Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết thông báo kết quả phân lập vùng preS gien kháng nguyên bề mặt của virut viên gan B, bước đầu tiên trong việc hoàn thiện bộ Kit chẩn đoán sự lây nhiễm virut viêm gan B.
25(4): 32-36 12-2003 Tạp chí Sinh học Tách dòng xác định trình tự vùng pres gien kháng nguyên bề mặt virút viêm gan b văn quyền, đinh kháng Viện Công nghệ sinh học Yu Yeon Gyu Viện Khoa học Công nghệ Hàn Quốc Viêm gan virút viêm gan B (HBV) vấn đề sức khỏe y tế cộng đồng toàn cầu, nguyên nhân hàng đầu gây nên bệnh viêm gan m n tính xơ gan [1, 11] Theo −íc tÝnh cđa Tỉ chøc Y tÕ thÕ giíi (WHO), hiƯn cã trªn tû ng−êi cã tiỊn sư nhiễm HBV khoảng 400 triệu ngời nhiễm HBV m n tính, số ngời chết liên quan trực tiếp đến nhiễm HBV hàng năm lên tới triệu ngời [4, 7] Tuy nhiên, cha có hóa trị liệu đặc hiệu để điều trị bệnh viêm gan B Phơng pháp để tránh bị viêm gan B dự phòng vắc xin, đợc coi phơng pháp hữu hiệu để dự phòng ung th gan nguyên phát [5, 9] Riêng Việt Nam, theo báo cáo tác giả khác nhau, tỷ lệ nhiễm HBV dao động từ 10-15% [2, 10] Trong khoảng 20% trờng hợp viêm gan B mạn tính chuyển thành xơ gan với triệu chứng nặng, dẫn đến tử vong Việt Nam đợc xếp vào số quốc gia cã tû lƯ ng−êi nhiƠm HBV cao nhÊt thÕ giíi Việc toán đợc bệnh hiểm nghèo phụ thuộc vào tính hiệu lực, độ an toàn loại vắc xin viêm gan B lu hành Các hớng nghiên cứu nhằm tìm loại vắc xin có hiệu lực độ an toàn cao, hay nói cách khác có khả tạo đáp ứng miễn dịch mạnh thể HBV không gây phản ứng phụ Một hớng nghiên cứu tạo vắc xin viêm gan B tái tổ hợp (recombinant vaccine) sở tách dòng biểu gien kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B, bao gồm vùng preS S Ngoài ra, việc phát sớm lây nhiễm HBV, từ có liệu pháp điều trị kịp thời vô quan trọng cần thiết, vấn đề đợc nhiều phòng thí nghiệm giới quan tâm nghiên cứu Trong này, thông báo kết phân lập vùng preS gien kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B, bớc việc hoàn thiện Kit chẩn đoán lây nhiễm virút viêm gan B I phơng pháp nghiên cứu ADN tổng số tách chiết từ khèi u cđa bƯnh nh©n ung th− gan cã mang ADN virút viêm gan B đ đợc tách chiết bảo quản -750C Các cặp mồi đặc hiệu để tách dòng vùng preS, đợc thiết kế chơng trình phần mềm PC/Gene đợc tổng hợp Trung tâm Nghiên cứu sinh học cấu trúc, Viện Khoa học Công nghệ Hàn Quốc, có trình tự nh sau: CỈp måi 1: HBVBN1: 5'- ATC GCG CCA TGG GGA CGA ATC TTT CTG TTC CC-3' HBVVN2: 5' - GCT ACC GGA TCC TAA CGC CGC AGA CAC ATCCAG CGA TGA-3' CỈp måi 2: Q-BamHI: 5'-GGCATCGGATCCATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCC-3' BamH I 32 Q-SalI : 5'-GTCACCGTCGACTGAGGTTGGGGACTGCGAATTTTG-3' Sal I PCR đợc tiến hành theo chơng tr×nh: B−íc 1: 94oC - B−íc 2: 94oC - B−íc 3: 55oC - 50 gi©y B−íc 4: 72oC - LËp l¹i 30 chu kú tõ b−íc ®Õn b−íc B−íc 5: 72oC - phút Tách dòng gien đợc tiến hành gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vectơ pCRTM2.1, sau đợc biến nạp vào E coli chủng DH5 điểm Sản phẩm PCR vòng sau đợc sử dụng làm sợi khuôn cho PCR lần để nhân vùng preS lần chạy PCR thứ hai, sử dụng 1àl 2àl sản phẩm PCR lần làm khuôn với mục đích tìm đợc nồng độ khuôn thích hợp cho phản ứng nhân gien Xác định trình tự nucleotit đoạn gien tách dòng đợc thực theo phơng pháp Sanger cs [6] II Kết thảo luận Để tách dòng biểu vùng preS, trớc hết phải tách ADN chứa gien HBV, công việc đ đợc phòng thí nghiệm tiến hành trớc [3] Sau đ tách chiết đợc ADN chứa hệ gien HBV tiến hành phân lập vïng preS b»ng kü thuËt PCR lång (nested PCR) Dùa vào trình tự vùng preS đ đợc công bố Ngân hàng Dữ liệu gien Quốc tế, thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân vùng preS Víi kü tht PCR lång, chóng t«i sư dơng cặp mồi Cặp mồi thứ tạo sản phẩm PCR có kích thớc khoảng 1400 cặp bazơ chứa toàn gien kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B (hbs+preS) Sau khuếch đại kỹ thuật PCR, sản phẩm PCR vòng đợc điện di kiểm tra gel agaroza 1% Kết điện di đợc phản ánh hình (1) Do lợng ADN HBV so với lợng ADN tổng số đợc tách từ khèi u cđa bƯnh nh©n ung th− gan rÊt nhá, nhiều trờng hợp sử dụng PCR lần, hay nói cách khác dùng cặp mồi không tạo đợc sản phẩm PCR mong muốn (hình 1) lợng ADN khuôn thấp Hơn nữa, tăng nhiều lợng ADN tổng số làm khuôn ban đầu điều làm cho PCR xảy không đặc hiệu cho nhiều sản phẩm phụ Với kỹ thuật PCR lồng, khắc phục đợc nhợc Hình Kết kiểm tra sản phẩm PCR vòng vòng hai gel agaroza 1% Ghi chú: Đờng chạy M : ADN Fx cắt Hae III Đờng chạy 1: sản phẩm PCR vòng (1àl PCR vòng làm khuôn) Đờng chạy 2: sản phẩm PCR vòng Đờng chạy 3: sản phẩm PCR vòng (1àl PCR vòng làm khuôn) Với cặp mồi này, sản phẩm PCR mang đoạn gien với kích th−íc 660 bp gåm toµn bé vïng preS dµi 490 bp vµ 170 bp cđa vïng S Mong mn ban đầu tách dòng biểu đợc toàn gien kháng nguyên bề mặt lớn (gien hbsL) cña HBV, bao gåm vïng preS + vïng S Tuy nhiên, điều đ không thực đợc gien m hóa protein bề mặt loại nhỏ (gien hbs) có bốn vùng trình tự xuyên màng (transmembrane sequence), vùng ức chế biểu gien E coli Vì vậy, để biểu đợc, đ cắt bỏ vùng trình tự xuyên màng, giữ lại 170 nucleotit gien hbs với hy vọng đoạn lại gien có mang 33 định kháng nguyên quan trọng Sản phẩm PCR vòng hai đợc kiểm tra điện di gel agaroza 1% Kết (hình 1) cho thấy vùng preS đ đợc nhân lên đặc hiệu, thể băng sáng rõ nét, có kích thớc khoảng 0.7kb nh mong muốn Điều chứng tỏ chơng trình PCR mà sử dụng phù hợp Sản phẩm PCR lần đợc tách dòng cách gắn trực tiếp vào vectơ tách dòng pCRTM2.1 với tham gia cđa enzym T4 ADN ligaza, sau ®ã biÕn nạp vào chủng vi khuẩn E coli DH5 Các thể biến nạp sau đợc cấy trải đĩa petri có chứa môi trờng LB chọc lọc có thành phần: 1% trypton; 1% yeast extract; 1% NaCl; 2% Bacto agar; pH = 7,4; cã bæ sung IPTG mM; X-gal 40 àg/ml ampixilin 100 àg/ml Để chọn lọc dòng tế bào chứa plasmit có mang đoạn ADN ngoại lai, nhặt ngẫu nhiên 16 khuẩn lạc riêng rẽ màu trắng khuẩn lạc màu xanh làm đối chứng, nuôi cấy tách chiết plasmit Các plasmit có kích thớc lớn plasmit pCRTM2.1 gốc đợc chọn, để phân tích tiếp Chúng chọn plasmit có kích thớc lớn plasmit gốc để phân tích tiÕp b»ng enzym c¾t giíi h¹n K 10 11 12 13 14 15 16 H×nh Kết điện di ADN plasmit gel agaroza 1% để chọn lọc plasmit pCRTM2.1 tái tổ hợp có khả chứa vùng preS ngoại lai Ghi chú: Đờng chạy K: plasmit pCRTM2.1 gốc, Đờng chạy 1-16: plasmit từ 1-16 Vì cấu trúc vectơ pCRTM2.1 có vị trí cắt EcoR I nằm hai đầu vùng nối ghép đa vị, vectơ pCRTM2.1 mang vùng preS cắt enzym EcoR I tạo đoạn ADN có kích thớc khoảng 0,7 kb Kết cắt đợc phản ánh hình ~700 → H×nh KÕt điện di gel agaroza 1% kiểm tra plasmit pCRTM2.1 mang đoạn ADN ngoại lai sau cắt EcoR I Ghi chú: Đờng chạy 1-8: plasmit từ 1-8 Đờng chạy 9: sản phẩm PCR vòng (dùng làm đối chứng) 34 Kết hình cho thấy plasmit 1, 2, cắt kiểm tra EcoRI đ tách đoạn ADN có kích thớc kích thớc sản phẩm PCR vòng (đờng chạy 9) đợc sử dụng làm đối chứng Phân tích enzym giới hạn xem nh đ tách dòng thành công vùng preS Tuy nhiên, để khảng định cách chắn, tiến hành xác định đợc trình tự nucleotit đoạn gien vừa tách dòng ID preS PRELIMINARY; DNA; SQ SEQUENCE 660 BP; 151 A; ATGGGGACGA ATCTTTCTGT TCCCAATCCT CCTGCGTTCG GAGCCAACTC AAACAATCCA TGGCCAGAGG CGAATCAGGT AGGAGCGGGA GGCGGTCTTT TGGGGTGGAG CCCTCAGGCT CCTCCTCCTG CCTCCACCAA TCGGCAGTCA CTAAGAGACA GTCATCCTCA GGCCATGCAG CTAGATCCCA GAGTGAGGGG CCTATATTTT AACCCTGTTC CGACTACTGC CTCTCCCATA GCACCGAACA TGGAGAACAC AACATCAGGA GGGTTTTTCT TGTTGACAAG AATCCTCACA TCTCTCAATT TTCTAGGGGG AGCACCCACG Để xác định trình tự nucleotit cđa vïng preS, chóng t«i sư dơng bé kÝt xác định trình tự ADN h ng Amersham-Pharmacia Biotech với máy đọc trình tự ADN ALF-Express h ng Pharmacia, sử dụng mồi T7 promotơ M13 teminator, vị trí bắt cặp mồi đ đợc thiết kế sẵn vectơ pCRTM2.1 dùng cho việc xác định trình tự nucleotit gien tách dòng Kết xác định trình tự nucleotit đợc phản ánh hình 660 BP 206 C; CTGGGATTCT GATTGGGACT GCATTCGGGC CAGGGCATAT GGAAGACAGC TGGAATTCCA CCTGCTGGTG TCGTCAATCT TTCCTAGGAC ATACCGCAGA TGTCCTGGCC 157 G; 146 T; TTCCCGATCA CCAGTTGGAC TCAACCCCAA CAAGGATCAC CAGGGTTCAC CCCACCACAC TGACAGCAGT GCCAGCAGCG CTACTCCCAT CTCTCCACCT CAACATTCCA CCAAGCTCTG GCTCCAGTTC CGGAACAGTA TCTCGAGGAC TGGGGACCCT CCCTGCTCGT GTTACAGGCG GTCTAGACTC GTGGTGGACT AAAATTCGCA GTCCCCAACC 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 Hình Trình tự nucleotit vùng preS đợc xác định máy đọc trình tự ADN ALF-Express h ng Pharmacia Sử dụng chơng trình Aligment phần mềm DNA Star để so sánh kết trình tự nucleotit vùng preS đợc tách dòng với trình tự nucleotit vùng preS đợc công bố Ngân hàng Dữ liệu gien Quốc tế, khẳng định đ tách dòng thành công vùng preS đoạn gồm 170 nucletotit vùng S gien kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B Kết so sánh cho thấy mức độ tơng đồng trình tự nucleotit vùng preS phân lập Việt Nam với trình tự nucleotit vùng preS công bố Ngân hàng Dữ liệu gien Quốc tế cao từ 90 - 97% Đặc biệt với vùng preS Sugauchi F cộng đ công bố [8], kết cho thấy tơng đồng đạt tới 98,94% Kết gợi ý cho chủng virút HBV gây bệnh Việt nam chủng Sugauchi F cs công bố phân typ adr III KÕt luËn B»ng kü thuËt PCR lång (nested PCR) với việc sử dụng cặp mồi đặc hiệu, đ nhân thành công vùng preS đoạn gồm 170 nucleotit thuộc vùng S gien kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B từ ADN tỉng sè t¸ch chiÕt tõ khèi u cđa bƯnh nhân ung th gan có mang ADN virút viêm gan B Vùng preS sau đợc tách dòng vào vectơ tách dòng pCRTM2.1 đợc xác định trình tự So sánh trình tự nucleotit vùng preS phân lập Việt Nam với trình tự nucleotit vùng preS công bố Ngân hàng Dữ liệu gien Quốc tế nhận thấy mức độ tơng đồng cao từ 90-97%, đặc biệt với vùng preS Sugauchi F cs công bố [8], kết cho thấy tơng đồng đạt tới 98,94% Vùng preS phân lập đợc thiết kế để biểu tinh để thu nhận protein preS tái tổ hợp, tiến tới tạo Kit chẩn đoán HBV tài liệu tham khảo Ganem, D., Varmus, H E., 1987: Ann Rev Biochem.: 651-693 35 Nguyễn Hữu Hồng, 1993) Bài giảng Vi sinh Y học NXB Y học, Hà Nội Đinh Duy Kháng cs., 1996: Phân lập, tách dòng xác định trình tự gien kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B từ khối U bệnh nhân ung th− gan Kû u ViƯn C«ng nghƯ sinh häc, 20-25 Le Seyec, J P et al., 1998: J Virol., 20522057 Rogers S A., Dienstag, J L., and Liang.T J., 1997: Hepatitis B virus-clinical disease, prevention and therapy in Viral Hepatitis Ed By Willson, R A., New York, 119-146 Sanger F., Niclen S., and A R Coulson, 1977: Proc Natl Acad Sci 74: 5463 WHO-UNICEF Bulletin, 1996: State of the World's Vaccines and Immunization Geneva Sugauchi F., 2000: J Med Virol., 44: 96103 Tiolais P., Pourcal C., Dejean A., 1985: Nature, 317: 489-495 10 Nguyễn Thu Vân, 1991: Tinh khiết kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg) cho việc điều chế sinh phÈm micro- Elisa (Thư nghiƯm miƠn dÞch men) dïng để chẩn đoán HBsAg huyết thanh, huyết tơng ngời Luận án phó tiến sĩ sinh học, Hà Nội 11 Vassileva A et al., 2002: Protein Protein Expr Purif., 21: 71-80 MOLECULAR CLONING AND SEQUENCe OF the preS DOMAIN OF HUMAN HEPATITIS B SURFACE ANTIGEN Dong Van Quyen, Dinh Duy Khang, Yu Gyun Gyu SUMMARY By using nested PCR with specific primers, we have amplified and cloned the preS domain, including 170 nucleotides of the S domain of the hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) from human liver tumor biopsies The sequence of this isolated preS domain was compared with other preS domains from the International Gene Bank Database The identity ranges from 90 to 97% These results suggested that the HBV strain isolated from Vietnamese patient was an adr subtype Ngµy nhËn bµi: 11-7-2002 36 ... thuộc vùng S gien kháng nguyên b mặt virút viêm gan B tõ ADN tỉng sè t¸ch chiÕt tõ khèi u cđa b nh nh©n ung th− gan cã mang ADN cđa virót viêm gan B Vùng preS sau đợc tách dòng vào vectơ tách dòng. .. thực đợc gien m hóa protein b mặt loại nhỏ (gien hbs) có b n vùng trình tự xuyên màng (transmembrane sequence), vùng ức chế biểu gien E coli Vì vậy, để biểu đợc, đ cắt b vùng trình tự xuyên... với trình tự nucleotit vùng preS đợc công b Ngân hàng Dữ liệu gien Quốc tế, khẳng định đ tách dòng thành công vùng preS đoạn gồm 170 nucletotit vùng S gien kháng nguyên b mặt virút viêm gan B