Bài viết trình bày kết quả tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên Cyfra.1 từ máu bệnh nhân mắc bệnh ung thư phổi dạng ung thư tế bào không nhỏ.
30(3): 165-168 9-2008 Tạp chí Sinh học Tách dòng xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên ung th phổi, CYFRA 21.1 Lê Đình Chắc Đại học Hồng Đức, Thanh Hoá Lã Thị Huyền, Lê Quang Huấn Viện Công nghệ sinh học Ung th phổi phân dạng: ung th tế bào nhỏ (small cell lung cancer, SCLC) ung th tế bào không nhỏ (non-small cell lung cancer, NSCLC) Các kháng nguyên thờng đợc sử dụng nh thị để chẩn đoán ung th phổi là: kháng nguyên xuất tế bào thần kinh (neuron specific enolase, NSE), kháng nguyên xuất tế bào mầm (carcinoembryonic antigen, CEA), cytokeratin 19, kháng nguyên xuất tế bào vảy (squamous cell carcinoma antigen, SCC), kháng nguyên CA 125 kháng nguyên polypeptide đặc hiệu mô (TPA) [1, 2] NSE izoenzyme enolaza đợc cấu tạo chuỗi polypeptide gần nh đồng nhất, chuỗi có khối lợng phân tử 39kDa đợc tạo nơron thần kinh trung tâm ngoại biên, khối u ác tính có nguồn gốc thần kinh ngoại bì Ngoài ra, NSE đuợc tìm thấy tế bào hồng cầu, huyết tơng tiểu cầu CEA glucoprotein có khối lợng phân tử khoảng 180 kDa đợc tạo trình phát triển phôi bào thai CEA thị đợc phát có liên quan tới khối u ung th đại tràng, ung th vú, ung th dày ung th phổi SCC protein có khối lợng phân tử 48 kDa có tơng đồng cao với chất ức chế protease thc hä serpin Nång ®é cđa SCC hut đợc sử dụng chẩn đoán bệnh ung th− cỉ tư cung, ung th− thùc qu¶n, ung th− đầu, ung th cổ đặc biệt ung th phổi CA 125 protein có khối lợng phân tử khoảng 200 kDa thờng đợc sử dụng làm thị chẩn đoán ung th buồng trứng, ung th− vó vµ ung th− phỉi TPA còng gièng nh− CEA dấu đợc biết đến từ lâu Xác định hàm lợng TPA thông qua xác định hàm lợng hỗn hợp cytokeratins 8, 18 19 [3] CYFRA 21.1 thị mới, đặc hiệu cho ung th phổi dạng NSCC Kháng nguyên CYFRA 21.1 phân đoạn cytokeratins 19 (CK19), tồn dới dạng hòa tan huyết thanh, nên CYFRA21.1 đợc xem kháng nguyên hữu ích chuẩn đoán bệnh ung th phổi sử dụng kháng thể đơn dòng kháng lại CK19 [4, 5] Để tạo kháng thể tái tổ hợp kháng lại kháng nguyên CYFRA21.1 sử dụng chẩn đoán sớm bệnh ung th phổi, nhân gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21.1 từ bệnh phẩm bệnh nhân mắc bệnh ung th phổi Trong công trình thông báo kết tách dòng xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21.1 từ máu bệnh nhân mắc bệnh ung th phổi dạng NSCLC I phơng pháp nghiên cứu T¸ch chiÕt ARN tõ m¸u theo Kit S.N.A.P cđa h·ng Invitrogen Quy trình nhân đoạn gen CK19 từ RNA tổng số đợc tiến hành theo kit one-step RT-PCR hãng Invitrogen với cặp mồi CYFRAF: 5'-aagctaaccatgcagaacctcaacgac cgc-3' CYFRAR: 5'-ttattggcaggtcaggagaaga gcc Phơng pháp gắn sản phẩm PCR vào vector Topo-TA-PCRTM2.1 tiến hành theo kit hãng Invitrogen Xác định trình tự gen đợc tiến hành theo phơng pháp Sanger cs 1981, máy xác định trình tự gen tự động ABI PRISM 3100-Avant Viện Công nghệ Sinh học 165 II Kết thảo luận Tách ARN tổng số từ máu bệnh nhân ung th phổi Trong đề tài này, mẫu máu (sau gọi bệnh phẩm) bệnh nhân chẩn đoán mắc bệnh ung th phổi phơng pháp miễn dịch đợc sử dụng làm nguyên liệu tách chiết ARN tổng số ARN tổng số sau tách chiết đợc kiểm tra phơng pháp điện di gel agarose 1% (hình 1) Hình ảnh điện di ARN tỉng sè trªn gel agarose 1% GiÕng 1, 2, ARN tổng số tách chiết từ máu bệnh nhân mắc bệnh ung th phổi Theo lý thuyết, trình mã (transcription) sinh vật nhân chuẩn xảy nhân tạo ARN vận chuyển (tARN), ARN ribosome (rARN) ARN thông tin (mARN) Trong ba loại ARN rARN thờng đợc tổng hợp nhiều có thành phần rARN 28S, rARN 18S, rARN 5,8S Do ®ã, ®iƯn di ARN tỉng số xuất ba băng sáng đờng chạy điện di, tơng ứng với rARN 28S, 18S 5,8S Tuy nhiên, để đánh giá chất lợng mẫu ARN tách chiết ngời ta quan tâm tới hai băng rARN 28S rARN 18S xuất băng thể mẫu ARN tách đợc nguyên vẹn Nh vậy, khẳng định tách chiết đợc ARN tổng số từ bệnh phẩm nguyên vẹn bảo đảm cho nghiên cøu tiÕp theo Theo tÝnh to¸n lý thuyÕt mARN chØ chiÕm tØ lƯ nhá (2-8%) mÉu ARN tỉng sè nhng đủ để nhân gen quan tâm sử dụng phản ứng RT-PCR với khuôn (template) mẫu ARN tổng số 166 Nhân gen mã hoá kháng nguyên CYFRA21.1 Theo nguyên tắc, gen mã hoá cho protein phải đợc phiên mã thành mARN trớc đợc dịch mã sinh vật nhân chuẩn, cấu trúc đa số gen thờng bao gồm đoạn intron không mã hoá xen kẽ với đoạn exon m· hãa Gen CK19 gåm exon xen kÏ vùng intron [6] Do đó, trình phiên mã thờng tạo phân tử mARN có kích thớc lớn gọi tiền mARN Các tiền mARN đợc hiệu chỉnh sau dịch mã: loại bỏ đoạn trình tự intron, tạo mũ đầu gắn đuôi poly A đầu 3, cuối tạo phân tử mARN hoàn chỉnh Tiếp theo, phân tử mARN đợc chuyển tế bào chất để tham gia vào trình dịch mã tạo phân tử protein Vì thế, muốn tạo protein tái tổ hợp mà nguồn gen từ sinh vật nhân chuẩn phải nhân gen mã hoá cho protein từ mARN hoàn chỉnh Một cách khác, tạo th viện cDNA sau nhân gen mong muốn từ th viện Trong nghiên cứu mình, tiến hành nhân cDNA m· ho¸ cho CYFRA21.1 tõ mARN cã ARN tổng số thu đợc thông qua phản ứng RT-PCR Phản ứng RT-PCR, sở phản ứng PCR, gồm hai giai đoạn Đó giai đoạn tổng hợp cDNA (complementary DNA) nhờ xúc tác enzIm phiên mã ngợc mồi (thờng oligo T đợc sử dụng nh mồi nhân gen, sử dụng mồi ngẫu nhiên - ADN random primer) giai đoạn thứ hai giai đoạn tổng hợp ADN sợi khuôn cDNA giai đoạn thứ nhất, hầu hết loại mARN tạo nên cDNA chúng Trong giai đoạn thứ hai, cDNA mang trình tự mã hoá cho protein mong muốn đợc khuếch đại nhiều lần dới tác dụng Taq-ADN polymerase cặp mồi đặc hiệu Phản ứng RT-PCR đợc tiến hành máy PCR với chu trình nhiệt nh− sau: b−íc 1: 50°C, 30 phót; b−íc 2: 94°C, phót; b−íc 3: 94°C, 15gi©y; b−íc 4: 57°, 30 gi©y; b−íc 5: 72°C, 30 gi©y; b−íc 6: lặp lại 30 chu kì từ bớc 3; bớc 7: 72C, phút; sau sản phẩm giữ 4C Sản phẩm phản ứng RT-PCR đợc kiểm tra điện di gel agarose 1% (hình 2) 1 2 Sản phẩm RT-PCR~ 1000bp Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR gel agarose 1% GiÕng S¶n phÈm RT-PCR; Thang ADN chuÈn kb Kết điện di gel agarose cho thấy đờng chạy thứ xuất băng sáng đậm, so với thang ADN chuẩn băng có kích thớc khoảng 1000 bp Kết không mâu thuẫn với tính toán lý thuyết độ dài gen CYFRA21.1 Nh vậy, cho gen mã hoá cho CYFRA21.1 đợc nhân Tuy nhiên để khẳng định chắn cần phải tách dòng xác định đợc trình tự gen nhân so sánh với trình tự gen CYFRA21.1 công bố Ngân hàng gen quốc tế Kết tách dòng gen CYFRA21.1 cắt kiểm tra enzym giới hạn EcoRI đợc thể hình AAGCTAACCA CCAACAGCAA CAGCCACTAC ATTGTCCTGC GGGTGCTGGA GGCCTACCTG GTGAGGGTGG AAGCAGAACT GCCACATAGA GATTGAGCTG TTTGGAGCCC CTGATGGTGA GCTTGAGGGC GGCCTCTGCT CTTCTCCTGA TGCAGAACCT GCTGGAGGTG TACAGGACCA AGATCAACAA TGAGGTGACC AAGAAGAAGC ATTCAGCTCG GGAAGGATGC GCAGCTCCAG CACTCGCAGC AGCTGGTGCA GTGGCAGAAT CAGGAAGATC CTCCTCAAAG CCTGCCAATA CAACGACCGC AAGCTCCGTG TCGAGGACCT TGCTCAACTG CTGGCCAGGA ATGAGGAGGA GACCTGCCAA TGAAGCCTGG ATAAGCAGGT TCAGCGTGAA GATCCAGGCA CAGGAGTACC ATTACAACAA CACGTCTCCT A Hình Kiểm tra kết tách dòng gen CYFRA21.1 gel agarose 1% Ghi chú: giếng Thang ADN chuÈn 1kb; 2, ADN plasmid chøa gen CYFRA21.1; ADN plasmid c¾t enzym EcoRI; GiÕng 6: Sản phẩm RT-PCR Trên ảnh điện di (hình 3) ta thấy ADN plasmit tách từ khuẩn lạc trắng đợc chọn ®Ĩ xư lý b»ng enzIm EcoRI ®· xt hiƯn đoạn ADN có kích thớc tơng đơng kích thớc sản phẩm phản ứng RT-PCR có kích thớc vào khoảng 1000 bp so với ADN thị (Marker ADN cắt với enzym HindIII EcoRI) Nh vậy, khẳng định sản phẩm RT-PCR gắn đợc vào vectơ tách dòng pCR 2.1, nói cách khác kết tách dòng gen mã hoá CYFRA21.1 đợc thực thành công, nhiên để khẳng định cần xác định trình tự nucleotit sản phẩm RT-PCR Trình tự nucleotide sản phẩm nhân RTPCR đợc xác định cụ thể nh sau: CTGGCCTCCT ACTAGTACCA GCGGGACAAG GCTGCACATG CTGATCTGGA AATCAATGCC GATCCTGAGT TTCACCAGCT CCGAGGTCAC AGCTCCCTTA CTGATCAGCA AGCGGCTCCT CCTGTCCACC GGGTAGGAGG ACCTGGACAA GGTGCACGCC GAAGCAGGGG CACAGGCCCT ATTCTTGGTG CCACCATTGA ACTTCTGAAC CAAGTTTGGT GGCACAGATC AAAGGCCTGA CTGAGGGGCC AAGTGGGAGA GACAGGCAAA GCCAATATGA GGACTGAGGA ACTGAACCAG TGACCTGCAG TGCACCCTCC GAAGGCACAC TGGCAGAAAC GTATTGAAGC CCAGCTGGGC GGAGCAGGAG ATCGCCACCT TCCAAGGTCC TCTGAGGCTG ATGGGAAGGA AGAGACCCTT CTGGAGGCAG CCCACAACTA GAACGCCAGG TTGAGTGTTT AGGAAGAGCT CCAGGTCCAT GATCATGGCC GAGGTCACTG AGGGTCTTGA AGAGGCATGC GATGTGCGAG ATCGCAGCCT CAGGCTCTGG ACCCCTGGCT 167 Trình tự nucleotide sản phẩm thu đợc có độ tơng đồng 99,82% so sánh với trình tự nucleotide gen CYFRA21.1 có số đăng ký AB041270 đợc công bố Ngân hàng gen quốc tế Sự sai khác đợc xác định vị trí nucleotide G766C (G đợc thay C) Từ kết khẳng định nhân đợc gen CYFRA21.1 mã hóa cho kháng nguyên cytokeratin CYFRA21.1 từ bệnh phẩm bệnh nhân ung th phổi Nh biết cytokeratin họ polypeptit đa gen Ngời ta xác định đợc 20 loại cytokeratin biểu tế bào biểu mô bình thờng, tế bào khối u tế bào nuôi cấy [8] CK19 với khối lợng phân tử khoảng 40 kDa đợc sử dụng nh thị di chuyển tế bào biểu mô để chẩn đoán di ung th CYFRA21.1 phân đoạn CK19 tồn dới dạng hòa tan huyết thanh, nên CYFRA21.1 đợc xem kháng nguyên hữu ích chẩn đoán ung th phổi đợc chứng minh thích hợp chẩn đoán ung th tế bào hình vảy phổi [8, 9] Nh vậy, với kết nhân đợc gen CYFRA21.1 từ bệnh phẩm ủng hộ kết luận bệnh nhân m¾c bƯnh ung th− phỉi III KÕt ln RNA tổng số đợc tách từ bệnh phẩm ung th phổi có độ tinh cần thiết cho thí nghiệm Đã nhân thành công gen mã hoá cho kháng nguyên CYFRA21.1 kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi CYFRAF/CYFRAR Đã tách dòng xác định trình tự nucleotide gen mã hoá cho kháng nguyên CK19 Kích thớc đoạn gen tách dòng 1001 bp có độ tơng đồng 99,82% so với trình tự gen mã hoá cho kháng nguyên CYFRA21.1 công bố Ngân hàng gen quốc tế với số ký AB041270 Tài liệu tham khảo Sanger F et al., 1981: Nature, 290: 457465 Debus E et al., 1984: Am J Pathol, 114: 121-130 Broers J L et al., 1988: Cancer Res, 48: 3221-3229 Akoun G et al., 1985 : Chest, 87: 39-43 Ebert W et al., 1989: Ärztl Lab, 35: 1-10 Wu F et al., 2002: International Journal of Oncology, 20: 31-37 Stieber P et al., 1993: Cancer Res, 53: 6166 Satoh H et al., 1997: Am J Respir Cell Mol Biol., 16: 597-604 CLONING AND SEQUENCING OF GENE CODING ANTIGEN OF LUNG CANCER, CYFRA 21-1 Le Dinh Chac, La Thi Huyen, Le Quang Huan Summary Cytokeratin 19 (CK19), with a molecular weight of 40 kDa, is the specific cytoskeletal structure of simple epithelia CK19 has been used as a marker of circulating epithelial cells to diagnose cancer metastasis since it is probably one of the most suitable markers for cancer One of the fragments of CK19, CYFRA 21-1, has been introduced as a tumor marker for primary lung cancer and proven suitable for the diagnosis of squamous cell carcinoma of the lung We have amplified the gene encoding for CYFRA 21-1 from the lung cancer samples by RT-PCR technology with the specific primers The gene sequence has a length of 1001 bp and its homology with the gene sequence CYFRA 21.1 (accession number AB041270) from the GenBank data is 99.82% This sequence has one point mutation G766C when compared with CYFRA 21-1 gene sequence from the GeneBank Ngµy nhËn bµi: 27-8-2008 168 ... gen mã hoá cho kháng nguyên CYFRA2 1.1 kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi CYFRAF/CYFRAR Đã tách dòng xác định trình tự nucleotide gen mã hoá cho kháng nguyên CK19 Kích thớc đoạn gen tách dòng 1001 bp có... dài gen CYFRA2 1.1 Nh− vËy, chóng t«i cho r»ng gen m· hoá cho CYFRA2 1.1 đợc nhân Tuy nhiên để khẳng định chắn cần phải tách dòng xác định đợc trình tự gen nhân so sánh với trình tự gen CYFRA2 1.1... Nh vậy, khẳng định sản phẩm RT-PCR gắn đợc vào vectơ tách dòng pCR 2.1, nói cách khác kết tách dòng gen mã hoá CYFRA2 1.1 đợc thực thành công, nhiên để khẳng định cần xác định trình tự nucleotit