủng DH5 Tách plasmit theo bé Kit cđa h ng Bioneer Tr×nh tù nucleotit cđa gien CP đợc xác định máy đọc trình tự nucleotit tù ®éng ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer cđa h ng Ampplied Biosystem Kết đọc trình tự gien đợc xử lý phần mềm DNAstar BioEdit II KếT QUả Và THảO LUậN Kết nhân gien CP Để phân lập gien CP, đ thu thập M mẫu khoai tây bị nhiễm virút từ huyện Phú Bình, tỉnh Thái Nguyên Sau đó, tiến hành tách ARN tổng số từ mẫu nhiễm bệnh tổng hợp cADN từ ARN tổng số Để phát có mặt gien CP hai mẫu khoai tây bị nhiễm bệnh, sử dụng cặp mồi đặc hiệu đợc cung cấp Phòng Công nghệ tế bào thực vật-Viện Công nghệ sinh học để nhân gien CP Đoạn gien CP đợc nhân lên phơng pháp PCR, kết nhân gien, clony-PCR đợc kiểm tra cách điện di gel agaroza 1% đợc thể hình M 1200bp 1500 bp→ 1000 bp→ 1324bp a b H×nh KÕt PCR nhân gien CP clony-PCR Ghi chú: M Chỉ thị phân tử 1kb; ThaiNguyen1; ThaiNguyen2 Hình 1a cho thấy, đoạn gien đợc nhân lên có kích thớc khoảng 1200 bp Để xác định trình tự gien CP, tiến hành gắn sản phẩm PCR đ tinh vào véctơ tách dòng, biến nạp vào vi khuẩn E.coli chọn dòng gien Quá trình tách dòng đợc thực cách gắn sản phẩm PCR đ tinh vào véctơ tách dòng pBT, biến nạp vào tế bào khả biến chủng E coli DH5 đợc cấy trải đĩa petri có môi trờng LB đặc bổ sung ampixillin 100 mg/ml, X-gal 40 mg/ml IPTG 100 àM ủ đĩa petri đ cấy trải 37oC 16 giờ, kết thu đợc khuẩn lạc xanh trắng Chọn khuẩn lạc trắng nu«i m«i tr−êng LB láng cã bỉ sung ampixillin 100 mg/ml qua đêm Lấy khuẩn mẫu chạy phản ứng clony PCR với cặp mồi pUC18 để xác định khuẩn lạc có plasmit mang gien mong muốn Vì cặp mồi 82 pUC18 cặp mồi đợc thiết kế chung cho véctơ tạo dòng nên kiểm tra sản phẩm PCR vừa dòng hoá kích thớc đoạn gien vừa nhân lên nhiều khoảng 124 nucleotit so với nhân cặp mồi đặc hiệu M Hình Kết điện di tách plasmít mang gien CP Sản phẩm clony PCR từ khuẩn lạc trắng cho kết dơng tính Tiến hành chọn khuẩn lạc trắng tơng ứng với mẫu nghiên cứu có sản phẩm clony PCR nuôi môi trờng LB lỏng sau tách plasmit theo bé kit cđa h ng Bioneer S¶n phÈm ADN plasmit đợc điện di gel agaroza 1%, kết đợc thể hình cho thấy, chiều dài gien CP mẫu nghiên cứu có kích thớc 1201 nucleotit Khi so sánh trình tự BLAST NCBI, kết cho biết trình tự gien m hoá CP virút PVY khoai tây Chúng kết luận đ nhân, tách dòng đọc trình tự thành công đoạn gien m hoá CP virút PVY khoai tây Kết điện di hình cho thấy, sản phẩm tách plasmit sạch, đảm bảo chất lợng số lợng để tiến hành đọc trình tự nucleotit gien CP So sánh trình tự gien vùng mã hóa axit amin hai mẫu nghiên cứu so sánh trình tự axit amin protein CP số trình tự đăng kí NCBI Để xác định xác trình tự nucleotit gien CP đ tách dòng, tiến hành đọc trình tự nucleotit gien CP máy đọc tự động ABI PRISM@ 3100 Avant Genetic Analyzer theo hai chiều xuôi ngợc Kết Chúng quan tâm tới trình tự vùng m hóa gien CP virót PVY ë hai mÉu nghiªn cøu Vïng m hãa axit amin cđa gien CP virót PVY ë mẫu ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 có chiều dài 801 nucleotit (h×nh 3) ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 .| | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 GCAAATGACA CAATTGATGC AGGAGAAAGC AACAAGAAAG ATGCAAAACC GCAAATGACA CAATCGATGC AGGAGGAAGC AACAAGAAGG ATGCAAAACA | | | | | | | | | | 60 70 80 90 100 AGAGCAAGGC AGCATCCAGT CAAACCTGAA CAAAGGAAAA GATAAGGATG AGAGCAAGGC AGCATCCAGC CAAACCTGAA CAAAGAAAAA GATAAGGACG | | | | | | | | | | 110 120 130 140 150 TGAATGCTGG TACATCTGGG ACACATACTG TGCCGAGAAT CAAGGCTATC TGAATGCTGG AACATCTGGG ACACATACTG TGCCGAGAAT CAAGGCTATC | | | | | | | | | | 160 170 180 190 200 ACGTCCAAAA TGAGAATGCC CAAAAGCAAG GGAGCAACCG TGCTAAATTT ACGTCCAAAA TGAGAATGCC CAAAAGCAAG GGAGCAACCG TGCTAAATTT | | | | | | | | | | 210 220 230 240 250 AGAACACTTG CTTGAGTACG CTCCACAACA AATTGATATT TCAAATACTC AGAACACTTG CTTGAGTACG CTCCACAACA AATTGATATT TCAAATACTC | | | | | | | | | | 260 270 280 290 300 GGGCAACTCA ATCACAGTTT GATGCGTGGT ATGAGGCAGT GCGGATGGCA GGGCAACTCA ATCACAGTTT GATGCGTGGT ATGAGGCAGT GCGGATGGCA | | | | | | | | | | 310 320 330 340 350 TACGACATAG GAGAAACTGA GATGCCAACT GTGATGAATG GGCTTATGGT TACGACATAG GAGAAACTGA GATGCCAACT GTGATGAATG GGCTTATGGT | | | | | | | | | | 360 370 380 390 400 TTGGTGCATT GAAAATGGAA CCTCGCCAAA TGTCAACGGA GTTTGGGTTA TTGGTGCATT GAAAATGGAA CCTCGCCAAA TGTCAACGGA GTTTGGGTTA | | | | | | | | | | 410 420 430 440 450 TGATGGATGA GAATGAACAA GTTGAGTACC CGTTGAAACC AATCGTTGAG TGATGGATGA GAATGAACAA GTTGAGTACC CGTTGAAACC AATCGTTGAG | | | | | | | | | | 460 470 480 490 500 AATGCAAAAC CAACCCTTAG GCAAATCATG GCACATTTCT CAGATGTTGC 83 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 AATGCAAAAC CAACCCTTAG GCAAATCATG GCACATTTCT CAGATGTTGC | | | | | | | | | | 510 520 530 540 550 AGAAGCGTAT ATAGAAATGC GCAACAAAAA GGAACCATAT ATGCCACGAT AGAAGCGTAT ATAGAAATGC GCAACAAAAA GGAACCATAT ATGCCACGAT | | | | | | | | | | 560 570 580 590 600 ATGGTTTAAT TCGAAATCTG CGGGATGTGG GTTTAGCGCG TTATGCCTTT ATGGTTTAAT TCGAAATCTG CGGGATGTGG GTTTAGCGCG TTATGCCTTT | | | | | | | | | | 610 620 630 640 650 GACTTTTATG AAGTCACATC ACGAACACCA GTGAGGGCTA GGGAAGCGCA GACTTTTATG AAGTCACATC ACGAACACCA GTGAGGGCTA GGGAAGCGCA | | | | | | | | | | 660 670 680 690 700 CATTCAAATG AAGGCCGCAG CATTGAAATC AGCCCAACCT CGACTTTTCG CATTCAAATG AAGGCCGCAG CATTGAAATC AGCCCAACCT CGACTTTTCG | | | | | | | | | | 710 720 730 740 750 GGTTGGACGG TGGCATCAGT ACACAAGAGG AGAACACAGA GAGGCACACC GGTTGGACGG TGGCATCAGT ACACAAGAGG AGAACACAGA GAGGCACACC | | | | | | | | | | 760 770 780 790 800 ACCGAGGATG TCTCTCCAAG TATGCATACT CTACTTGGAG TCAAGAACAT ACCGAGGATG TCTCTCCAAG TATGCATACT CTACTTGGAG TCAAGAACAT G G H×nh Tr×nh tù nucleotit vïng m hãa cđa gien CP virót PVY ë hai mÉu khoai t©y nhiƠm bƯnh Bảng Vị trí sai khác trình tự nucleotit vïng m· hãa gien CP cđa mÉu nghiªn cøu STT VÞ trÝ 15 26 39 50 70 86 99 111 ThaiNguyen1 T A A C T G T T Hai mÉu khoai tây nghiên cứu có sai khác trình tù gien CP cđa virót PVY vïng m hãa ë vÞ trÝ 15, 26, 39, 50, 70, 86, 99, 111 (hình 3, bảng 1) Do vậy, trình tự gien mẫu có độ tơng đồng cao 99% Chúng tiến hành so sánh hai trình tự axit amin protein CP virút PVY đ phân lập từ Thái Nguyên với số trình tự axit amin protein CP virút PVY đợc công bố 84 ThaiNguyen2 C G G A C A C A NCBI cã m sè AM236801, AY841269, DQ119141, AM236793, AM411504, AY742725, ThaiNguyen1, ThaiNguyen2, AY841268, AM411502, AM411503, AY742732 [4-8] KÕt qu¶ cho thấy, hai mẫu nghiên cứu có độ tơng đồng cao (từ 92,1-98,9%) so với 10 mẫu Ngân hàng gien NCBI Mẫu ThaiNguyen1 tơng đồng cao với mẫu có m sè AY742725 (97,8%) vµ thÊp nhÊt víi m sè AY742732 (92,5%) Kết đợc thể bảng Bảng Hệ số tơng đồng trình tự axit amin cđa protein CP ë hai mÉu nghiªn cøu víi 10 mẫu Ngân hàng gien NCBI Hệ số tơng ®ång HƯ sè kh¸c biƯt 10 11 12 98,1 95,5 97,0 94,4 94,0 95,9 96,6 93,6 96,3 97,0 96,4 ThaiNguyen2 96,6 97,4 93,3 92,9 97,0 97,8 92,5 95,5 97,4 97,6 ThaiNguyen1 97,0 93,3 92,9 98,9 98,5 92,5 95,5 97,8 97,6 AM236793.pro 94,4 94,0 97,4 98,1 92,9 95,5 98,5 97,6 AM236801.pro 93,6 94,8 97,0 96,6 94,0 94,1 AM411502.pro 93,3 94,4 97,4 96,3 93,6 93,7 AM411503.pro 98,9 92,1 95,9 98,1 97,6 AM411504.pro 93,3 97,0 98,5 98,0 AY742725.pro 95,1 93,3 92,9 AY742732.pro 95,9 95,7 10 AY841268.pro 11 AY841269.pro 12 DQ119141.pro 1,9 4,6 3,5 3,1 2,7 3,1 5,8 7,1 7,1 5,8 6,3 7,5 7,5 6,3 1,1 4,2 3,1 1,1 2,7 6,7 7,1 3,5 2,3 1,5 1,9 5,4 5,8 1,1 6,7 7,9 7,9 7,5 3,1 2,7 8,3 7,1 10 3,8 4,6 4,6 4,6 3,5 3,8 4,2 3,1 5,0 11 3,1 2,7 2,3 1,5 6,3 6,7 1,9 1,5 7,1 4,2 12 3,6 2,4 2,4 2,4 6,2 6,6 2,4 2,0 7,5 4,5 1,6 10 11 98,9 Từ kết so sánh tr×nh tù axit amin cđa protein CP ë virót PVY trên, thể kết biểu đồ hình (hình 4) 98,4 12 Hình cho thấy, 12 mẫu so sánh chia thành nhóm: nhóm I gåm mÉu (AM236801, AY841269, DQ119141, AM236793, AM411504, AY742725, ThaiNguyen1, ThaiNguyen2, AY841268), nhãm II gåm mÉu (AM411502, AM411503, AY742732) Trong nhóm I, mẫu ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 đứng nhóm nhỏ tơng đồng cao (98,1%) So sánh trình tự axit amin protein CP hai mẫu nghiên cứu Hình Biểu đồ hình so sánh mức tơng đồng protein CP mẫu nghiên cứu 10 mẫu Ngân hàng gien NCBI ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 Do tr×nh tù nucleotit vïng m hãa cña gien CP ë mẫu nghiên cứu có độ tơng đồng cao nên trình tù axit amin cđa protein CP ë hai mÉu nµy có độ tơng đồng cao Kết đợc thĨ hiƯn ë h×nh | | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 ANDTIDAGES NKKDAKPEQG SIQSNLNKGK DKDVNAGTSG THTVPRIKAI ANDTIDAGGS NKKDAKQEQG SIQPNLNKEK DKDVNAGTSG THTVPRIKAI | | | | | | | | | | 60 70 80 90 100 TSKMRMPKSK GATVLNLEHL LEYAPQQIDI SNTRATQSQF DAWYEAVRMA TSKMRMPKSK GATVLNLEHL LEYAPQQIDI SNTRATQSQF DAWYEAVRMA | | | | | | | | | | 110 120 130 140 150 YDIGETEMPT VMNGLMVWCI ENGTSPNVNG VWVMMDENEQ VEYPLKPIVE YDIGETEMPT VMNGLMVWCI ENGTSPNVNG VWVMMDENEQ VEYPLKPIVE 85 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 | | | | | | | | | | 160 170 180 190 200 NAKPTLRQIM AHFSDVAEAY IEMRNKKEPY MPRYGLIRNL RDVGLARYAF NAKPTLRQIM AHFSDVAEAY IEMRNKKEPY MPRYGLIRNL RDVGLARYAF | | | | | | | | | | 210 220 230 240 250 DFYEVTSRTP VRAREAHIQM KAAALKSAQP RLFGLDGGIS TQEENTERHT DFYEVTSRTP VRAREAHIQM KAAALKSAQP RLFGLDGGIS TQEENTERHT | | | 260 TEDVSPSMHT LLGVKNM TEDVSPSMHT LLGVKNM Hình So sánh tr×nh tù axit amin cđa protein CP ë hai mÉu nghiên cứu Bảng Vị trí sai khác trình tù axit amin cđa protein CP ë hai mÉu nghiªn cøu STT VÞ trÝ 18 24 29 ThaiNguyen1 E P S G Tr×nh tù axit amin cđa protein CP ë mÉu nghiªn cøu chØ sai khác vị trí 9, 18, 24, 29 (hình 6, bảng 3) Kết phân lập xác định trình tự gien CP virút PVY hai mẫu khoai tây Thái Nguyên sở để thiết kế véctơ chuyển gien kháng virút gây bệnh khoai tây trồng Thái Nguyên III KếT LUậN Chúng đ nhân đợc gien CP phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm PCR đợc dòng hoá nhờ véctơ pBT Đoạn m hóa dài 801 nucleotit m hóa sản phẩm protein dài 267 axit amin So sánh trình tù axit amin cđa protein CP ë mÉu nghiªn cứu với 10 mẫu Ngân hàng gien quốc tế NCBI cho thấy độ tơng đồng cao (trên 92%) TàI LIệU THAM KHảO Đờng Hồng Dật, 2005: Cây khoai tây kỹ thuật thâm canh tăng suất, Nxb Lao động - X hội Trơng Văn Hộ cs., 1990: Điều tra bảo quản khoai tây giống Đồng Bằng Bắc Bộ, Một số kết nghiên cứu khoa học khoai tây (1986-1990): 77-82 Nxb Nông 86 ThaiNguyen2 G Q P E nghiƯp, Hµ Néi Misisiou A et al., 2004: Molecular breeding, 14: 185-197 Nguyen H M et al., 2006: Accession AM411502, Potato virus Y partial gene for polyprotein, genomic RNA, isolate VNYThaibinh Http://www ncbi.nlm.nih.gov Nguyen H M., Chu H H., Pham V T., Le B T., 2006: Accession AM411503, Potato virus Y partial gene for polyprotein, genomic RNA, isolate VNY-Namdinh Http://www.ncbi.nlm.nih.gov Nguyen H M., Chu H H., Pham V T., Le B T., 2006: Accession AM411504, Potato virus Y partial gene for polyprotein, genomic RNA, isolate VNY-Hanoi Http://www ncbi.nlm.nih.gov Tian Y., Liu J., Zhu X., Li X., Valkonen J P T., 2008: Accession AM236793, Potato virus Y partial gene for polyprotein, coat protein region,genomic RNA, isolate Anhui2 Http://www ncbi.nlm.nih.gov Tian Y., Liu J., Zhu X., Li X., Valkonen J P T., 2008: Accession AM236801, Potato virus Y partial gene for polyprotein, coat protein region,genomic RNA, isolate Gansu5 Http://www ncbi.nlm.nih.gov CLONING AND SEQUENCING OF THE GENES ENCODING COAT PROTEIN (CP) IN POTATO VIRUS Y FROM THAI NGUYEN province NGUYEN THI TAM, CHU HOANG MAU, NGUYEN VU THANH THANH SUMMARY Potato (Solanum tuberosum L.) is the most widely distributed crop in tropical and subtropical zones of the world Among diseases potato viruses play major role in reducing the yield PVX (Potato virus X), PVY (Potato virus Y), PLRV (Potato leaf roll virus), PVA (Potato virus A), PVM (Potato virus M), PVS (Potato virus S) are major viral diseases occurring in Vietnam PVY (Potato virus Y) is the type member of the genus Potyvirus of the family Potyviridae The virus has a long filamentous particle containing one single-stranded, positive sense RNA genome of approximately 9.7 kb PVY is an important pathogen infecting potato, tobacco, tomato and other solanaceous plant species Different potato PVY isolates occur that can be categorized in groups: PVYO, PVYN, PVYNTN, PVYNWi and PVYC In this paper we report cloning and sequencing of coat protein (CP) gene of PVY from Thai Nguyen potato The CP gene of this isolate was found to be 801 nucleotides long, coding for 267 amino acids Comparison amino acid of CP protein in potato from Thai Nguyen with ten sequences on NCBI showed that amino acid was 92.1-98.9% homology Ngµy nhËn bµi: 21-7-2007 87 ... 6, bảng 3) Kết phân lập xác định trình tự gien CP cđa virót PVY cđa hai mÉu khoai t y Thái Nguyên sở để thiết kế véctơ chuyển gien kháng virút g y bệnh khoai t y trồng Thái Nguyên III KếT LUậN... trình tự gien vùng mã hóa axit amin hai mẫu nghiên cứu so sánh trình tự axit amin protein CP số trình tự đăng kí NCBI Để xác định xác trình tự nucleotit gien CP đ tách dòng, tiến hành đọc trình tự. .. CAGATGTTGC 83 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 ThaiNguyen1 ThaiNguyen2 AATGCAAAAC